慢病毒介导的RNA干扰对乙型脑炎病毒感染的抑制作用

目的:研究由慢病毒介导的RNA干扰对乙型脑炎病毒(JEV)感染细胞与小鼠的抑制作用。方法:以JEV的C、NS3、NS4A和NS5基因为靶点,设计特异性siRNA序列,并构建重组传导慢病毒。对慢病毒预处理的BHK21细胞接种JEV,并通过相对定量PCR、病毒蚀斑和间接免疫荧光实验检测慢病毒对JEV的抑制作用。对慢病毒预处...     

慢病毒载体靶向携带survivin-siRNA对恶性黑色素瘤A375细胞的影响

目的 观察靶向survivin的RNA干扰对人恶性黑色素瘤A375细胞的影响.方法 将处于对数生长期的黑色素瘤A375细胞随机分为3组:阳性组、阴性对照组、空白对照组,将设计并构建好的survivin-siRNA慢病毒载体分别转染入各组细胞内,实时定量PCR及Western-blot法分别检测转染前后3组细胞survivin mRNA及蛋白的表达情况.结果 成功设计并构建了survivin-siRNA慢病毒载体,与空白对照组相比,转柒survivin-siRNA的阳性组survivinmRNA及蛋白的表达明显降低,抑制率分别为60％、87.38％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 靶向survivin的siRNA能够明显抑制恶性黑色素瘤A375细胞的survivin基因的表达.     

大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术进一步研究MeCP2功能.方法 设计针对大鼠MeCP2 mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用菌落PCR法、酶切及DNA测序鉴定重组克隆.结果 重组克隆经菌落PCR及酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确.结论 两个大鼠MeCP2-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用RNAi研究大鼠MeCP2功能打下了基础.     

TIEG特异的siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建TIEG基因siRNA慢病毒载体.方法 针对已经筛选确定的TIEG基因siRNA有效靶序列.合成靶序列的Oligo DNA退火形成双链DNA与经BamH Ⅰ和EcoRl酶切后的PshRNA-copGFP-lendvector慢病毒载体[含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生psiRNA-TIEG慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆.测序鉴定,用psiRNA-TIEG和病毒包装系统共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度;用包装病毒颗粒注射大鼠,通过RealTime-PCK检测大鼠肾组织TIEG mRNA的表达水平.结果 PCR和测序证实,成功构建TIEG siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG,包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×10<'5>ifu/μL;实验组大鼠TIEGmRNA的表达水平明显低于对照组(50.7%).结论 成功构建大鼠TIEG基因siRNA慢病毒栽体psiRNA-TIEG.     

慢病毒RNAi载体的制备及滴度测定方法的建立

目的构建可用于神经系统基因功能研究和基因治疗的慢病毒RNAi载体系统,并建立一种方便、快捷的慢病毒滴度测定方法。方法三质粒系统：PLK0.1-puro、△8.2、水疱性口炎病毒G糖蛋白（VSV-G）共转染293T细胞,产生慢病毒RNAi载体颗粒,超速冷冻离心浓缩;将病毒颗粒进行系列稀释后感染Eca9706细胞,采用嘌呤霉素最小致死量筛选病毒感染细胞的方法,进行慢病毒滴度测定。结果完成了慢病毒RNAi载体的包装及浓缩,确定了嘌呤霉素对Eca9706细胞的最小致死浓度为2.7μg/ml,并应用该浓度测得病毒颗粒的滴度为10^7TU/ml。结论成功构建了一种慢病毒RNAi载体，并建立了一种可行的慢病毒滴度测定方法。     

慢病毒载体对HIF-2α基因沉默效率的研究

目的 构建有效抑制HIF-2α基因表达的siRNA序列,并找到最佳病毒载体浓度.方法 设计针对HIF-2α mRNA作用的4条siRNA的序列,分别插入慢病毒载体中,获得较高滴度的慢病毒后,运用RT-PCR和Werstern blot方法检测HIF-2α mRNA及蛋白质水平,筛选出对HIF-2α基因沉默作用较强的干扰序列及病毒载体剂量.结果 4条siRNA序列均能干扰HIF-2α基因表达,其中KD2序列对HIF-2α基因的干扰作用最强(P<0.05).两种不同剂量的慢病毒载体比较,高剂量慢病毒载体的干扰效果更明显(P＜0.05).结论 KD2序列能有效沉默HIF-2α基因;高剂量的慢病毒载体对HIF-2α基因的沉默效果更强.     

NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能.方法 设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用双酶切及DNA测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆质粒并转染293T细胞,收集细胞全蛋白用Western检测RNAi效果.结果 重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Western检测证实设计的三条RNA干扰序列有效敲低了293T细胞中的内源性NSPc1.结论 3个NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用基于慢病毒系统的RNAi技术来研究NSPc1基因的功能打下了基础.     

miR-TH克隆及慢病毒载体的构建

目的：克隆microRNA-酪氨酸羟化酶（TH）,构建慢病毒载体。方法：根据TH基因序列（NM_009377.1）,设计并合成4对微小RNA（miRNA）的Oligo DNA,退火形成双链后与pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miRNA载体相连,用Gateway技术将构建好的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-TH载体先后与中间载体pDONRTM221、慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接,构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-TH,用脂质体2000（lipofectamine 2000）将慢病毒载体以及包装质粒（pLP1,pLP2和pLP/VSVG）共转染HEK-293FT细胞,收集上清,感染293T细胞株进行滴度鉴定。结果：测序结果表明,4对pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-TH表达载体序列与参考序列一致,构建出来的慢病毒载体在293FT细胞中包装成功,并通过293T细胞测得慢病毒滴度为5×106 TU/ml。结论：成功构建了TH的慢病毒干扰载体pLenti6/V5-DEST-TH,为利用RNA干扰技术进一步研究TH基因的功能和作用奠定了基础。     

大鼠瘦素受体RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

[目的]构建大鼠OBRb基因的RNAi慢病毒载体,并评估其对OBRb基因表达的沉寂作用。[方法]设计大鼠OBRb的siRNA靶序列,合成包含各正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,退火后插入到慢病毒载体质粒pRNA-lentivector-VGFP上,构建pRNA-Lenti-OBRb-VGFP表达重组体;为了评估RNAi基因沉寂作用,将构建的慢病毒载体转染表达OBRb的C6大鼠神经胶质瘤细胞,利用Realtime PCR方法检测OBRb mRNA表达水平。[结果]将目的序列连接到慢病毒载体上,成功构建pRNA-Lenti-OBRb-VGFP表达重组体;通过PCR、电泳初步鉴定该重组体有OBRb表达,并进一步进行基因测序证实插入序列正确;成功将慢病毒载体转染到C6大鼠神经胶质瘤细胞,转染效率可达40%;荧光实时定量PCR检测OBRb基因表达量,结果干扰组的OBRb mRNA表达水平明显低于非干扰序列的对照组,可使OBRb mRNA表达量下调近80%。[结论]成功构建大鼠OBRb的RNAi慢病毒载体,为进一步的体内研究奠定了基础。     

CD40-siRNA慢病毒载体的构建及其对小鼠巨噬细胞的感染

目的：构建CD40-siRNA慢病毒载体,检测其对小鼠巨噬细胞J774.1的感染效率及测定J774.1细胞的CD40 mRNA水平。方法：设计1段CD40的siRNA序列,构建慢病毒载体pLL3.7-CD40-siRNA,与pMD2. G、pMDLg/pRRE和pRSV-REV按比例采用LipofectamineLTX&Plus共转染293T细胞制备病毒,感染J774.1细胞后第4、6和8天时用流式细胞仪检测其感染效率,实时荧光定量RT-PCR（ qRT-PCR）检测CD40mRNA的表达水平。结果：成功构建CD40-siRNA慢病毒载体,当pLL3.7-CD40-siRNA、pMD2. G、pMDL g/p RRE和与pRSV-REV的比例为2：1：1：1时,制备的慢病毒滴度最高;慢病毒感染J774.1细胞的效率呈时间依赖性,感染第8天时的感染效率最高;同时,pLL3.7-CD40-siRNA组CD40 mRNA的表达明显低于pLL3.7空载体组,差异有统计学意义（P﹤0.05）。结论：慢病毒感染J774.1细胞的效率可以满足后续实验的要求,CD40-siRNA慢病毒载体可以抑制CD40mRNA的表达。     

