豆豉纤溶酶的分离纯化及部分酶学性质研究

 目的 从豆豉中分离出具有强纤溶活性的菌株,从该菌株的发酵液中纯化出纤溶酶并对此纤溶酶的部分酶学性质进行研究。方法 利用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephadex G-75凝胶过滤色谱等方法进行纯化;利用N-末端氨基酸序列测定及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对此酶进行鉴定。结果 从发酵液中获得了纤溶酶单一组分,表观相对分子质量为30×10³。该纤溶酶在50 ℃以下和pH 7.0~9.0之间保持稳定,最适温度为35 ℃;最适pH为8.6。N-末端氨基酸序列及飞行时间质谱测定结果都表明该酶与纳豆激酶氨基酸序列有着极高的相似性。结论 获得了纤溶酶单一组分,为纤溶酶发酵产品的大规模纯化和进一步研制开发新的溶栓药物提供重要理论依据。     

酶解法辅助提取钩藤中钩藤碱的工艺优选

目的:优选酶解法辅助提取钩藤中钩藤碱的工艺条件,为该药材的资源利用提供参考。方法:采用HPLC测定钩藤碱含量,流动相甲醇-水(60∶40),检测波长254 nm。以钩藤碱提取率为指标,在单因素试验基础上,通过正交试验考察加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解p H对酶解提取工艺的影响。结果:最佳酶解提取工艺条件为纤维素酶用量1%,p H 4.5,酶解温度50℃,酶解时间2 h。钩藤碱提取率0.54%,较加热回流法提高了54.29%。结论:酶解法有利于提高钩藤碱的得率,优选的提取工艺稳定可行,适合推广于药材中生物碱类成分的提取。     

丙酮对溶栓酶活力的动力学初步探究

目的:研究丙酮对枯草芽孢杆菌溶栓酶活力的影响及抑制动力学.方法:用Sephadex G-100凝胶柱色谱分离纯化酶,以四肽底物法测定酶活,选择丙酮为效应物,测其对溶栓酶的影响.最后,用Lineweaver-Burk双倒数作图法,比较酶催化的动力学参数,确定抑制剂的类型,测定抑制常数.结果:当丙酮浓度增大时,溶栓酶的酶活力损失越严重.在含不同浓度丙酮的测活体系中,随着丙酮浓度的增大,直线的斜率降低.在双倒数图中,V_(max)值随着丙酮的增大而减小,而K_m值随着丙酮的增大而增大.测得丙酮对酶的抑制常数K_I,K_(IS)分别为1.25,3.17.结论:丙酮对溶栓酶有抑制作用.丙酮对酶的抑制作用是可逆过程,抑制类型为混合型抑制.     

酶浸提取法对北豆根生物碱产率的影响

目的:研究了纤维素酶在提取生物碱过程中的应用。方法:采用酶浸提取法和酸水温浸提取法提取北豆根生物总碱,高效液相色谱(HPLC)法测定山豆根碱的含量。结果:酶浸提取法和酸水温浸法提取北豆根生物总碱的产率分别为:1.96%、1.46%;酶浸提取法提取山豆根碱和酸水温浸法提取山豆根碱占总碱的含量分别为:98.09 mg/g,69.2 mg/g。结论:在单位时间内用酶法提取北豆根碱产率可提高25%以上。     

内生镰刀菌漆酶辅助提取槐米中总黄酮的研究

目的研究内生真菌胞外漆酶在槐米总黄酮提取中的应用。方法内生镰刀菌在起始pH7.0的综合马铃薯培养基中,20℃下摇瓶培养6d,具有较高的漆酶活力(36.1U/mL)。槐米干粉投入真菌发酵液中进行酶解处理,比较酶料比、酶解温度、酶解时间和酶解液pH值对槐米总黄酮提取率的影响。结果槐米干粉以酶料比40∶1加入粗酶液中,在pH7.0、20℃下酶解处理1h后,总黄酮提取率可达11.4%,比常规提取法提高了28.7%。结论内生菌漆酶辅助提取法为槐米总黄酮提取的可行新方法。     

