联合应用EGF和NGF对成年大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的探讨联合应用表皮生长因子(EGF)和神经生长因子(NGF)对成年大鼠海马神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单克隆培养细胞行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1w后细胞行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养基中所加营养因子的不同将第4代细胞分为4组培养:EGF组、EGF+NGF组、NGF组、对照组,此4组细胞培养1w后行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果单克隆培养后克隆球表达Nestin,诱导分化1w后细胞表达NSE、GFAP。与空白对照组相比,EGF组、NGF组和EGF+NGF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+NGF组细胞的比例最高。结论单独或联合应用EGF、NGF可以促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化。     

缺氧对新生大鼠海马神经干细胞增殖和分化的影响

目的探讨单纯性缺氧对新生大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响。方法将36只新生1d大鼠随机均分为N组(正常对照组)、Q2组(缺氧2h组)、Q5组(缺氧5h组)。将海马组织在无血清培养液(均含有碱性成纤维生长因子bFGF、表皮生长因子EGF和白细胞抗原B27)中,分别进行原代培养、单克隆培养和传代培养,单克隆培养细胞进行巢蛋白(Nestin)和Hoechst33342免疫荧光双标染色;传代培养的细胞传三代诱导分化,诱导分化3d的细胞分别行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Hoechst3342免疫荧光双标染色,计数NSE阳性细胞比例,进行统计学分析。结果单克隆培养的细胞均呈Nestin阳性表达,诱导分化的细胞部分呈NSE或GFAP阳性表达。Q2组、N组、Q5组细胞原代培养克隆球直径达2μm的时间分别为7d、10d、13d。传3代后,对各组细胞进行诱导分化,Q2组细胞诱导分化为神经元的比例明显高于N组,Q5组的细胞诱导分化为神经元的比例明显低于N组。结论短时间缺氧可促进在体海马神经干细胞增殖和诱导其向神经元分化,长时间缺氧则抑制在体神经干细胞增殖和向神经元分化。     

EGF培养条件下NGF与BDNF对大鼠海马神经干细胞向神经元分化的差异

目的探讨在表皮生长因子(EGF)培养条件下,相同浓度神经生长因子(NGF)与脑源性神经生长因子(BDNF)对成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化比例的差异。方法用含碱性成纤维生长因子(bFGF)、EGF、B27的无血清细胞培养技术体外培养成年大鼠海马神经干细胞,单细胞克隆后行Nestin免疫细胞化学染色,诱导分化1周,行GFAP和NSE免疫细胞化学染色;根据培养液中所加营养因子的不同将单细胞克隆传代细胞分为5组培养:EGF组、NGF组、BDNF组、EGF+NGF组、EGF+BDNF组,此5组细胞培养1周,进行NSE免疫细胞化学染色,计数阳性细胞比例后进行统计学分析。结果:单细胞克隆培养后克隆球细胞表达Nestin,诱导分化1周,细胞表达NSE、GFAP;与EGF组、NGF组、BDNF组相比,EGF+NGF组和EGF+BDNF组细胞分化为神经元的比例较高(P<0.05),其中EGF+BDNF组细胞的比例最高。结论在EGF培养条件下,BDNF促进成年大鼠海马神经干细胞向神经元分化的能力高于NGF。     

条件培养液对Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆增殖的影响

目的探讨神经干细胞(NSCs)条件培养液对其单细胞克隆增殖的影响。方法采用无血清培养法体外培养Wistar大鼠海马神经干细胞并进行传代培养,然后收集神经干细胞条件培养液。第四代细胞进行单细胞克隆,并将单细胞克隆细胞分为条件培养液组、无血清培养液对照组。通过MTT法比较两组细胞的增殖情况。单克隆培养细胞行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色,诱导分化后细胞行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Galc)免疫细胞化学染色。结果单克隆培养后克隆球表达nestin,诱导分化后细胞表达NSE、GFAP、Galc,条件培养液组细胞增殖速度高于对照组。结论条件培养液能提高Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆的增殖速度。     

