神经干细胞与骨髓间充质干细胞混合培养的实验研究

目的 探讨神经干细胞与骨髓间充质干细胞混合培养对神经干细胞分化为神经元的影响.方法 将纯化的神经干细胞和骨髓间充质干细胞混合培养,观察神经干细胞的分化状态,应用免疫细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定.结果 共培养组中36.35%±4.63%的细胞表达神经元特异性蛋白NSE,明显高于对照组中12.78%±6.91%的表达率.结论 骨髓间充质干细胞能提高神经干细胞分化为神经元的比例,还能延长神经元的存活时间.     

骨髓间充质干细胞的三维培养

目的：研究三维培养环境下骨髓间充质干细胞的生长情况,探讨骨髓间充质干细胞复合支架构建组织工程软骨的可行性。方法：全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）,免疫细胞化学测定其细胞表面抗原CD44、CD45,对BMSCs进行鉴定;冻干法制备壳聚糖（Chitosan,CS）支架,扫描电镜观测支架孔径;取BMSCs复合CS支架,通过三维培养观察BMSCs在CS支架上不同时段的生长情况。结果：三维培养环境下骨髓间充质干细胞生长良好,细胞在支架上分泌大量细胞外基质,并与支架黏附良好。结论：骨髓间充质干细胞可作为组织工程的种子细胞,构建组织工程软骨。     

新生鼠体外神经干细胞培养、分化及鉴定

目的 探索新生SD大鼠神经干细胞体外分离培养基鉴定的方法。方法 分离新生SD大鼠海马组织, 无血清培养技术培养神经干细胞, 免疫组织化学技术检测其巢蛋白的表达;并用溴脱氧尿嘧啶核苷掺入试验, 免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况;诱导神经干细胞分化, 分别用神经元特异性烯醇化酶抗体和胶质纤维酸性蛋白抗体进行免疫组织化学技术鉴定分化细胞。结果 获得大量悬浮生长的单克隆神经球, 并可以分化为神经元和星形胶质细胞。结论 成功培养的新生SD大鼠神经干细胞具有增殖、自我更新和多分化潜能, 为体外基础和临床研究奠定基础。     

肿瘤干细胞标志物巢蛋白和CD133在卵巢癌中的表达及临床意义

目的 探讨卵巢癌中肿瘤干细胞标志物巢蛋白（Nestin）和CD133表达水平及与临床病理参数、预后的相关性.方法 采用免疫组织化学方法检测145例卵巢癌和37例癌旁正常卵巢组织中Nestin和CD133的表达情况.结果 卵巢癌组织中Nestin、CD133表达阳性率分别为39.3％（57/145）、33.8％（49/145）,癌旁正常卵巢组织中Nestin、CD133表达阳性率分别为8.1％（3/37）、0,两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）;在卵巢癌组织中,Nestin、CD133表达水平与患者年龄、病理类型无关,而与患者组织学分级和临床分期相关,低分化和Ⅲ～Ⅳ期患者中Nestin、CD133表达水平显著增高;Nestin表达与化疗耐药相关,CD133表达与化疗耐药无相关性.结论 肿瘤干细胞标志物Nestin和CD133在卵巢正常细胞向恶性细胞转化的过程中可能扮演了重要角色,检侧其在卵巢癌组织中的表达情况有助于预测肿瘤的生物学行为.     

体外诱导兔胚胎干细胞分化为神经细胞

目的:探讨体外诱导兔胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的方法。方法:应用多种诱导剂联合诱导兔ESCs,免疫荧光和流式细胞仪检测巢蛋白(Nestin)的表达。结果:诱导后兔ESCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,Nestin阳性表达。结论:在体外采用定向分化诱导,兔ESCs可直接定向分化为神经干细胞。     

大鼠胚胎脑新皮质神经干细胞的体外分离培养方法研究

目的建立大鼠胚胎脑新皮质神经干细胞的体外分离培养方法。方法从孕14天SD大鼠胚胎脑分离新皮质,通过机械吹打改善细胞分散状态、优化无血清培养基条件,从而改进神经干细胞的培养方法。利用神经干细胞标志蛋白(nestin和SOX2)、增殖和克隆成球能力以及多向分化能力测试三方面对神经干细胞进行鉴定。结果以该法培养的神经干细胞nestin蛋白呈强阳性表达,SOX2阳性表达率达99%以上,BrdU掺入阳性,培养3天后细胞量为接种量的10.55倍,6日克隆成球率为(33.00±4.40)%。经相应特异性标志蛋白检测证实神经干细胞经诱导分化后可形成神经元(MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(O4)。结论获得的神经干细胞纯度和细胞产出率高,具有强自我更新和多向分化能力。     

