猪囊尾蚴抗原-B基因cDNA编码区的克隆

[目的 ]扩增和克隆猪带绦虫囊尾蚴 Ag B基因的 c DNA编码区。 [方法 ]提取猪囊尾蚴总 RNA中 ,利用 RT- PCR技术扩增出 Ag B基因 c DNA编码区 ,然后将其克隆到载体 p UC118中进行序列分析。 [结果 ]PCR反应产物为单一条带 ,大小为 2 .6 kb。测序结果与澳大利亚株猪囊尾蚴 Ag B序列有 99.8%的同源性 ,二者的氨基酸序列有 99.3%的同源性。 [结论 ]成功地克隆了猪囊尾蚴 Ag B基因 c DNA编码区。     

中国南方株庚型肝炎病毒5′端非翻译区基因的分子克隆及序列…

目的：分析我国华南地区庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）５′端非翻译区（５′ＵＴＲ）基因序列及非甲一戊型肝炎病人中ＨＧＶ感染情况。方法：在ＨＧＶ ５′ＵＴＲ设计引物，采用逆转录一套式聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测ＨＧＶＲＮＡ，对扩增产物进行分子克隆，以荧光法（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）测序。结果：６３例非甲一戊型肝炎病中６例ＨＧＶＲＮＡ阳性（９．５％）对其中一株输血后ＨＧＶ（Ｃｈ－Ｓ）５′ＵＴＲ核     

丙型肝炎病毒5''端非编码区的5''端序列对其翻译启动活性的影响

目的分析丙型肝炎病毒(HCV)5’端非编码区(5’NCR)的5’端序列对其翻译启动活性的影响。方法用PCR技术扩增获得全长和5’端17个碱基缺失的HCV5’NCR片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2Control的SEAP基因上游,分别构建成全长和5’端截短的HCV5’NCR调控SEAP表达的重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP。用脂质体方法将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,并用化学发光法检测SEAP的表达。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pNCRSEAP和pdNCRSEAP构建成功。表达的发光强度分别为390482±42856和635265±52285RLU,二者有差异显著性(P<0.01)。结论HCV5’NCR的5’端碱基缺失提高了它对SEAP基因的翻译启动活性,为进一步分析HCVIRES的结构提供了实验基础。     

庚型肝炎病毒广东株与云南株5‘端非编码区的比较

目的：明了中国不同地区（包括广东与云南）庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）株５’端非编码序列的差异。方法；采用逆转录聚合酶链反应扩增ＨＧＶ ５‘ ＮＣＲ ｃＤＮＡ片段，产物为２３８ｂｐ，纯化后直接测定苷酸序列。结果：ＨＧＶ广东株与云南株５’ＮＣＲ的同源性为９６．９７％，他们与国外株的同源性几乎８６．３６％￣９０．９１％，结论；Ｙ朱与云南株５‘ＮＣＲ的同源性较大，与国外分离株的同源性较小，不同碱基在序列中呈散在     

SEN-V非编码区基因的克隆与序列分析

自 1997年Ｎｉｓｈｉｚａｗａ发现输血传播病毒 (ＴＴＶ)后 ,认为与非甲 庚型肝炎有关 ,但随着进一步的研究发现ＴＴＶ与 (ＴＬＭＶ)作为肝炎病因 ,即使存在 ,也非常有限。最近 ,又发现了一种新的与ＴＴＶ相似的小ＤＮＡ病毒ＳＥＮ病毒[1] ,对此研究较多的是ＳＥＮＶ Ｄ和ＳＥＮＶ Ｃ/Ｈ ,它们与输血后非甲 庚型肝炎关系较密切 ,有报道急性输血后非甲 庚型肝炎中的ＳＥＮ Ｖ阳性高达 92 % ,但对其他人群的研究表明不到 6 %的ＳＥＮ Ｖ感染与肝炎有关。关于ＳＥＮ Ｖ的临床意义及其与非甲 庚型肝炎的关系目前尚不清楚。我们根据Ｔａｋｅｊｉ…     

