增殖诱导配体基因短发夹RNA慢病毒表达载体的构建

目的 构建针对人的增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligand,APRIL)基因的短发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA)慢病毒表达载体,并在感染293T细胞后检测病毒滴度及适合的感染复数(multiplicity of infection,MOI)值.方法 以人APRIL基因为靶点,筛选出3条shRNA靶序列:shAPRIL1210、shAPRIL1754、shAPRIL1604;各自合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA后分别与经酶切的pGEL-GFP载体连接,构建3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604;将连接产物分别转化到DH5α感受态细胞,经PCR及DNA测序鉴定.再用LV-shAPRIL与包装质粒pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平确定病毒滴度及适合的MOI值.结果 PCR和测序结果与构建的3个慢病毒载体LV-shAPRIL1210、LV-shAPRIL1754、LV-shAPRIL1604的预期结果一致,经包装产生的慢病毒滴度分别为5×107、6×107、4×107转导单位(TU)/ml;适合高效感染的MOI值为5.结论 成功构建人APRIL基因3个慢病毒表达载体LV-shAPRIL,为后继的在相关靶细胞中诱导特异性的APRIL基因沉默奠定基础.     

HA1重组慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建ha1基因慢病毒载体并获得稳定的产毒细胞,为进一步研究异基因造血干细胞移植后ha1介导的GVHD和GVL的分离机制奠定基础。将已构建好的T-ha1质粒酶切获得目的基因后,将目的基因定向克隆入慢病毒表达质粒pRRLSIN、cPPT、PGK/GFP、WPRE,构建含有ha1基因的重组慢病毒载体,经PCR、酶切及测序鉴定其正确性,并将成功构建的pLenti-ha1质粒与包装质粒一起共转染293T细胞,通过实时定量PCR测定病毒滴度。结果表明：含有ha1基因的重组慢病毒载体经PCR、酶切和测序鉴定构建正确,且测定的病毒滴度为2.0×108TU/ml。结论：本研究成功地构建了ha1的慢病毒载体。     

人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

背景:慢病毒载体是一个能够在原代培养的人树突状细胞中进行RNA干扰的有效工具,但目前国内对RNA干扰技术应用于人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子的研究却少有报道.目的:拟构建人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素表达水平提供有利的工具.方法:根据人树突状细胞特异性细胞问黏附分子3结合非整合素基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EeoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生DC-SIGN慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Westem blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列.用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度.结果与结论:PCR扩增和测序结果显示,人树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定两条干扰效率高的有效靶序列.利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL.证实实验成功构建了DC-SIGN基因慢病毒载体.     

解偶联蛋白-2 RNA干扰慢病毒载体的构建

目的:构建解偶联蛋白-2(UCP-2)基因的RNA干扰慢病毒载体.方法:根据RNA干扰序列设计原则,针对UCP-2mRNA(NM_011671)设计3个RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的DNA双链,酶切后连入慢病毒转移质粒pGCL-GFP中.连接产物转化感受态细胞,所获克隆行PCR鉴定和序列测定.构建成功的RNA干扰质粒与UCP-2表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western blot检测UCP-2蛋白表达,筛选出干扰效果最好RNA干扰质粒.将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒pHelper 1.0(gag/pol元件)载体,Helper 2.0(VSVG元件)共转染293T细胞包装成慢病毒并检测滴度.结果:PCR和测序结果显示针对3个靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Western blot检测获得最优干扰靶点,并成功包装成滴度为5×108TU/ml的慢病毒.结论:成功构建可供感染的解偶联蛋白-2 RNA干扰慢病毒载体,为后续靶向抑制该基因表达以提高脂肪肝移植成功率的研究莫定物质基础.     