补肾法诱导间充质干细胞向神经方向分化研究

目的　在干细胞具先天之精属性新理论指导下 ,探讨补肾中药龟板对间充质干细胞的体外诱导作用。方法　体外分离培养间充质干细胞 ,以龟板水煎液对其进行体外诱导 ,免疫组化鉴定NSE、Nestin、GFAP等标志。结果　龟板可体外诱导间充质干细胞转分化为神经干细胞 ,但还没有被诱导为神经元样细胞与星形胶质细胞。结论　补肾法可促进干细胞之间的相互转换 ,初步验证了干细胞具先天之精属性新理论。     

大鼠脂肪干细胞的分离培养及向软骨表型分化的实验研究

目的探讨从大鼠的脂肪组织中分离、培养脂肪干细胞（ADSCs）并定向诱导分化为软骨细胞的可行性。方法取Wistar雄性大鼠脂肪组织培养,传代。并用免疫荧光法检测传代ADSCs表面抗原CD29表达。取第3代ADSCs用含有TGF－β4,的培养基定向诱导培养,行Ⅱ型胶原免疫组化染色进行检测鉴定。结果显微镜下可见脂肪干细胞的形态特点。并经免疫荧光法进行检测证实。定向诱导ADSCs向软骨细胞分化,观察细胞形态变化,并通过Ⅱ型胶原免疫组化检测,证实向表达II型胶原的软骨细胞表型分化的可行性。结论证实大鼠脂肪组织中存在干细胞来源细胞。并且细胞在体外培养条件下生物学性状保持稳定。通过外源性转化生长因子TGF－β定向分化、诱导、培养可表现出软骨细胞的部分特性。证实脂肪干细胞具有向软骨细胞定向分化的能力。     

硒化合物对大鼠神经干细胞球分化成熟蛋白表达的影响

[目的]观察微量元素硒对神经干细胞分化成熟的影响。[方法]利用新生大鼠神经干细胞体外培养技术、小盖玻片培养法和免疫细胞化学方法，观察了无机硒(亚硒酸钠)和有机硒(硒甲基半胱氨酸)对神经干细胞向神经元分化标记蛋白NSE、星形胶质细胞分化标记蛋白GFAP、少突胶质细胞分化标记蛋白CNPase的表达状况，同时用Westem-blot免疫印迹技术对神经元特异性烯醇化酶(neuron speeific enolase，NSE)、β-微管蛋白(β-tubulin)、星形胶质细胞-醋酸纤维蛋白(glial fibrillary acidhc protein，GFAP)、环核苷酸-3’磷酸水解酶(2’，3’-cyclic nucleotide 3’phosphohydrolase，CNPase)进行了半定量分析。[结果]适量浓度的硒对神经干细胞球的分化发育有良好的促进作用。在含硒的营养液中神经干细胞分化好、形态正常。神经干细胞向神经元、神经胶质细胞方向分化比例较高。其中胶质细胞分化方向GFAP 和CNPase 细胞计数，平均每高倍视野分别为5～6个和7～12个；并且分支多、细长，网络复杂。免疫印记结果发现有机硒能明显促进神经干细胞分化成熟蛋白NSE、β-tubulin、GFAP、CNPase的表达，化学发光显影明显高于对照组。[结论]适量的硒能促进神经干细胞的分化成熟。特别是硒甲基半胱氨酸是一个低毒和高生物效应的硒营养制剂．在神经干细胞球体外分化发育中有着重要的作用。     