热休克蛋白B1抑制HBV复制的研究

目的 探讨热休克蛋白B1 (heat shock protein B1,HSPB1)对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法 采用Western blot检测正常肝细胞系(HepRG)和HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中HSPB1的蛋白水平.在HBV稳定复制细胞系(HepAD38和HepG2.2.15)中转染pCMV6-HSPB1质粒及对照质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对HBV复制中间体表达的影响;qRT-PCR检测HSPB1过表达对HBV3.5 kb mRNA表达的影响;ELISA检测HSPB1过表达对HBV s抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)分泌的影响.在肝癌细胞系Huh-7中共转染pCH9/3091和pCMV6-HSPB1质粒,采用Western blot验证HSPB1过表达水平,实时荧光定量PCR和Southern blot检测HSPB1过表达对瞬时转染的HBV复制中间体表达的影响.结果 HSBP1在HepAD38和HepG2.2.15中的表达明显低于HepRG.HSPB1在HepAD38和HepG2.2.15细胞中成功过表达,在过表达HSPB1的HepAD38和HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体水平以及3.5 kb mRNA水平均降低,细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平也降低.HSPB1在转染pCH9/3091的Huh-7细胞中成功过表达,HSPB1过表达抑制了瞬时表达的HBV的复制水平.结论 HSPB1可以抑制HBV复制.     

Therapeutic effect of Styela plicata on duck hepatitis B virus in vivo

Objective： To evaluate the antiviral activity of the alcohol extract of Styela plicata on DHBV （duck hepatitis B virus） in vivo. Methods： Guangzhou-Sheldrake ducklings congenitally infected with DHBV were assigned to receive the alcohol extract of Styela plicata or lamivudine for 30 consecutive days. The DHBV DNA of sera was detected by RT-PCR, and the histological analysis of duckling liver was evaluated. Results： Thirty days after therapy, histological analysis of duckling liver showed that the ducklings receiving the alcohol extract of Styela plicata or lamivudine exhibited catabatic status in the degree of liver cell degeneration and inflammation compared with the ducklings receiving normal diet. DHBV DNA of sera from alcohol extract of Styela plicata-treated ducklings and lamivudine-treated ducklings all produced significantly lower levels compared with ducklings receiving normal diet （P〈0.01）. Although these treatment groups all exhibited a rebound phenomenon 10 d after withdrawal of medication, they still exhibited a significant lower level of serum DHBV DNA compared with the control group responded to normal diet （P〈0.05, P〈0.01）. Conclusion： Styela plicata may be an effective antiviral medicine in treating chronic hepatitis B. The data of this experiment will be valuable in studying the therapeutic role and the potential therapeutic mechanism of Styela plicata.     

乙肝疫苗联合乙肝免疫球蛋白阻断乙肝病毒母婴传播的临床效果

目的：探讨乙肝免疫球蛋白（HBIG）和乙肝疫苗联合阻断乙肝病毒（HBV）母婴传播的疗效。方法：选择2014年12月~2015年12月间246例HBsAg阳性孕妇为研究对象,根据随机数字表法分为观察组及对照组,均123例。对照组仅新生儿单独接种乙肝疫苗,观察组孕妇及新生儿均联合接种乙肝疫苗和HBIG。结果：对照组及观察组新生儿中出现宫内HBV感染率分别为22.76%和9.76%,一年后对照组及观察组新生儿中HBV感染率分别16.26%和1.63%,两组间差异均存在统计学意义。对照组及观察组新生儿出生时及一年后对应HBsAb阳性率分别为8.13%、76.42%和27.64%、94.31%,两组差异存在统计学意义。结论：孕妇及新生儿乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗联合应用能够有效降低HBsAg阳性情况患者所产新生儿HBV感染率,同时能使新生儿对应的HBsAb转阳率有效提高,最终使HBV的传播阻断率提高。     

