不同剂量碱性成纤维细胞因子对人类胚胎干细胞生长、凋亡和DNA完整性的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)浓度对人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)特性的影响.方法 建立化学限定性hESCs培养体系,以有饲养细胞培养体系作为参照,比较4、40 ng/ml和100 ng/ml bFGF对hESCs多能性标记、细胞周期、细胞凋亡和DNA完整性的影响.结果 ①低浓度bFGF(4 ng/ml)足以维持hESCs在化学限定性培养基(基础培养基DMEM/F12,N2,B27, 简称 NB 体系)中培养;②bFGF可以抑制hESCs细胞凋亡,且具有剂量依赖性,而对hESCs细胞周期没有影响;③bFGF有助于hESCs DNA完整性维持,在NB体系加入4 ng/ml bFGF时,hESCs在DNA水平上存在75个异常区域,而在加入40 ng/ml bFGF时,只存在1个异常区域.结论 高剂量bFGF有助于hESCs体外快速扩增和hESCs DNA完整性维持.提高bFGF浓度为hESCs体外培养所必需.     

人胚胎干细胞体外培养及特性分析

目的探讨人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)的体外培养及其特性。方法 hESCs接种于饲养层细胞,培养液为含20%Knockout SR的Knockout DMEM,其中添加10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),通过观察细胞形态、免疫细胞化学技术分析hESCs表面标志分子SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1和TRA-1-60的表达,鉴定hESCs的未分化状态;G显带技术分析细胞染色体核型。同时,通过分析hESCs体外形成胚胎体、体内生成畸胎瘤的情况,鉴定hESCs的分化潜能。结果 hESCs在饲养层细胞上呈克隆生长,细胞为二倍体核型。hESCs表达SSEA-3、SSEA-4、以及TRA-1-60细胞表面特征性标志。体内、外分化实验证实hESCs具备多分化潜能。结论 hESCs在体外培养条件下能够保持未分化状态和发育的全能性,为进一步探索hESCs的诱导分化,以及hESCs的应用研究提供可行性保证。     

一种新的培养人胚胎干细胞的包被基质

目的 开发一种新的培养人胚胎干细胞（hESCs）的包被基质,使hESCs的培养更加简便.方法 用甲醇固定的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为包被基质,人胚胎干细胞系X-01在该基质上生长,每隔5～6 d传代一次,培养10代后,对人胚胎干细胞特性进行检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达和分化能力.结果 hESCs在新的基质上生长良好,经10次传代后仍能保持典型的hESCs克隆形态.碱性磷酸酶染色阳性,免疫荧光染色 Oct4、SSEA4、Tra-1-60 为阳性,体外分化可形成拟胚体.结论 此种固定的基质可以大量制备,长期保存,并可以长期维持hESCs的未分化状态,为人胚胎干细胞的体外扩增探索出了一个新的途径.     

稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立

目的:建立可以稳定表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)系?方法:优化核转染方法后,将RFP表达载体pEF1α-DsRed-Express2导入hESCs中?利用碱性磷酸酶染色?RT-PCR?免疫荧光染色和类胚体形等方法,比较核转染前后hESCs的干细胞特性?结果:核转染后hESCs的碱性磷酸酶染色结果为阳性?核转染前后hESCs的Oct4?Sox2?Klf4?Nanog基因的表达未出现明显差异?RFP-hESCs具有三胚层分化潜能,并且可稳定传30代以上?结论:成功建立稳定表达红色荧光蛋白的hESCs,干细胞特性不受RFP的影响,可用于后续的实验研究?     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

体外直接诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的探讨体外直接诱导HSF6人胚胎干细胞(humanem bryonic stem cells,hESCs)分化为神经细胞的方法。方法采用直接的方法,在1%血清培养条件下,顺序添加bFGF、RA和Forskolin,诱导HSF6人ESCs分化为神经细胞。结果细胞发生神经样形态学改变,免疫荧光细胞化学分析结果显示,分化细胞表达神经干细胞特异性标志分子——巢蛋白(nestin),以及神经元标志分子——β微管蛋白Ⅲ(neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin,TuJ1)。实验组nestin阳性细胞数占(95.2±3.03)%,明显高于未添加诱导因子组的(31.6±4.93)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究直接诱导hESCs分化为神经细胞,减少了常规经胚胎体(embryoid body,EB)的诱导方法而产生其它胚层细胞的机会,为进一步探索hESCs源性神经细胞的功能,以及为细胞替代治疗提供高纯度的hESCs源性神经细胞奠定了基础。     