全反式视黄酸在骨髓间充质干细胞向神经元分化中的作用研究

目的:探讨全反式视黄酸(ATRA)在骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元分化中的作用及机制。方法:大鼠MSCs在体外培养5～7代后,用0.5μmol/L的ATRA预诱导24h,再换用改良的神经细胞培养基(MNM)作用18h;对照组不用ATRA预诱导,直接用MNM培养。免疫组化检测不同组别巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元特异性核心抗原(NeuN)和微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达情况;ATRA作用前后检测细胞增殖周期和视黄酸受体β(RARβ)的变化。结果:1.ATRA预诱导组巢蛋白、NSE、NeuN和MAP-2的阳性比例明显高于对照组。2.ATRA作用前后,MSCs细胞增殖周期无明显改变。3.MSCs不表达RARβ,用ATRA预诱导细胞后,RARβ表达增加,阳性比例为(20.3±4.2)%。结论:ATRA可能通过RARβ介导靶基因的转录,促进MSCs向神经元分化。     

壳聚糖-丝素复合支架材料与骨髓间充质干细胞相容性的研究

目的:探讨壳聚糖-丝素复合支架材料与骨髓间充质干细胞(BMSCs)的细胞相容性。方法:冻干法制备壳聚糖-丝素共混多孔支架,其孔径在100μm～160μm之间,孔隙率为84.2%。将骨髓间充质干细胞与支架复合进行体外培养。倒置相差显微镜与扫描电镜观察BMSCs细胞与支架复合生长、基质形成以及细胞与支架结合的情况,计算细胞黏附率。并于培养2 d、4 d、6 d、8 d、10 d后,用MTT法检测细胞增殖率情况。以不加支架只接种细胞为对照组。结果:BM-SCs在壳聚糖-丝素支架上培养24 h时的黏附率达94.3%,表明具有良好的黏附作用。MTT法检测结果表明BMSCs在壳聚糖-丝素支架上能良好地生长、增殖,细胞生长曲线相似于对照组。相对于对照组,实验组的相对增殖率在86.1%～98.2%之间。倒置相差显微镜及扫描电镜观察显示BMSCs在壳聚糖-丝素支架上能良好地生长、增殖及分泌基质,以及维持细胞的正常形态。结论:壳聚糖-丝素支架与骨髓间充质干细胞具有良好的细胞相容性,壳聚糖-丝素复合支架是一种很有潜力的组织工程支架材料。     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的优化

目的探索脐血来源的间充质干细胞体外分离培养的更优方法。方法无菌条件下抽取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。50份脐血分为对照组和改良组,每组25份,分别以1.5×10^7/ml的细胞密度接种于25 cm^2培养瓶中。对照组贴壁3 d后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液;改良组贴壁0.5 h后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液。结果对照组杂细胞较多,最终成功培养出8份脐血间充质干细胞;改良组杂细胞较少,最终成功培养出18份脐血间充质干细胞。经流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,所培养出的脐血间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论采取脐血单个核细胞贴壁0.5 h弃上清更换新鲜培养液可以明显提高脐血间充质干细胞的培养成功率,其结果优于脐血单个核细胞贴壁3 d弃上清更换新鲜培养液。     

脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的观察脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法抽取骨髓穿刺液10ml,采用含10％脐带血清的DMEM／F12培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系诱导BM—MSCs定向分化。结果BM—MSC—Ss高表达CD29、CD73、CD105,不表达CD34、CIM5、CD31,BM—MSCs体外能诱导为成骨细胞和脂肪细胞。结论脐带血清培养的BM—MSCs的具有较高的纯度和体外分化能力,脐带血清培养BM—MSCs适合临床应用。     

体外诱导月经血间充质干细胞分化为成肌细胞

目的探讨月经血间充质干细胞在体外可否分化为成肌细胞。方法提取并用10%FBS的DMEM培养液培养人月经血间充质干细胞和SD大鼠的肌卫星细胞;诱导组用肌卫星细胞培养的上清液和5-氮杂胞甙对月经血间充质干细胞进行诱导,对照组用10%FBS的DMEM培养液培养细胞;诱导后,用免疫荧光和RT-PCR方法检测成肌细胞标记蛋白Pax7蛋白和mRNA的表达。结果经免疫荧光检测,诱导组细胞Pax7阳性率为80.36%,与对照组比较,具有统计学意义(F=15.237,P=0.000 1);经RT-PCR检测,诱导组与对照组比较,Pax7基因呈现具有统计学意义的阳性表达(F=14.339,P=0.000 1)。结论月经血间充质干细胞在体外可分化为成肌细胞。     