新生大鼠神经干细胞的分离培养与分化

目的　从新生SD大鼠脑室下区分离并培养神经干细胞 ,观察神经干细胞的生长、增殖及分化的特点。方法　利用无血清培养和单细胞克隆技术 ,采用原代贴壁及传代悬浮的方法 ,培养获得细胞克隆。应用免疫细胞化学方法及透射电镜检测技术 ,鉴定神经干细胞和分化的神经细胞。结果　从新生SD大鼠脑室下区分离的组织 ,经原代和传代培养均可形成细胞克隆 ,并具有增殖的能力。原代和传代细胞Nestin抗原呈阳性 ,分化后的细胞可表达NSE、GFAP、GC特异性抗原。结论　本法从新生SD大鼠脑室下区分离的细胞具有自我更新和分化潜能 ,有很强的增殖能力 ,属于中枢神经系统的干细胞     

星形胶质细胞条件培养液促进新生大鼠海马神经干细胞分化

目的探讨星形胶质细胞条件培养液(ACM)对神经干细胞(NSCs)体外分化的影响。方法行新生大鼠大脑皮质星形胶质细胞的纯化培养后收集ACM,将新生大鼠海马NSCs单克隆培养后行nestin免疫细胞荧光染色,诱导分化5d后行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(GALC)免疫细胞荧光染色;将单克隆培养的NSCs分为对照组和实验组,对照组为单纯NSCs培养液,实验组根据NSCs培养液与ACM比的不同分3组:A组(2:1),B组(1:1),C组(1:2)。各组培养1周,采用NSE免疫细胞荧光检测方法标记神经元并计数和统计学分析。结果纯化的星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白抗体标记阳性率为96.5%;单克隆培养的海马NSCs呈nestin阳性,诱导后呈NSE、GFAP和GALC阳性表达。ACM培养的海马NSCs各组分化为神经元的比例明显高于对照组(<0.01),其中A组的比例最高。结论ACM可以促进新生大鼠海马NSCs向神经元分化。     

冬虫夏草含药血清诱导神经干细胞定向分化的影响

目的探讨冬虫夏草中含药血清诱导神经干细胞（NSCs）定向分化的作用。方法取新生24 h内的Wistar大鼠大脑海马区分离培养神经干细胞三代后,加入低、中、高剂量冬虫夏草含药血清与对照血清进行培养,观察其对神经干细胞影响,通过MTT检测神经细胞生长曲线和免疫组化法检测神经干细胞向神经元分化的情况。结果新生大鼠海马分离培养的神经克隆球,经免疫细胞化学染色检测为Nestin阳性细胞。神经干细胞贴壁分化的细胞呈NSE、GFAP阳性。冬虫夏草低、中剂量组诱导神经干细胞分化为神经元的阳性细胞明显高于对照组,且呈量效依赖关系,高剂量组与对照组没有明显差别。结论冬虫夏草含药血清可体外诱导神经干细胞向神经元方向分化,在一定范围内存在量效依赖关系。     

大鼠脑室下区神经干细胞的分离培养与分化

目的从新生SD大鼠脑室下区分离并培养神经干细胞,观察其生长、增殖及分化。方法采取无血清培养和单细胞克隆技术,采用原代贴壁及传代悬浮方法,培养获得细胞克隆。利用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞。结果从新生SD大鼠脑室下区分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,且具有增殖能力。原代和传代细胞巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原呈阳性。神经干细胞可分化为神经元。结论用上述方法分离的细胞具有自我更新能力和分化潜能以及很强的增殖能力,属于中枢神经系统的干细胞。     

大鼠乳鼠肌源性干细胞体外诱导分化为神经样细胞

目的:探讨神经生长因子(NGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠乳鼠肌源性干细胞(MDSCs)分化为神经样细胞的可行性.方法:取SD大鼠乳鼠骨骼肌,差速贴壁至第5代时培养液中加入诱导培养基培养,行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析.结果:分化后细胞NSE染色阳性,RT-PCR结果显示,诱导后MDSCs样品中检测到NSE、GFAP特异性条带.结论:在一定条件下NGF和bFGF联合诱导法可以诱导MDSCs分化为神经样细胞.     