HBeAg阳性B、C基因型乙肝患者使用拉米夫定治疗的病毒抑制效应对比分析

目的探讨拉米夫定对B、C基因型乙型肝炎（乙肝）患者治疗作用。方法观察未用、使用拉米夫定治疗的慢性乙肝患者随时间延长血清病毒标志物HBV DNA水平、HBeAg血清转换率及随拉米夫定疗程延长乙肝病毒聚合酶及转录酶区酪氨酸-蛋氨酸-门冬氨酸-门冬氨酸基序（HBV YMDD）耐药变异率等的变化,对比分析拉米夫定抗病毒治疗对B、C基因型乙肝患者的病毒抑制效应。结果（1）未用拉米夫定治疗的乙肝患者, B基因型者HBV DNA水平低于C基因型者,而自发HBeAg血清转换率高于C基因型者。（2）使用拉米夫定治疗的乙肝患者,B、C基因型者之间HBV DNA水平、HBeAg血清转换率及YMDD变异率没有明显差异。（3） B、C基因型患者均随拉米夫定疗程延长HBV DNA水平下降,HBeAg血清转换率增加,但YMDD变异率也增加。结论（1）未用拉米夫定治疗的自然状况下C基因型乙肝患者携带的乙肝病毒复制能力强于B基因型患者者且不易清除。（2）使用拉米夫定疗程相同时B、C基因型患者之间拉米夫定的病毒抑制效应及HBV YMDD耐药变异率相似。（3）C基因型HBV感染的乙肝患者及早使用拉米夫定抗病毒治疗意义更大。     

时间分辨免疫荧光分析检测乙型肝炎病毒表面抗原

目的 时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)是当前标记免疫分析研究应用领域的热点之一,具有高灵敏性和高特异性,用于生物分子的超微量检测.本研究者在建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便的检测方法.方法 以Eu-DTTA{N1-(P-异硫氰基苄基)-二乙三胺四乙酸铕钠}为示踪物,建立了用TRFIA检测乙型肝炎血清学标志物乙型肝炎病毒表面抗原的方法.结果 所建立的标准曲线分析范围分别为0.2～300 ng/ml,分析灵敏度为0.05 ng/ml,检测参考标准品的批内变异系数均小于10%,与免疫放射测定同时定量检测多份血清样本,相关系数高达95%.结论 TRFIA分析范围宽,灵敏度高,操作简便,具有优越的定量检测能力,价格适中,十分适合临床推广应用.     

乙肝病毒adr型基因疫苗诱导小鼠体液免疫应答

目的：构建乙肝病毒adr型基因疫苗pCMVS2-S,观察其免疫小鼠的特异性体液免疫应答。方法：将构建的乙肝病毒基因疫苗注射于C57BL/6小鼠胫骨前肌肉,运用ELISA检测不同时间小鼠血清中抗HBs抗体。结果：注射基因疫苗1周后,血清中抗HBs抗体转阳,1个月后抗体达到高峰,并以高水平维持至少2个月。结论：基因疫苗pCMVS2-S诱导C57BL/6小鼠产生较好的体液免疫应答。     

深圳市乙肝疫苗免疫失败者S基因分析

目的了解乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因的变异情况。方法采用流行病学、ELISA与分子生物学方法,筛选乙肝疫苗免疫失败者。采用聚合酶链反应（PCR）、基因克隆和测序的方法,对乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因进行分析,并与HBV参考序列s基因进行比较,分析其变异情况。结果从2564份受检者中．筛选出2例（0．78％e）HBsAg（-）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）乙肝疫苗免疫失败者（HBsl、HBs2）,经HBVDNA荧光定量PCR检测和HBVS基因PCR扩增,结果均为阳性,为B基因型。其S基因序列与参考序列（JX429908．1）相比,同源性为98．57％,且乙肝疫苗免疫失败者s基因在第363位和第467位分别由野生型的C变为A、G变为A,HBsAg121位和156位氨基酸C和w缺失。结论乙肝疫苗免疫失败者HBVS基因上第363位和第467位碱基存在错义突变（C→A和G→A）,改变了HBsAg的结构和抗原性。     