大鼠Pten和Runx3基因5’端非编码区序列的生物信息学分析

目的分析大鼠Pten和Runx3基因5’端非编码区（5’-UTR）序列的CpG岛、启动子及其转录因子结合位点。方法通过NCBI获得大鼠Pten和Runx3基因全长序列及转录本,采用Blast中的可读框比对外显子、内显子及上游5’-UTR信息,所获得ATG上游2kb、下游1kb序列分别应用CpGislandsearcher软件、CpGPlot工具、Methprimer2．0工具预测CpG岛,NNPP工具、Promoterscan工具、FirstEF工具预测启动子,Madspector、Match、Con—site预测启动子区域转录结合位点。结果大鼠Pten基因和Runx3基因属于CpG岛关联基因,启动子可能分别位于-1253～-684bp和-690～-121bp,Pten和Runx3基因在109和94种转录因子结合位点中,被≥2种软件共同预测有结合位点的转录因子分别有6和9种。结论初步获得大鼠Pten和Runx3基因5’-UTR序列的生物学信息,为进一步基因调控甲基化实验验证奠定了基础。     

食管癌Mal基因5′调控区的克隆及序列分析

目的：探讨Mal基因在人食管癌中表达下调的机制。方法Mal基因5′调控区是一高G＋C含量的区域,总G＋C含量占67．08％（487／726个）,经优于PCR反应条件扩增正常胎盘组织和人食管癌细胞系EC9706、EC8712、EC109的Mal基因5′端调控区,对PCR产物进行克隆和序列测定,对测序结果进行相比比较,结果：成功地扩增出Mal基因5′调控区。与正常胎盘组织相比,食管癌细胞系EC9706,EC8712、EC109均有Mal基因5′调控区第654位的T→C改变,相应的密友子TCC变为CCC,所编码的氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸;EC9706还有第657位的T→C改变,相应的密码子TGC变为CGC,所编码的氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸;EC8712有第139位的A→G改变,相应的密码子GGA变为GGG,所编码的甘氨酸仍为甘氨酸。结论：建立了Mal基因5′调控区的PCR扩增方法;食管癌Mal基因5′调控区可能存在点突变。     

丙型肝炎病毒5′端非编码区和NS3蛋白酶共调控外分泌性碱性磷酸酶表达细胞模型的建立及意义

目的构建丙型肝炎病毒5′端非编码区(HCV 5′NCR)和NS3丝氨酸蛋白酶共调控外分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达细胞模型,并分析其用于抗HCV药物筛选和评价的可行性.方法用聚合酶链反应技术扩增HCV 5′NCR和NS3/4A片段,定向克隆至表达质粒pSEAP2-Control的SEAP基因上游,构建含HCV 5′NCR-NS3/4A-SEAP嵌合基因的重组表达质粒pNCR-NS3/4A-SEAP.将重组质粒转染至肝细胞株QSG7701,用化学发光法检测SEAP的表达,并观察HCV 5′NCR区对应的反义寡聚核苷酸(ASODN)和丝氨酸蛋白酶抑制剂TPCK对SEAP表达的影响.结果重组质粒pNCR-NS3/4A-SEAP有高强度SEAP表达,5 μmol/L、10 μmol/L ASODN和100μmol/L TPCK对SEAP表达有显著抑制作用(f值分别为4.315、6.985、6.949,P值均＜0.01).结论重组质粒pNCR-NS3/4A-SEAP的SEAP表达受HCV 5′NCR和NS 3蛋白酶共调控,建立的细胞模型可用于以H CV 5′NCR和NS 3蛋白酶为靶位点的药物筛选和评价.     

囊虫病诊断用抗原编码cDNA的分子克隆

目的 :克隆与分析囊虫病诊断用抗原及其编码基因。方法 :采用基因重组技术 ,构建来源于猪囊尾蚴 m RNA的 c DNA文库。以囊虫病患者、囊虫病病猪的血清为探针从 c DNA文库中筛选出目的克隆。结果 :获得人、猪共同抗原 2个 (分子量分别为 2 8k Da和 18k Da) ,人特异性抗原和猪特异性抗原各 1个 (分子量为 34 k Da、 14k Da)。这些抗原的编码克隆分别命名为λc C1、λc C2、λc H1及 λc P1。c C1c DNA含有编码 2 8k Da的人、猪共同抗原的完整基因 ,全长 10 70 bp,起始密码 ( ATG)从自 2 2 bp,终止密码 ( TGA)结于 74 7bp,长为 74 7bp的开放阅读框架编码由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,其理论推导分子量为 2 7.36k Da。结论 :以 c C1等融合蛋白为诊断用抗原 ,具有高度的特异性和较理想的敏感性。     