黄连素诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:黄连素体外定向诱导SD大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。方法:用全骨髓细胞悬液体外扩增和纯化骨髓间质干细胞。选用第5代以后骨髓间质干细胞进行诱导分化,用含10 μg/L碱性细胞生长因子(bFGF)的完全培养液预诱导24 h,后更换含黄连素的无血清DMEM诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元烯醇酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:大鼠骨髓间质干细胞体外扩增第5代后细胞形态达到均一,成梭形。加黄连素诱导1h-8 h,间质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,形似神经细胞。免疫组化显示诱导的神经元样细胞NSE、NF表达阳性,GFAP阴性。结论:黄连素可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

鼠巨细胞病毒影响神经干细胞分化及分化基因的表达

目的： 研究鼠巨细胞病毒（MCMV）感染对体外培养神经干细胞（NSCs）分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致脑发育异常的机制。方法: 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs,检测细胞分化潜能,用感染复数（MOI）为5、1和0.1 MCMV smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物nestin、GFAP和NSE表达的变化,采用MCMV 早期抗原（EA）示踪感染过程（MOI=1）,实时定量RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Neurog2、Myc及Ccnd1 mRNA水平的动态变化。结果: 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记nestin表达阳性,并可进一步分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,GFAP和NSE表达显著低于正常对照组（P<0.05）,可检测到MCMV EA（早期抗原）的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组（P<0.05）;感染组Neurog2 mRNA水平在分化培养后第1 d明显低于正常对照组（P<0.05),感染组Myc mRNA表达水平在第1-4 d显著低于正常组（P<0.05),感染组Ccnd1 mRNA水平在第0.5-1 d明显低于正常组;感染组和正常组的差异随病毒MOI的增加而更明显。结论: (1)MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;(2)MCMV可下调或干扰NSCs Wnt信号途径分化基因Neurog2、Myc和Ccnd1的表达;(3)MCMV抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;(4)MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV感染致脑发育异常的重要机制之一。     

胚胎海马来源干细胞移植治疗缺血性脑梗死的研究

目的： 对脑梗死大鼠进行胚胎海马来源的干细胞移植治疗,观察其能否在梗死灶部位分化为成熟的神经元而发挥神经替代作用,并最终改善动物的肢体功能。方法: 从绿色荧光蛋白(GFP)转基因SD胚胎大鼠的海马提取细胞进行体外培养,免疫荧光染色观察这些细胞的特征。光化学法制作大脑皮层局灶缺血梗死模型, 即光血栓皮层损伤(PCI)。PCI后1 d将20只SD大鼠随机分为干细胞移植组和对照组,前者在梗死灶附近植入胚胎海马来源的干细胞,而后者不进行干细胞移植。在PCI后1、7、14、21 d,用旋转实验对动物的肢体功能进行测试和评分。在PCI后3周和12周,以抗神经元核抗体(NeuN)染色成熟的神经元,观察移植干细胞的存活及其分化为各种亚型神经细胞的情况。结果: 来自SD大鼠胚胎海马的细胞明显表现出神经干细胞的特征。移植的细胞可以在脑梗死动物模型中至少存活12周,并能分化为成熟神经元、星形胶质细胞等亚型的神经细胞。与移植后3周相比,12周时的NeuN+/GFP+ 密度和移植物体积均有所减少(P<0.05)。旋转实验结果表明,在PCI后7、14、21 d,移植组动物在平衡木上的停留时间均显著长于对照组(P<0.01)。结论: 来源于胚胎海马的细胞具有神经干细胞特征,其被移植入脑梗死灶周围后能存活12周以上,并可以分化为成熟的神经细胞,这可能与动物运动功能的改善有关。该结果提示由移植物分化的神经细胞可能对受损宿主细胞发挥了替代作用。     