人羊膜间充质干细胞体外传代培养对染色体核型的影响

目的:分离培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)并进行体外长期传代培养,通过对连续传代的细胞形态、膜表面标志、增殖、分化特性以及染色体核型进行研究,以观察体外培养对该细胞的影响,为其储备和临床应用提供实验依据。方法:无菌条件下从新鲜人胎盘组织分离羊膜,采用组织贴壁法分离培养hAMSCs,并对原代细胞～P11代细胞利用流式细胞技术检测其膜表面标志物;取P3～P4代细胞向神经细胞和成骨细胞诱导,免疫组化染色、PCR检测基因表达情况;采用染色体G显带法制备染色体核型。结果:hAMSCs形态似长梭型,呈流水状生长,细胞活性高,冻存复苏后仍能保持正常形态,并可在体外稳定扩增,细胞生长曲线呈"S"型;细胞高表达CD90、CD73、CD44、CD105;细胞经诱导后可以向神经细胞和成骨细胞分化,神经元特异性烯醇化酶和成骨细胞矿化结节检测为阳性,PCR检测巢蛋白和骨桥蛋白基因表达为阳性;P3～P10代的hAMSCs染色体核型均为正常二倍体核型。结论:hAMSCs在体外经数代培养后能保持间充质干细胞的外显和遗传特性,并且未见染色体核型异常改变。     

间充质干细胞向肝细胞分化研究

目的探讨间充质干细胞在体外诱导分化为肝细胞后,细胞增殖能力和免疫抑制能力等干细胞生物学的改变。方法间充质干细胞在体外进行向肝细胞诱导分化培养,分化为具有部分成熟肝细胞功能的肝细胞样细胞,并对这些肝细胞样细胞继续培养。流式细胞仪检测细胞表型,BrdU法检测细胞增殖能力,与CD4⁺T淋巴细胞共孵育实验检测细胞免疫抑制实验。结果间充质干细胞分化为肝细胞后,虽然具备了部分成熟肝细胞的功能,亦丧失了间充质干细胞本身的一些特性;BrdU法测增值能力,其OD值从1.859±0.117降到1.24±0.103,抑制CD4+T细胞激活的能力从94.8%(100%-5.2%)降到68.8%(100%-31.2%)等;而且分化后的细胞处于不稳定的分化状态,继续培养后,其细胞生物学相关特性和功能均出现去分化的现象,比如增殖能力恢复到OD值为1.501±0.229,免疫抑制能力恢复到81.8%(100%-18.2%)。这种不稳定的状态,进入体内后,是否会增加突变或致癌的概率,仍需进一步的研究。结论间充质干细胞比其向肝细胞诱导分化后的细胞更具安全性,更适合肝病治疗。     

骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内定植研究

目的：观察骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内的定植情况。方法：选择健康SD大鼠34只,按随机数字表法分为MSCs干预组（A组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注MSC 1×106个/mL）,肺气肿模型组（B组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注等体积PBS）及MSC对照组（C组,10只,正常大鼠,尾静脉输注MSCs 1×106个/mL）,正常对照组（D组,4只,正常大鼠,尾静脉输注等体积PBS）,采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠来源的MSCs,经GFP标记细胞后将其经尾静脉注入肺气肿模型SD大鼠体内,24 h内处死大鼠,取肺组织迅速冰冻切片,共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。结果：成功培养具有分化潜能的骨髓间充质干细胞,MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志,仅有0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型;成功复制大鼠肺气肿模型,香烟烟雾暴露组（A、B组）平均肺泡间隔为（119.0±26.2）μm,高于对照组（C、D组）的（89.8±17.3）μm,差异有统计学意义（P〈0.05）;平均肺泡数为（173.9±68.3）个/mm2低于对照组的（280.3±104.0）个/mm2,差异有统计学意义（P〈0.05）;显微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后可见A组大鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs,而B组、C组及D组均未见转染荧光。结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入后可在肺气肿模型大鼠肺内定植,为MSCs治疗慢阻肺可能提供理论依据。     