甲型肝炎病毒编码区cDNA在减毒伤寒杆菌中的高效表达

使直炎病毒基因组ｃＤＮＡ能够在减毒伤寒杆菌中表达,从而通过口服此种减毒伤寒杆菌达到对甲肝免疫的作用。将甲肝病毒编码区ｃＤＮＡ插入高效表达质粒ＰＢＶ２２１,转化大肠缜菌ＤＨ５α,筛选并鉴定阳性克隆。将阳性克隆脾电转移法转化减毒的伤寒杆菌ＢＲＤ５０９。用温度诱导法诱导目的基因在伤寒杆菌中表达。通过ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ和ＥＬＳＡ检测表明,表达蛋白可与人抗甲肝ＩｇＧ发生特异性反应。用此伤寒杆菌口服或腹腔     

中华按蚊抗菌肽defensinA编码基因cDNA克隆与序列分析

目的克隆中华按蚊defensin编码基因，并对其序列进行分析。方法提取中华按蚊总RNA。据文献报道合成1对引物deft、def2，RTPCR扩增中华按蚊defensin编码基因，克隆于T-载体，序列测定与分析。结果RT—PCR扩增中华按蚊cDNA获大约308bp片段，测定目的片段序列，结果显示，克隆基因cDNA序列长度为308bp，推导编码64个氨基酸，序列分析显示中华按蚊defensin编码基因与冈比亚按蚊defensin编码基因有高度同源性（95％）。分析结果显示，中华按蚊defensin编码基因为新基因，定名为中华按蚊defensinA。结论克隆出中华按蚊defensinA编码基因，为进一步研究该基因打下了基础。     

中华按蚊抗菌肽defensinA编码基因cDNA克隆与序列分析

目的克隆中华按蚊defensin编码基因,并对其序列进行分析。方法提取中华按蚊总RNA。据文献报道合成1对引物def1、def2,RT-PCR扩增中华按蚊defensin编码基因,克隆于T-载体,序列测定与分析。结果RT-PCR扩增中华按蚊cDNA获大约308 bp片段,测定目的片段序列,结果显示,克隆基因cDNA序列长度为308 bp,推导编码64个氨基酸,序列分析显示中华按蚊defensin编码基因与冈比亚按蚊defensin编码基因有高度同源性(95%)。分析结果显示,中华按蚊defensin编码基因为新基因,定名为中华按蚊defensinA。结论克隆出中华按蚊defensinA编码基因,为进一步研究该基因打下了基础。     

丙型肝炎病毒NS5b区与5'-非编码区不同基因区RNA检测结果的比较

为探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ５ｂ区与５’－非编码区（５’－ＮＣＲ）不同基因区ＲＮＡ检测结果的区别及临床应用价值。利用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测１４８例肝炎患者血清ＨＣＶ ＮＳ ５ｂ基因的ｃＤＮＡ,并与５’－ＮＣＲ基因区ｃＤＮＡ检测技术进行了比较。结果 ＨＣＶ ＮＳ ５ｂ基因区ＲＮＡ检出率为２４．３％（３４／１４８）,５’－ＮＣＲ基因区ＲＮＡ检出率为３１．１％（４７／１４８）。Ｈ     

丙型肝炎病毒5''-非编码区与NS 5b区酶切分型对比研究

探讨北京与河南地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况以及HCV5’—NCR和HCV NS5b两区域分型结果之间的差异。对56例慢性丙型肝炎和80例有偿供血员的HCV RNA阳性血清，同时进行HCV5’—NCR和HCV NS5b酶切分型研究。HCV5’—NCR和HCV NS5b两区域的Ⅱ／1b型感染率北京地区分别占85．7％和87．5％，河南地区分别占68．8％和70．0％。HCV Ⅱ／1b型为北京和河南地区HCV感染的优势株，同时HCV5’—NCR和HCV NS5b区酶切分型结果问具有良好的相互对应关系。     