鲜地黄中α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的提取与初步纯化

目的:从鲜地黄中提取并初步纯化α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。方法:以总酶活为考察指标,通过正交试验确定两种酶的最佳提取条件。以酶活力和蛋白质含量为考察指标,确定两步盐析法的硫酸铵饱和度。结果:提取温度和溶剂量对α-Gal的提取具有显著性影响,而提取溶剂对-βG lu的提取具有显著性影响,因此确定以3倍量(v/w)磷酸盐缓冲液,4℃提取4 h为两种酶的最佳提取条件。以30%和60%为两步盐析的最佳硫酸铵饱和点。结论:鲜地黄中存在α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶,两步盐析法可以使二者得到初步纯化。     

小檗碱型生物碱对弹性酶的抑制作用

试验表明小檗碱型生物碱及一些结构相近的生物碱对猪胰脏的弹性酶(PPE)和人痰的弹性酶(HSE)有抑制作用。小檗碱、黄连碱和血根碱的盐酸盐较明显地抑制这2种酶的促弹性组织离解活性,而四氢小檗碱对这种活性没有影响。看起来生物碱的四价氮在抑制促弹性组织离解活性方面起了重要的作用。然而,所试过的所有生物碱对弹性酶促酰胺基分解活性均没有影响。     

酶解辅助提取金芪降糖片中生物碱的工艺研究

目的考察酶解辅助提取技术对金芪降糖片中生物碱提取率的影响,优选出生物碱的最佳提取工艺条件。方法采用正交试验,考察酶用量,pH,温度以及酶解时间对金芪降糖片中生物碱提取率的影响。结果优化酶解法的最佳提取工艺条件为:加入相当于药材质量0.6%的纤维素酶,在pH4.5,35℃条件下酶解3.0 h,可将小檗碱提取率提高29.98%,黄连总生物碱提高30.17%。结论酶解–冷浸法提取黄连生物碱简便可行,不仅生物碱浸出率高,而且适合工业化生产。     

黄连碱在人肝微粒体中的代谢

目的研究黄连碱在人肝微粒体中的代谢情况。方法通过酶促动力学实验计算酶促动力学参数,通过检测CYP450亚酶专属性抑制剂对黄连碱代谢的影响,推测参与黄连碱代谢的CYP酶亚型,并推断代谢产物的结构。结果黄连碱在人肝微粒体中代谢的米氏常数Km为6.802 7μmol/L,最大代谢速率Vmax为0.054 76 nmo L/(mg protein·min),肝清除率Clint为0.008 m L/(mg·min),奎宁、甲氧沙林、酮康唑均在一定程度上抑制了黄连碱的代谢,黄连碱在人肝微粒体中的代谢产物为黄连碱脱去一个亚甲基结构。结论 CYP2D6、CYP2A6、CYP3A4可能参与黄连碱的代谢,代谢产物为脱亚甲基黄连碱。     

川乌的纤维素酶酶解提取工艺研究

目的 比较纤维素酶、半仿生、乙醇回流提取方法对川乌中乌头碱、乌头总碱的影响,筛选最佳方法.方法 利用纤维素酶辅助提取川乌生物碱,以乌头碱、乌头总碱提取率为指标,正交试验优化纤维素酶的最佳提取条件,再与半仿生、乙醇提取方法进行比较.结果 提取乌头碱、乌头总碱的最佳酶解条件为:温度45℃,pH值4.5,酶用量8mg/g,酶解时间5 h,乌头碱提取率为0.002 447%,乌头总碱提取率为0.244 410%,半仿生提取乌头碱、乌头总碱的提取率分别为0.001 735%、0.189 340%,乙醇回流提取乌头碱、乌头总碱提取率分别为0.001 869%、0.200 720%,纤维素酶提取法具有明显的优势.结论 酶解提取法可显著提高乌头碱、乌头总碱的提取率,可在实际生产中推广应用.     

中乌头碱的丙酰化修饰研究

目的 探讨中乌头碱C_3,C_(13),C_(15)位羟基的丙酰化方法.方法 以中乌头碱、丙酸酐为原料合成中乌头碱酯化衍生物.结果 得到4种丙酰化衍生物,并通过ESI-MS,1H-NMR验证了其结构,分别为3-丙酰基中乌头碱(a);3,13,15-三丙酰基中乌头碱(b);3-丙酰基-13,15-二乙酰基中乌头碱(c);3-乙酰基-13 -丙酰基中乌头碱(d).据文献检索,所有化合物均为首次报道. 结论中乌头碱的三个羟基中,C_3-OH最易被丙酰化,C_(15)-OH最难被丙酰化.     