无饲养细胞无外源因子条件下高克隆密度 维持人类胚胎干细胞自身未分化状态

目的：建立人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）无饲养细胞无外源性细胞因子体外培养体系。方法：比较hESCs克隆种植密度对其无饲养细胞无外源性细胞因子体外培养的影响,以及克隆种植密度对hESCs培养体系骨形蛋白(bone morphology protein, BMP)样诱导活性的影响。结果：在没有外源性细胞因子条件下,高克隆密度（34克隆/cm2）可以维持hESCs处于未分化状态,而低克隆密度不能维持hESCs处于未分化状态。同时, NB体系BMP样诱导活性可以被hESCs克隆种植密度所改变,高hESCs克隆密度时,培养基具有高的BMP样诱导活性。结论：高hESCs克隆种植密度可以改变自身生长的微环境,可以维持自身未分化状态,这?鱤ESCs自身未分化状态机制和简化hESCs无饲养培养体系提供了新的思路。     

Plasmocin对人胚胎干细胞支原体污染的杀灭效果

目的人胚胎干细胞(hESCs,human embryonic stem cells)应用广泛,但来源有限。前期检测发现本室培养的H9 hESCs有支原体污染。本研究拟探讨高效支原体杀灭剂plasmocin去除hESCs支原体污染的可能性,及其对hES增殖、分化的影响。方法常规培养hESCs细胞,用切割法进行传代。分别用低(12.5μg/ml)、中(25μg/ml)、高(37.5μg/ml)浓度plasmocin处理hESCs 2～3周,用PCR法检测支原体,用结晶紫染色观察hESCs克隆大小,显微镜下观察hESCs分化状况。结果低、中、高浓度plasmocin处理2周均不能杀灭hESCs的支原体,延长高浓度plasmocin处理时间至3周,亦未能杀灭支原体。实验发现,plasmocin呈剂量依赖性抑制hESCs增殖,且高浓度plasmocin可诱导hESCs分化,而高浓度bFGF(40 ng/ml)则能部分阻断plasmocin抑制增殖和诱导分化的作用。结论plasmocin未能去除hESCs的支原体污染,可能与支原体产生抗药性及hESCs的克隆生长特性有关。     

改良三维条件下人胚胎干细胞向内皮细胞的分化及功能

目的建立一种改良的三维分化无血清方法,对人胚胎干细胞(hESCs)向内皮细胞进行分化,并对这种方法得到的人胚胎干细胞来源内皮细胞(hESC-ECs)进行功能检测。方法在低附着培养皿中培养未分化的H9 hESCs12 d,使其形成类胚体(EBs),12 d后将已形成的EBs收集起来,用浓度为1.5 mg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原重悬,加入六孔板中,在37℃待胶原凝固后加入EGM-2培养基培养3 d,获得出芽类胚体后用0.25%胶原酶Ⅰ和0.56 U/ml LiberaseBlendzyme消化芽生类胚体各20 min,采用流式技术分选出其中CD31阳性的细胞,并用乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)摄取实验和成管实验验证这部分细胞的内皮细胞功能。结果建立了一种基于胶原培养环境的三维分化方法,采用这种方法能够将hESCs向内皮细胞分化的效率提高到18%,最终获得的hESC-ECs具有和人脐带静脉内皮细胞(HU-VECs)相似的细胞表面标志物,并在乙酰化LDL吞噬实验和血管新生实验中表现出良好的内皮细胞功能。结论建立的改良三维分化方法能够明显提高hESCs向内皮细胞的分化效率,是一种简单高效的分化方法,同时无血清培养方法为将来hESC-ECs的临床应用提供了可能。     

小分子化合物诱导人胚胎干细胞分化为角膜上皮样细胞

背景 角膜缘干细胞缺乏是角膜盲的主要病因,种子细胞来源有限是细胞移植疗法的瓶颈.目的 诱导人胚胎干细胞(human?embryonic?stem?cells,hESCs)分化为角膜上皮祖细胞和成熟的角膜上皮细胞(corneal?epithelial?cells,CECs).方法 采用拟胚体联合小分子化合物(SB5051...     