慢病毒介导人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达

背景:神经营养素3是目前发现的在脊髓损伤修复中作用最强的神经营养因子,它能有效促进再生轴突穿越胶质瘢痕组织,从而修复脊髓损伤.目的:构建含有人神经营养素3基因的重组慢病毒载体(LV-hNT3),观察转染后人神经营养素3基因在许旺细胞中的表达.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-06/2008-03在长海医院中心实验室完成.材料:取新生3 d的SD乳鼠双侧坐骨神经,用于许旺细胞的培养及鉴定;慢病毒三质粒系统pGC-E1-EGFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0为上海吉凯基因化学技术有限公司产品.方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,接着该质粒转化感受态的大肠杆菌E.coli DH5α,通过PCR及基因测序鉴定阳性克隆,再经Lipofectamine 2000将pGC-E1-hNT3-EGFP,pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,按照病毒感染复数=1,4,8,10,12加入预先混好重组病毒完全培养液2 mL,通过增强型绿色荧光蛋白的表达测定收集的病毒滴度.将慢病毒转染许旺细胞,以未经转染的许旺细胞和经空载的慢病毒转染的许旺细胞为对照组.主要观察指标:慢病毒转染许旺细胞后,检测转染效率,通过实时荧光聚合酶链反应和蛋白免疫印迹检测人神经营养素3在许旺细胞中的表达.结果:实验中重组质粒的外源基因序列与GeneBank中的人神经营养素3阅读框架序列完全一致;浓缩后病毒滴度为5×107TU/L,LV-hNT3感染许旺细胞后,许旺细胞发出明亮的绿色荧光,当感染复数=10时转染效率最高达85%,实时荧光PCR检测表明人神经营养素3 mRNA在入神经营养素3-许旺细胞中高效表达,而对照组中未表达,蛋白免疫印迹证实人神经营养素3在许旺细胞中表达.结论:实验构建的含有人神经营养素3基因的慢病毒载体能感染许旺细胞并且高效表达人神经营养素3.     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

目的基因慢病毒载体的构建与包装

目的探讨Oct4,Sox2,c-Myc及Klf4-慢病毒载体的构建与包装。方法从含有Oct4,Sox2,c-Myc及Klf4的质粒中获取目的基因,将目的基因与酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其连接产物转化细菌感受态细胞,对长出的阳性克隆进行测序和比对分析,并对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,通过三质粒系统共转染293T细胞对慢病毒进行包装并进行滴度测定。结果成功构建并包装出Oct4,Sox2,c-Myc及Klf4-慢病毒载体,基因测序结果与目标序列完全一致;PCR鉴定结果显示,4个目的基因均为阳性;Oct4,Sox2,c-Myc及Klf4-慢病毒载体滴度分别为1×109,1×109,1×109,2×109 TU/mL。结论通过三质粒系统可构建并包装Oct4,Sox2,c-Myc及Klf4-慢病毒载体。     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成OligoDNA,退火形成双链DNA,与HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体通过lipofectamineTM2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96h提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NG2的表达。结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011TU/L。Westernblot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%（P〈0.05）。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景:最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。目的:构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。方法:选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成OligoDNA,退火形成双链DNA,与HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体通过lipofectamineTM2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96h提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NG2的表达。结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011TU/L。Westernblot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P<0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

靶向hTERT基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建hTERT 基因RNAi 慢病毒载体,为大肠癌RNAi 介导的基因治疗打下基础.方法 化学合成3 条靶向hTERT 基因的siRNA,转染大肠癌细胞SW480,48 h 后采用RT-PCR 方法筛选出一条对hTERT mRNA 有明显抑制作用的siRNA.针对已经筛选确定的hTERT 基因RNAi 有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ酶切后的GP-Supersilencing Vector 载体[含U6 启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shhTERT 慢病毒载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shhTERT、pGag/Pol、pRev 和pVSV-G 4 质粒共转染包装细胞293T 细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP 蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR 和测序证实,成功构建hTERT shRNA 的慢病毒载体LV-shhTERT.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1 ×108 UT/ml.结论 成功构建了hTERT 基因RNAi 慢病毒载体.     

人神经生长因子重组慢病毒载体构建及检测

目的:构建含神经生长因子(NGF)基因的重组慢病毒载体,并在293T细胞中验证NGF是否可以过表达。方法:将NGF基因克隆至慢病毒穿梭质粒Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP,然后利用酶切鉴定、PCR鉴定及测序验证后,同两个辅助质粒共转染到293T细胞中,构建重组慢病毒载体。重组慢病毒感染293T细胞,通过荧光检测慢病毒的转染效果,用Western Blot检测NGF基因的表达。结果:酶切鉴定、PCR扩增鉴定和对重组慢病毒进行测序,提示重组慢病毒构建正确。荧光显微镜观察重组慢病毒感染的293T细胞,可见强荧光。Western Blot结果提示目的基因可正常表达。RT-PCR测得病毒滴度达到可利用标准。结论:人NGF重组慢病毒载体构建成功。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体。方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景:慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率.目的:构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA 干扰慢病毒载体.方法:针对脯氨酰羟化酶2 基因序列设计RNA 干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP 连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA 干扰慢病毒表达载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.结果与结论:PCR 和DNA 测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA 慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP 载体.说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA 干扰慢病毒载体.     

Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kff2ds4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体，应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4，包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒颗粒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明，PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×10^8TU／ml。结论：成功地构建了人kff2ds4基因RNAi慢病喜载体．     

构建及鉴定人生存素基因的慢病毒表达载体

背景：抑制椎间盘细胞的凋亡可以延缓椎间盘的退变,而生存素具有调节细胞增殖和抗凋亡功能。目的：构建人生存素基因的慢病毒载体。方法：应用全基因合成技术合成人生存素基因（BIRC5）,通过 PCR扩增目的基因并对 PCR 结果进行电泳分析。将目的基因克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒 Lenti-BIRC5。将重组的慢病毒质粒转化细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性的克隆进行基因测序。将含有目的基因的慢病毒质粒转染293T细胞,应用Western blot技术对重组慢病毒载体 Flag-Survivin 融合蛋白的表达进行检测。结果与结论：PCR鉴定及基因测序结果显示成功构建了含有人Survivin基因的慢病毒表达载体,Western blot检测结果显示目的基因在体外培养细胞中转染成功并且过表达。说明慢病毒表达载体Lenti-BIRC5构建成功,这为下一步研究Survivin在人髓核细胞中的抗凋亡作用提供了载体。     

人神经生长因子β亚基慢病毒载体的构建

背景：糖尿病神经源性膀胱的发病与神经生长因子缺乏有关,β亚基是构成神经生长因子（NGF）3种亚基中惟一具有生物活性的亚基,慢病毒载体是基因治疗的理想载体。目的：构建过表达人神经生长因子β亚基（β-NGF）基因的慢病毒载体。方法：通过目的基因的获得,载体质粒双酶切,载体质粒与目的基因的连接将人β-NGF基因克隆到慢病毒载体质粒pGC-FU中,构建重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF。观察人β-NGF基因的克隆情况,并进行重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF的PCR鉴定和测序。结果与结论：构建的重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF进行PCR实际获得的产物与预计PCR产物大小一致,即初步判断为构建成功的重组质粒。所获得的β-NGF基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。说明pGC-FU-β-NGF中携带有正确的β-NGF基因。结果证实,实验成功构建了携带人β-NGF基因的重组慢病毒载体质粒。     

人神经生长因子β亚基慢病毒载体的构建

背景:糖尿病神经源性膀胱的发病与神经生长因子缺乏有关,β亚基是构成神经生长因子(NGF)3种亚基中惟一具有生物活性的亚基,慢病毒载体是基因治疗的理想载体。目的:构建过表达人神经生长因子β亚基(β-NGF)基因的慢病毒载体。方法:通过目的基因的获得,载体质粒双酶切,载体质粒与目的基因的连接将人β-NGF基因克隆到慢病毒载体质粒pGC-FU中,构建重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF。观察人β-NGF基因的克隆情况,并进行重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF的PCR鉴定和测序。结果与结论:构建的重组慢病毒载体质粒pGC-FU-β-NGF进行PCR实际获得的产物与预计PCR产物大小一致,即初步判断为构建成功的重组质粒。所获得的β-NGF基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。说明pGC-FU-β-NGF中携带有正确的β-NGF基因。结果证实,实验成功构建了携带人β-NGF基因的重组慢病毒载体质粒。     

RPS14基NRNAi慢病毒载体构建及在SKM-1细胞中的表达

背景：有研究表明,造血干／祖细胞内RPSl4表达减少可导致造血细胞病态造血,尤其是向红系分化受阻,提示RPS14的正常表达有助于维持机体的正常造血。目的：构建RPSl4基因HRNAi慢病毒载体,并观察该基因在人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞中的表达。方法：针对已经筛选确定的RPSl4基因RNAi有效靶序列,构建GC-shRPSl4慢病毒载体并测序鉴定。用GC-shRPS14、pHelper1．0载体和pHelper2．0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度：并将获得的RPSl4shRNA慢病毒载体GC-shRPSl4转染人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1,用WestemBlot检测靶细胞内RPSl4蛋白的表达。结果与结论：经测序证实,构建出了了RPSl4shRNA的慢病毒载体GC-shRPS14。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×10^9TU／mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为75％,WesternBlot检测到转染后RPS14在靶细胞中表达明显被抑制。说明成功构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,转染人SKM-1细胞株后RPSl4蛋白表达沉默。     

人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建

背景：KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法：聚合酶链反应扩增（PCR）目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH—KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT—PCR检测KLF4mRNA的表达。结果与结论：重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。