安痫宁冲剂对小鼠癫痫模型脑组织中MDA、SOD、ATP酶的影响

目的：通过安痫宁冲剂对青霉素诱导的小鼠癫痫模型脑组织中MDA，SOD，ATP酶影响的实验研究，探讨安痫宁冲剂的抗癫痫作用，方法：采用青霉素诱导小鼠癫痫模型，利用化学比色法测定小鼠癫痫模型脑组织中MDA，SOD，ATP酶的含量，结果：模型组小鼠腹腔注射青霉素，均能成功致痫，其痫性发作程度较重，均为Ⅲ-Ⅴ级；安痫宁冲剂能降低癫痫小鼠脑中MDA的含量，提高SOD，ATP酶的活性，结论：安痫宁冲剂具有一定的抗癫痫作用，与其镇静安神，抗惊厥，清除自由基和维持N ^ ,K^ ,Mg^2 ,Ca^2 离子的动态平衡有关。     

灵芝液体发酵产漆酶最佳培养基和培养条件研究

目的研究灵芝液体发酵产漆酶的最佳培养基和培养条件。方法以灵芝S3号菌株为试验材料,以灵芝漆酶活性为衡量指标,通过正交试验分别对灵芝液体发酵培养基及培养条件进行优化筛选。结果筛出最佳培养基组成为葡萄糖30g/L、棉花0.2%、磷酸氢二铵0.66g/L、干酪素0.5%、聚山梨酯-800.15%;优化培养条件为初始pH5.5、装液量75mL、接种量12.5%、菌龄5×24h、培养时间9×24h。结论优化培养基及培养条件后,发酵液中灵芝漆酶活性显著提高。     

氨苄青霉素钠的制备方法

 氨苄青霉素的合成方法有混合酸酐法、酰氯法、青霉素酰化酶法以及青霉素为原料的一步合成法等。其中以混合酸酐法最为常用，但以统氯法文献报道收率最高。氨苄青霉素钠盐的制备方法有喷雾干燥法、溶媒结晶法和冷冻干燥法等。喷雾干燥法在我国应用较广泛，但也存在着一些质量问题。     

丹参潜在性致病内生真菌的筛选及其致病相关酶酶学特性分析

目的:从18株丹参内生真菌中筛选具有潜在性致病作用的内生真菌,并对其致病机制进行探究。方法:采用内生真菌与组培苗共培养方式,根据组培苗的发病情况筛选出潜在性致病作用的内生真菌,测定活体外和活体根内的纤维素酶[羧甲基纤维素酶(Cx),β-葡萄糖苷酶(β-G)],果胶酶[多聚半乳糖醛酸酶(PG),聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)]和半纤维素酶(木聚糖酶)等细胞壁降解酶(CWDE)活性的变化。结果:在活体外,PG,PMG,木聚糖酶活性先增加后降低到后期基本不变,Cx,β-G酶活性随着培养时间的增加而持续升高。在活体内,9株潜在性致病内生真菌均能在组培苗根部组织产生细胞壁降解酶,但不同菌种差异较大。其中7株菌接种的组培苗根部Cx,β-G活性显著高于未接菌的根部(P0.05),6株菌接种的组培苗根部PG活性显著高于未接菌的根部(P0.05),9株菌接种的组培苗根部PMG以及木聚糖酶活性显著高于未接菌的根部(P0.05)。结论:Cx,β-G和PG,PMG以及木聚糖酶在潜在性致病内生菌的致病过程中起到了重要作用,是重要的致病因子,但各潜在性致病内生真菌的作用环节存在差异。     

