不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平测定

目的：检测不同品系SV40T转基因小鼠血浆胃泌素水平。方法：取已建立的8个品系SV40T转基因小鼠和B6小鼠空腹血,应用ELISA法检测血浆胃泌素水平。结果：B6小鼠、2#、4#、16#、24#、51#、57#、61#和73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平（μg/L）分别为（2.814±0.209）、（1.135±0.114）、（0.853±0.701）、（2.371±0.335）、（1.371±0.190）、（0.685±0.374）、（2.274±0.251）、（2.471±0.251）和（0.986±0.173）,9组相比,差异有统计学意义（F=17.449,P〈0.001）;其中2#、4#、24#、51#及73#品系转基因小鼠血浆胃泌素水平较B6小鼠明显降低（P〈0.05）。结论：筛选出了5个稳定表达的SV40T转基因小鼠品系。     

条件性SV40 TAg转基因小鼠模型的建立

目的 建立可调控的脑组织特异性表达SV40 TAg的转基因小鼠模型.方法 构建由大鼠神经元特异性烯醇化酶基因(rat neuron-specific enolase, NSE)启动子驱动四环素基因表达调控系统的载体,从而控制SV40 TAg基因的表达;受精卵雄原核显微注射该线性化载体制备转基因小鼠;PCR方法鉴定首建鼠;RT-PCR方法检测小鼠组织中四环素反式激活子(rtTA)及SV40 TAg基因的表达情况.结果 显微注射获得17个首建鼠,其中的6个首建鼠建系成功;1#、6#品系小鼠的脑组织中表达rtTA基因;强力霉素诱导后,可检测到6#品系小鼠脑组织中SV40 TAg基因的特异性表达.结论 可调控的脑组织表达SV40 TAg的转基因小鼠模型已经建立.     

SV40T抗原真核表达载体的构建及表达

目的:构建SV40T抗原的特异性真核表达载体,并导入胃癌细胞株SGC7901进行表达鉴定.方法:扩增小鼠H /K ATPase β亚基启动子,与pMT18-T载体相连,并将其亚克隆至真核表达载体 pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/HK; 从含有SV40T基因的pLITAg质粒酶切回收SV40T基因,与pcDNA3.1(-)/HK相连,构建胃壁细胞特异性表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV,同时构建非特异性表达载体pcDNA3.1(-)/SV,进行酶切及测序鉴定.用脂质体转染的方法将构建的载体导入胃癌细胞株SGC7901,PCR扩增基因组DNA,RT-PCR检测SV40T mRNA的表达.结果:限制性内切酶分析与测序结果显示,真核表达载体pcDNA3.1/HKSK构建成功;转染该载体的SGC7901细胞可检测到SV40T基因DNA的存在,且有SV40T mRNA的表达.结论:特异性表达SV40T基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)/HKSV构建成功.     

SV40大T抗原在人脑肿瘤中的表达

目的　探讨 SV40早期区域基因编码产物大 T抗原(Tag)的表达及与抑癌蛋白 p5 3,p Rb的相互作用在人脑肿瘤发生发展中的意义 .方法　采用免疫共沉淀结合银染色及Western印迹法检测 6 5例人脑肿瘤及 8例正常人脑组织中Tag的表达 ,并对 18例和 15例 Tag阳性瘤组织分别检测Tag- p5 3和 Tag- p Rb复合物的形成 .结果　 SV40 Tag在人脑肿瘤中广泛表达 ,阳性率为 6 6 % (4 3/ 6 5 ) ,而 8例正常人脑组织均无 Tag表达 ,二者差异显著 (P<0 .0 5 ) ;分别检测 18例和 15例 Tag阳性瘤组织 ,均发现 Tag可与 p5 3,p Rb形成特异性复合物 .结论　 SV40 Tag的表达与人脑肿瘤的发生有一定关系 ;SV40 Tag与 p5 3,p Rb形成特异性复合物并导致其失活 ,可能是 SV40致人脑肿瘤发生的一个重要机制 .     

SV40大T抗原对人皮肤成纤维细胞生物学行为的影响

目的：研究SV40大T抗原（LT）基因对人正常皮肤成纤维细胞体外转化作用，以及转化后细胞生物学特性的改变。方法：采用脂质体介导的方法。利用含有LTcDNA的质粒psv3-neo转染人正常皮肤成纤维细胞。G418筛选后，挑选阳性克隆扩大培养，观察基因及蛋白在细胞内的表达。以及对细胞增殖等生物学特性的改变情况。结果：分离获得转化细胞克隆，原位杂交显示LTmRNA在转染细胞质中表达。免疫组化结果显示，细胞质中有SV40大T抗原表达。细胞计数，BrdU，流式细胞仪检测表明，经过一段时间的旺盛生长，在转染后第16代，细胞即进入危机期，以一种比衰老细胞更快的速度死亡。结论：LT可以促进正常皮肤成纤维细胞增殖，但这种能力是有限的，在转染后期甚至会促进细胞死亡，所以要使人的正常皮肤成纤维细胞永生化，单纯利用LT的转染是不够的，还需要结合其它的转化方式。     