诱导分化骨髓干细胞（MSCs）构建膀胱的实验研究

目的分离提起大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过组织工程技术．构建组织构建膀胱,为进一步临床应用奠定基础。方法将sD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,以生长状态良好的骨髓问充质干细胞接种于制备好的聚乳酸一聚乙醇酸支架上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程构建膀胱。结果体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好,传代扩增容易,骨髓间充质干细胞在聚乳酸一聚乙醇酸基质中生长良好,可体外构建组织工程膀胱。结论通过利用体外扩增培养的骨髓问充质干细胞制备的上皮细胞可以体外聚乳酸一聚乙醇酸支架构建组织工程膀胱。     

AAV介导NGF过表达载体转染BMSCs对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型保护作用

目的干细胞是当前研究的热门领域,利用干细胞定向分化作用可以促进神经损伤修复,但是干细胞具有分化方向不定和易老化的特点。本研究探究腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)介导神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对高强度聚焦超声致活体SD大鼠坐骨神经损伤模型的保护作用。方法分离和培养人源BMSCs,采用流式细胞仪检测BMSCs的CD29,CD45和CD90等表面蛋白表达。采用免疫组织化学染色鉴定BMSCs表面CD34和CD44表达。AAV腺病毒构建NGF过表达质粒,通过高强度聚焦超声制备SD大鼠坐骨神经损伤模型,根据处理方式不同,将SD大鼠分成空白对照组,模型组,BMSCs组和NGF过表达组。利用HE染色,电镜方法观察坐骨神经形态,示踪金染色观察神经接头的聚集,TUNEL染色检测细胞凋亡,RT-qPCR检测NGF和caspase-3mRNA表达。结果流式细胞仪检测第2代BMSCs表面蛋白,CD29阳性率为98.03%,CD90阳性率为96.92%,CD45阴性率为77.2%,共表达CD29、CD90且CD45表达阴性的细胞数占总细胞数的96.89%。BMSCs细胞表面CD34和CD44免疫组织化学染色呈阳性。慢病毒转染效率>90%,转染效率较高。HE染色结果中模型组大鼠坐骨神经有明显断裂,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组裂痕缩小,而NGF过表达组断裂处几乎不可见。电镜结果显示,模型组大鼠坐骨神经密度少,且形态不规则,BMSCs组大鼠坐骨神经较模型组密度大,且周边为纤维组织填充,NGF过表达组大鼠坐骨神经密度大,排列较为规则。示踪金染色显示NGF过表达组神经接头处可见神经聚集。RT-qPCR结果显示空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组NGF mRNA相对表达量分别为1.18±0.05、0.77±0.06、1.75±0.07和3.09±0.08,F=9.082,P=0.019;空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组caspase-3mRNA表达量分别为2.03±0.09、5.05±0.23、3.12±0.09和1.23±0.22,F=9.177,P=0.011。空白对照组、模型组、BMSCs组和NGF过表达组细胞凋亡率分别为(9.34±0.32)%、(31.24±3.43)%、(22.09±2.66)%和(4.97±1.05)%,F=9.664,P=0.014。结论腺病毒介导NGF过表达质粒转染BMSCs可以促进坐骨神经损伤大鼠坐骨神经修复,其机制可能是通过升高NGF mRNA,降低caspase-3mRNA水平实现。     

神经生长因子对神经干细胞分化的影响

【目的】探讨不同神经生长因子对神经干细胞(neural stemcells,NSCs)分化特性的影响。【方法】自10～14周人胚胎脑分离培养海马神经干细胞,分别用表皮生长因子(human epidermal growth factor,EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),或单独用bFGF扩增神经干细胞,取第3代神经干细胞球,用含小剂量bFGF(0.5 ng)的无血清基础培养基诱导分化,体外诱导分化7 d后应用免疫荧光方法检测β_Ⅲ微管蛋白(β_ⅢTubulin,Tuj1)和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibriliary acidic protein,GFAP)表达情况。【结果】不同的生长因子培养的神经干细胞分化特性很不相同,EGF+bFGF培养的NSCs既可分化为神经元,又可分化为星形胶质细胞,其分化比率分别为38.8%和57.3%;bFGF培养的NSCs主要分化为神经元,比率达81.2%,未检测星形胶质细胞。【结论】不同神经生长因子扩增的神经干细胞分化特性很不相同,本实验为神经干细胞分化的研究提供了良好的实验平台。