丙型肝炎病毒5′非翻译区 DNA 序列在 HepG2细胞中的启动子活性

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因组5′非翻译区(5′UTR)DNA 序列在 HepG2细胞中 的启动子活性，以了解 HCV 的复制调控机制。方法 分别构建 HCV 基因组5′UTR DNA 正反向序列驱动 虫荧光素酶基因表达的质粒5′UTR-Luc(+)/(-)和5′UTR DNA 序列驱动绿色荧光蛋白基因表达的质粒5′ UTR-EGFP(+)/(-)，分别转染 HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平，逆转录 聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因 m R N A 水平，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达水平，并与相应 对照作比较，来证实 HCV 基因组5′UTR DNA 序列的启动子活性。结果 5′UTR-Luc(+)有明显的虫 荧光素酶表达，但比 pGL3 control 表达水平低(Luc/R为0．690±0．086，Luc/RL 为4．210±0．340)，而5 ′UTR-Luc(-)和 pGL3 enhancer 无明显虫荧光素酶表达(Luc/RL 分别为0．095±0．008和0．044±0． 005)；逆转录聚合酶链反应结果与之相符，5′UTR-Luc(+)检测到虫荧光素酶基因 mRNA，而5′UTR- Luc(-)则未检测到。5′UTR-EGFP(+)观察到较强绿色荧光，而5′UTR-EGFP(-)无荧光表达。 结论 HCV 基因组5′U TR DNA 序列具有明显的启动子活性，能启动下游基因的表达，在 HCV 基因组复 制过程中有重要作用。     

编码巴西利什曼原虫组蛋白H1 cDNA的克隆及分子特性分析

在真核生物中组蛋白是能与 DNA结合构建染色质核小体的结构蛋白。组蛋白家族中 H3和 H4最保守 ,而 H2 A、H2 B,特别 H1变化最大。有报道说利什曼原虫的 H1可能与染色质的浓缩有关。作者从巴西利什曼原虫 MHON/ PE/95/ LQ8前鞭毛体 c DNA表达文库中筛选出H1 c DNA克隆 ,所用的探针是编码巴西利什曼原虫 L 6核糖体蛋白的一段 DNA序列 ,因为 L6和真核细胞的 H1的氨基酸序列相似。序列分析表明 c DNA克隆为 81 6个核苷酸 ,5′端有巴西利什曼原虫的剪切前导序列 ,3′端有 1 4个残基的 poly( A)尾结构。推测的氨基酸序列表明存在一…     

脱氧核酶在转基因肝癌细胞中对HCV 5''-非编码区的抑制活性

目的　观察特异性脱氧核酶 (DRz)在丙型肝炎病毒 (HCV) 5′ 非编码区 (5′ NCR)转基因肝癌细胞株中对靶RNA的抑制活性。方法　采用 5′ GGCTAGCTACAACGA 3′基序为活性中心 ,分析HCV 5′ NCR中符合 5′…R↓Y… 3′(R =A/G ,Y =U/C)特征的位点及 5′ NCR的二级结构以确定靶位 ,设计并合成HCV靶向性脱氧核酶DRz 2 32、DRz 12 7、DRz 84、DRz1以及对应的两端被硫代修饰的DRz(TDRz)和活性中心区人工突变的硫代DRz(MDRz)。用脂质体转染法将导入HCV 5′ NCR及部分C区 (5′ NCR C)的转基因肝癌细胞株HepG2 .970 6 中 ,作用一定时间后 ,用化学发光法检测荧光素酶活性的变化 ,计算抑制率。选择抑制率较高者进行时效关系的观察和不同浓度抑制效果的比较。结果　各DRz和对应TDRz的活性无明显差别。DRz 12 7/TDRz 12 7和DRz1/TDRz1的抑制活性相对较高 ,终浓度为 0 .5 μmol/L作用 2 4h抑制率分别达 5 3.2 % / 5 0 .6 %和 4 4 .7% / 4 3.3%。各DRz/TDRz的抑制率均高于对应的MDRz ,其中DRz 12 7/TDRz 12 7与MDRz 12 7(4 1.2 % )相比抑制率有显著性差异 ,P <0 .0 5。在 0 .2 5～ 0 .75 μmol/L范围 ,抑制率随药物浓度的升高而增高。在所观察的时间点中 ,加药后 2 4h抑制率最高 ,3d后抑制率显著下降 ;DRz抑制率的下降快