人类胚胎干细胞的建系与维持

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)来源于哺乳动物囊胚的内细胞团(inner cell mass,ICM),在体外有自我更新和全能分化的能力,并保持完整的染色体结构.自从建立小鼠胚胎干细胞(murine embryonic stem cells,MESC)系以来[1],ESC的研究引起了广泛的关注.1998年Thomerson从植入前囊胚建立了人类胚胎干细胞(humanESC,HESC)系[2],此后,有关HESC的研究取得了极大的进展.     

三维培养hESCs来源视杯样组织中c-kit和SSEA-4的时空表达特点研究

目的 研究人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)三维培养后形成的视杯样组织中c-kit和SSEA4表达的时空特性.方法 H1人胚胎干细胞行三维培养和神经诱导分化,在分化7、14、21、30、49、70、90 d固定组织并行免疫荧光鉴定检测c-kit和SSEA-4的表达,同时在相应时间点将分化组织消化成单细胞行流式细胞仪检测验证.结果 三维培养第14天可见Rax+视泡(optic vesicle,OV)样结构,第30天形成具有内层Pax6+、外层Mitf+的双层视杯样(optic cup,OC)结构,第90天可见部分Crx+细胞.c-kit主要表达于hESCs来源OV状及OC状的神经上皮样结构中,SSEA-4早期均匀表达于整个组织,晚期则主要集中于周边部.c-kit+细胞比例呈先升高(P＜0.01)后下降(P＜0.01)趋势,并在分化14 d达40％的峰值.SSEA-4+细胞比例从分化0d至70 d持续下降(P＜0.01),直到90 d一直维持于该低水平.结论 在三维培养hESCs来源OV或OC状组织中,c-kit基因随诱导分化而激活,且主要表达于神经上皮层,呈先增高后下降趋势.SSEA-4早期高表达于整个组织,之后逐渐减少至周边部并维持于低水平状态.     

人胚胎干细胞来源角膜上皮样细胞用于治疗兔角膜缘干细胞缺乏

目的 通过小分子化合物诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)分化为角膜上皮样细胞，观察角膜上皮样细胞治疗兔角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)的效果。方法 利用拟胚体联合小分子化合物方法，将hESCs H9细胞系向角膜上皮样细胞分化，将角膜上皮样细胞在去上皮羊膜片上培养构建重组细胞膜片。选取造模成功的12只LSCD兔，按照随机数表法分为对照组和实验组，对照组接受去上皮的的羊膜片治疗，实验组接受角膜上皮样细胞膜片移植治疗。术后通过裂隙灯、前节照相等方法，对角膜透明度、新生血管、荧光素钠染色情况进行评分，并于移植后4周观察角膜病理切片结构。结果 成功将hESCs诱导为角膜上皮样细胞，细胞形状和结构类似角膜上皮细胞。病理结果显示，实验组的角膜形成复层上皮结构，上皮下炎症细胞浸润轻，治疗效果明显优于对照组。进行细胞移植治疗后发现，实验组的角膜透明度高、新生血管少，角膜评分明显优于对照组(P<0.05)。诱导后的角膜上皮样细胞的角膜上皮标记物ΔNP63和CK12的表达与hESCs H9相比差异...     

可分化为肝系细胞的干细胞

干细胞是一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞 ,可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。Evans等[1] 1981年首次建立了小鼠的胚胎干细胞系 ,之后国外相继建立了金黄地鼠 (Goldenhamster;Mesocricetusauratus)、大鼠、鸡、兔、猪和猴的胚胎干细胞系。 1998年美国的Thomson等[2 ] 和Gearhart等[3] 分别建立了人的胚胎干细胞 (embryonicstemcell,ES细胞 )和胚胎生殖干细胞 (embryonicgermcell,EG细胞 )系 ,干细胞研究被Science杂志评为 1999年十大进展的首位。利用干细胞可培育新组织和新器官 ,供移植和替代治疗之用 ,另外还可将干细胞作为…     

单细胞克隆小鼠胚胎干细胞系的建立

目的:建立胚胎干细胞的培养系统及培养方法.方法:用免疫溶解法(immunosurgery)分离3.5 d的129SvJ系小鼠囊胚内细胞团,在γ射线照射的胎鼠成纤维细胞饲养层上培养,胰酶消化传代.用组织化学法、免疫组织化学方法识别细胞表面标志,常规G带法行染色体核型分析,在体、离体分别观察细胞的多向分化能力.结果:得到一个单细胞克隆129系小鼠胚胎干细胞系G11能长期稳定增殖不分化,具有正常40XY核型,碱性磷酸酶阳性、SSEA-1阳性,在体和离体条件下可分化为多种细胞.结论:以小鼠为模型成功建立了哺乳动物胚胎干细胞的培养方法和培养系统.     