新生大鼠神经干细胞移植对脑缺血再灌注损伤的治疗作用

目的:探讨新生大鼠神经干细胞移植治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的可行性及疗效.方法:体外培养新生大鼠神经干细胞.采用改良的线栓法制作脑缺血再灌注模型,3d后用脑立体定位仪经脑室移植神经干细胞,移植时间点及再灌注1～7周对移植大鼠进行神经功能损伤程度评分(NSS).再灌注1、 2、 3、 5、 7周末麻醉处死大鼠,脑组织石蜡包埋.免疫组织化学方法观察移植后神经干细胞的存活、分布.结果:神经干细胞表达巢蛋白,在血清条件下分化为表达微管相关蛋白(MAP2)的神经元和表达胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)的星形胶质细胞.神经干细胞移植组NSS评分在各个时间点均显著低于对照组.移植的神经干细胞分布于缺血侧皮质、纹状体,再灌注后3、 5、 7周,皮质、纹状体阳性细胞数分别较1、 2周显著增多,第3、 5、 7周之间差异无统计学意义.前3周组织结构疏松,缺损严重,而第5、 7周组织结构较前3周完整致密.结论:移植的神经干细胞能在脑缺血大鼠脑内存活、迁移,并能改善缺血后大鼠的神经功能状况.     

小鼠胚胎大脑皮质与中脑神经干细胞培养与分化比较的研究

目的比较小鼠胚胎脑皮质与中脑来源的神经干细胞在培养与分化方面的差异，为更好的研究和利用神经干细胞提供实验依据。方法无菌条件下分别分离鼠胚大脑皮质与腹侧中脑，经胰酶消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM／F12培养基，培养扩增；倒置显微镜观察比较生长状况；机械方法传代；10％血清接种分化；免疫荧光细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向，并作比较。结果小鼠胚胎脑皮质与中脑均存在神经干细胞，其免疫细胞化学鉴定均呈Nestin阳性，并都能分化为神经元和胶质细胞；但皮质部位所含神经干细胞明显多于中脑，也更宜成球；有血清条件下分化，皮质神经干细胞未见分化为酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元；中脑神经干细胞则可少量分化为TH阳性神经元结论同样条件下皮质神经干细胞比中脑神经干细胞更易增殖与培养，两者在有血清条件下分化为TH阳性神经元能力方面有差异。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

无血清培养新生Wistar大鼠神经干细胞及免疫荧光鉴定

目的在无血清条件下,分离培养新生1d的Wistar大鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况,并对其生物学特性进行鉴定。方法取新生1d的大鼠海马组织,机械分离法分离神经干细胞,加入含有表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清培养基中培养、增殖。倒置显微镜下观察神经干细胞的增殖分化情况,采用免疫荧光染色鉴定其生物特性。结果从新生大鼠海马组织分离培养的神经干细胞在无血清培养基中不断增殖,免疫荧光染色显示巢蛋白呈阳性表达。诱导分化后,免疫荧光染色可见高分子量神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白和髓鞘碱性蛋白阳性表达细胞。结论无血清条件分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞与永生化神经干细胞系C17.2定向分化为神经元潜能的差异

目的 对比大鼠早期胚胎神经干细胞( NSCs)与永生化神经干细胞系C17.2(C17.2-NSC)定向分化为神经元潜能的差异,确立适用于诱导NSCs定向分化为神经元高内涵药物筛选的NSCs筛选模型. 方法 C17.2-NSC、17d胚胎海马NSCs(E17-NSC)及11d胚胎大脑皮层NSCs(E11-NSC)均设定对照组和实验组,对照组与实验组的细胞在含有2％ (v/v) B27的DMEM/F12培养液中,分别经0μmol/L和1μmol/L维甲酸(RA)在37℃、5％CO2常规培养条件下诱导分化5d,通过免疫组织化学技术检测对照组与实验组中NSCs或前体细胞特异性标志蛋白巢蛋白(Nestin)及神经元特异性标志蛋白βⅢ微管蛋白(Tuj1)表达量的差异. 结果 与对照组相比,C17.2-NSC经1μμmol/L RA诱导后未定向分化为神经元,而E17-NSC及E11-NSC经1μmol/L RA诱导后可有效定向分化为神经元. 结论 相对于C17.2-NSC,大鼠早期胚胎NSCs定向分化为神经元的潜能更强,适用于诱导NSCs定向分化为神经元的高内涵药物筛选.