不明原因肝炎患者隐匿性乙型肝炎病毒感染检测分析

目的探讨不明原因肝炎患者隐匿性乙型肝炎病毒（HBV）感染情况及隐匿性感染的机制。方法采用巢式聚合酶链反应（PCR）检测103例不明原因肝炎患者血清HBVDNA。用电化学发光免疫技术对检测出的隐匿性HBV感染者血清HBsAg进行定量测定。结果隐匿性乙型肝炎病毒感染率为17．5％。电化学发光免疫技术检测隐匿匿性HBV感染者血清HBsAg,未检出有3例,在0．05～0．1ng／ml有8例,0．1～0．5ng／ml有6例,3．5ng／ml有1例。隐匿性HBV感染者血清HBVDNA水平为10^3～10^6copies／ml。结论隐匿性HBV感染是不明原因肝炎的病因之一。隐匿性HBV感染者血清HBsAg阴性的机制主要是HBV复制和基因表达的严重抑制,以及HBV基因突变。     

血清乙肝病毒DNA载量对乙型肝炎病毒相关性肾炎病理变化的影响

Objective To investigate the correlation between the content of hepatitis B virus DNA(HBV-DNA) in the serum and the pathologic change in hepatitis B virus associated-glomerulonephritis (HBV-GN).Methods Forty one HBV-GN patients were divided into 3 groups by the content of HBV-DNA in the serum:low replicate group,midrange replicate group, and high replicate group. The relationship with the content of HBV-DNA in the serum and pathologic stage or change was analyzed in 35 membranous glomerulopathy patients; Effect of the content of hepatitis B virus DNA in the serum on HBVAg deposition in glomeruli of kidney was examined by immunohistochemistry; Effect of HBVAg deposition on pathologic change was observed in membranous glomerulopathy patients.Results With the multiplication of HBV-DNA in the serum, the pathologic lesion was aggravating from Stage I to Stage III in membranous glomerulopathy patients; the deposition of HBVAg in glomeruli of kidney was increasing; with the increasing of deposition of HBVAg in glomeruli of kidney, the pathologic lesion was aggravating in membranous glomerulopathy patients.Conclusion With the multiplication of HBV-DNA in the serum, the deposition of HBVAg in glomeruli of kidney increases, and the pathologic lesion aggravates, which have significant correlation.     

HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验研究

目的 :建立HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验方法 .方法 :培养HepG2细胞传至 6孔板中 1 2h后 ,加2 0mL·L-1 DMSO继续孵育 1 2h .而后进行HBV阳性血清体外感染HepG2的实验 .感染组用HBV阳性血清 ,阴性对照组用HBV阴性血清 ,空白对照组用DMEM培养基 .实验开始后HepG2细胞在 2 0mL·L-1 DMSO的浓度下继续孵育 2 4h ,而后用PBS清洗 ,洗 8次 ,PBS洗后每隔 1 2h收集一次细胞培养上清 .ELISA检测细胞培养上清中的HBsAg.PCR检测细胞培养上清和HepG2细胞中的HBVDNA .结果 :HBV阳性血清感染组 ,在PBS洗后 1 2h的细胞培养上清中ELISA检测到HBsAg阳性 (A =0 .8) .PCR检测显示HBV阳性血清感染组细胞培养上清和HepG2细胞中HBVDNA阳性 ,阴性对照组和空白对照组HBVDNA阴性 .结论 :在一定条件下用HBV阳性血清进行HBV感染体外培养的HepG2细胞是可行的