胚胎干细胞自我更新的信号转导途径和体外培养系统的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）主要来自囊胚内细胞团及受精卵发育至桑堪胚之前的早期胚胎细胞，或从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞以及体细胞核转移至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞.自1981年Evans和Kaufman等成功地分离、建立了小鼠胚胎干细胞系以来，历经将近20年，第一株人ES细胞系在美国威斯康星大学成功建立。同年，另一研究小组用流产胎儿性腺成功地分离和培养了人胚胎生殖细胞系（embryonic germ cells，EG细胞）.     

胚胎干细胞的体外培养及分化的研究现状和前景

胚胎干细胞(Embryonicstemsell,ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(Innercellmass,ICM)或原始生殖细胞(Primordialgermcell,PGCs)经体外分化抑制培养分离克隆的,ES细胞在组织工程、基因治疗和发育生物学等的应用研究中起着重要作用。本文介绍了ES细胞的生物学特点及国内外研究进展和动态,阐明了建立ES细胞系的技术要点以及它的应用前景。     

人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维样细胞作为饲养层体外培养人胚胎生殖细胞方法的建立

目的： 研究以来源于人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜的成纤维样细胞为饲养层，体外培养人胚胎生殖细胞(hEG)。方法： 分离培养孕5～9周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜中的成纤维样细胞，以该细胞作为饲养层，体外原代培养来源于孕5～9周人胚胎的生殖腺嵴和肠背系膜组织的hEG。免疫荧光染色法、碱性磷酸酶染色法和体外分化实验用于鉴定所培养的hEG。结果： 成功分离培养人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜来源的成纤维样细胞，可传至25代以上，并保持状态稳定，3～15代人胚胎成纤维样细胞用于制备饲养层。21例hEG原代培养中，有7例获得明显增殖的hEG细胞集落，目前传到第10代，仍然保持碱性磷酸酶、胚胎阶段性表面抗原(SSEA)-1、SSEA-4和POU 转录因子Octamer-4 (Oct-4)的表达为强阳性，并具有向3个胚层细胞分化的能力。结论：成功利用人胚胎生殖腺嵴和肠背系膜的成纤维样细胞作为饲养层细胞，获得了能够增殖并保持未分化状态和多向分化潜能的hEG，建立了一种新的hEG培养方法，为hEG的体外培养建系奠定基础。     

4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导 多能性干细胞系的建立及其鉴定

目的：利用人类胚胎成纤维细胞(human embryonic fibroblast cells, hEFs)获得诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)系并对其全能性进行鉴定。方法：本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分析。结果：所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似。经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染。结论：4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究。     

人胚胎干细胞体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗NOD/SCID糖尿病小鼠

目的 探讨人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）体外定向诱导分化胰腺前体细胞及胰岛细胞移植治疗非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient,NOD/SCID）小鼠的可行性.方法 体外分4阶段诱导hESCs定向分化为胰岛细胞：①诱导分化形成定型内胚层;②诱导胰腺细胞定向分化;③扩增胰腺前体细胞;④促进胰岛细胞成熟.观察诱导各阶段细胞形态变化、免疫荧光鉴定胰十二指肠同源异型盒基因（PDX-1）、胰高糖素（glucagon）、胰岛素（insulin）、C肽（C-peptide）、葡萄糖转运子2（Glut-2）的表达.3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入链脲菌素（streptozotocin,STZ）诱导形成的NOD/SCID糖尿病小鼠一侧附睾脂肪垫内,观察血糖变化.结果 hESCs诱导4阶段细胞表达胰高血糖素、胰岛素、Glut-2;共表达PDX-1和C肽;流式鉴定诱导4阶段胰岛素阳性细胞为17.1％;体外检测有葡萄糖刺激的胰岛素释放反应;3阶段及4阶段分化形成的细胞分别植入NOD/SCID 糖尿病小鼠体内可逆转其高血糖至少12周.结论 体外定向诱导hESCs分化形成的胰腺前体细胞及胰岛细胞分别植入NOD/SCID小鼠可逆转其高血糖.