长春花叶片愈伤组织诱导及培养过程中生物碱合成类型的变化和调节及有关酶的分析

在４种不同培养基上诱导长春花叶片愈伤组织发生的过程中,叶片中含量较高的文多灵（ｖｉｎｄｏｌｉｎｅ）和长春质碱（ｃａｔｈａｒａｎｔｈｉｎｅ）迅速降解至极低水平,而在叶片中含量较低的阿玛碱（ａｊ－ｍａｌｉｃｉｎｅ）和蛇根碱（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）的合成却逐渐增加,同时酸性和碱性过氧化物酶（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）活性呈上升趋势,尤其碱性过氧化物酶与蛇根碱和阿玛碱的相关性较密切。光照和黑暗中的变化趋势基本一致,但光照可提高过氧化物酶的活性,对培养物的长春质碱、文多灵和蛇根碱的合成有利。不同的培养基对生物碱的合成影响较大,２,４－Ｄ显著抑制生物碱的合成,持续光照使愈伤组织的生长受到抑制,使阿玛碱向其蛇根碱转化。     

甲基茉莉酮酸对悬浮培养南方红豆杉细胞自由基清除系统酶的影响

目的：研究外加甲基茉莉酮酸对南方红豆杉Taxus chinensis var.mairei细胞培养体系氧自由基清除系统中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）酶活性的影响规律。方法：酶活分析技术。结果：甲基茉莉酮酸能够诱导南方红豆杉细胞SOD的活性，对POD活性的诱导作用极为显著（约为对照组的10倍），且POD活性在培养第10天达到峰值，在甲基茉莉酮酸作用下CAT活性先升高后降低，即在表现出较强的诱导作用之后又抑制了CAT的酶活性水平，结论：甲基茉莉酮酸的加入刺激细胞产生了防御应答反应，诱导了相关的自由基清除酶类，其中POD对甲基茉莉酮酸的信号转导贡献最大。     

纤维蛋白酶谱检测蚯蚓纤溶酶组分

 目的建立鉴定蚯蚓纤溶酶粗酶液中活性组分的方法。方法根据蚯蚓纤溶酶能水解纤维蛋白的性质,建立了纤维蛋白-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Fibrin-SDS-PAGE),优化了电泳条件,电泳后酶所在部位为透明区带。结果分离胶中纤维蛋白终质量浓度为0.4×10^-3mg·L^-1,电泳后胶板用2.5% TritonX-100复性30min,PBS缓冲液(pH7.2)保温30min,考马斯亮蓝R-250染色,7%醋酸脱色,可以得到清晰的酶谱。结论该方法灵敏度高,用2μg样品,就能准确检测出粗酶液中所有纤溶酶组分。     

金钗石斛中生物碱与多糖联合酶提工艺的优化

目的优化金钗石斛中生物碱与多糖的联合酶提工艺。方法以加酶量、酶解温度、酶解时间、料液比为影响因素,石斛碱、总生物碱、多糖含有量为评价指标,正交试验优化联合酶提工艺。结果木瓜蛋白酶提取的最佳条件为加酶量0.10 g,酶解温度45℃,酶解时间2 h,料液比1∶50,石斛碱、总生物碱、多糖含有量分别为3.495 5、4.341 8、35.898 7 mg/g;纤维素酶提取的最佳条件为加酶量0.30 g,酶解温度50℃,酶解时间2 h,料液比1∶40,3种成分含有量分别为3.514 8、4.351 3、36.331 2 mg/g;果胶酶提取的最佳条件为加酶量0.45 g,酶解温度55℃,酶解时间2.5 h,料液比1∶40,3种成分含有量分别为3.524 4、4.452 8、26.324 2 mg/g。结论该方法稳定、可靠、快速,可用于联合酶提金钗石斛中生物碱与多糖。     

砒霜酶解工艺研究

目的:研究砒霜有效成分三氧化二砷(As2O3)的最佳酶解工艺。方法:本实验研究所用试剂为分析纯的As2O3,采用半仿生酶解法,按照进入消化系统顺序,先筛选出仿胃的最佳酶解工艺,在此基础上进行仿肠酶解。以酶底比、酶解时间和pH值为考察因素,设计正交试验,用二乙基二硫代氨基甲酸银法测定可溶解的相对砷离子含量,以砷转化率为指标,选择最佳酶解工艺。结果:仿胃以A2B1C2酶解后砷转化率最高,仿肠以A2B2C3酶解后砷转化率最高。结论:仿胃在pH<2.0的环境,酶底比为1,酶解时间为60min的酶解工艺最佳,砷的转化率最高。仿肠在pH=7.5,酶底比为1.5,酶解时间为360 min时的酶解工艺最佳,砷转化率最高。