纯合子NEOr转基因小鼠品系的建立及鉴定

目的　建立清洁级Neor 转基因小鼠纯合子品系。方法　通过胚胎移植生物净化方法获得 1 0只清洁级NeorF1 小鼠 ,按孟德尔遗传法则交配 ,用PCR、Southernblot杂交和交配实验检测相结合的方法筛选纯合子。结果　选育出 4只纯合子 ,并建系。该纯合转基因小鼠与野生型小鼠交配制备的胎儿成纤维细胞具有G4 1 8抗性 ,可作为ES细胞基因打靶培养中的饲养层细胞。结论　通过微生物学和遗传学上对Neor 转基因小鼠进行质量控制 ,使Neor 转基因小鼠达到了清洁级 ,并建立纯合子品系。     

Tet-on诱导表达c-myc和SV40Tag的转基因小鼠肿瘤模型

目的 研究Tet-on诱导表达c-myc和SV40Tag小鼠肿瘤模型的肿瘤发生和基因表达情况,探讨c-myc基因的作用.方法 用pTRE2-c-myc单阳性转基因小鼠和Tet-on、pTRE2-SV40Tag双阳性转基因小鼠交配,后代检测得到Tet-on、pTRE2-SV40Tag、pTRE2-c-myc三阳性转基因小鼠,经强力霉素诱导一段时间以后,观察肿瘤的发生;通过RT-PCR、病理组织切片和磁共振等方法对肿瘤的发生部位和时相进行研究.结果 Tet-on、pTRE2-SV40Tag、pTRE2-c-myc三阳性转基因小鼠①经诱导后发生肿瘤,且发瘤率和发瘤时间高于和短于Tel-on、pTRE2-SV40Tag双阳性转基因小鼠;②c-myc和SV40Tag基因在表达部位上有所不同.结论 c-myc和SV40Tag基因同时表达与SV40Tag基因单独表达时相比,肿瘤发生明显增强,提示c-myc基因与肿瘤的发生有着密切关系.     

十全大补汤对SV40T抗原转基因小鼠晶状体自发肿瘤的抑制作用及其分子机制

目的：探讨十全大补汤对SV40 T抗原转基因（TG）小鼠晶状体自发肿瘤的抑制作用,阐明其抑癌的分子机制。方法：SV40 T抗原TG小鼠随机分为对照组（n=39）和药物处理组（n=25）,对照组小鼠正常喂食,药物处理组小鼠出生3周后开始喂食添加十全大补汤的饲料,记录每只小鼠生存时间。在喂食十全大补汤8周和15周时,随机抽取各组小鼠（n=3）尾静脉血,检测血清氨基酸水平。取血后小鼠麻醉致死并取出肝脏,利用基因芯片杂交检测小鼠肝脏组织中与核糖体功能相关的基因表达差异。结果：生存分析,与对照组比较,药物处理组TG小鼠生存率明显升高（P<0.05）。氨基酸检测,与对照组比较,喂食十全大补汤8周时,药物处理组TG小鼠血清中丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和羟赖氨酸水平升高（P<0.05）,胱硫醚、牛磺酸、甲基组氨酸、肌肽和乙醇胺水平降低（P<0.05）;15周时,与对照组比较,药物处理组TG小鼠血清中苏氨酸和瓜氨酸水平升高（P<0.05）,其他氨基酸水平无明显变化（P>0.05）。基因芯片杂交检测,与对照组比较,药物处理组TG小鼠肝组织表达的9 083个基因中与核糖体功能相关的13个基因发生改变（P<0.05）。结论：十全大补汤能改善TG小鼠血清氨基酸水平,增强肝脏核糖体蛋白合成,通过改善肝脏功能明显延长TG小鼠生存期。     

两种含SV40T不同区段的基因构建及其转基因小鼠的建立

目的　为解决SV4 0T转基因小鼠高发瘤难保种的问题 ,构建了两种含有SV4 0T不同区段的外源基因 :Rb结合域点突变的SV4 0T基因 (SV4 0T DRb)和无p5 3结合域的SV4 0T基因 (SV4 0T Dp5 3)。方法　利用分子生物学的基因克隆手段 ,将改造的SV4 0T基因片段克隆测序 ,最终将这两个改造后的基因克隆进乳腺特异性的真核表达载体p2 0 5C3中 ,运用雄原核显微注射法制备转基因小鼠。结果　利用PCR方法检测出 6只双阳性转基因 (同时检测到SV4 0T DRb和SV4 0T Dp5 3两种基因 )小鼠 ,为避免检测结果中假阳性的发生 ,应用Southern blot方法检测出 1只双阳性转基因小鼠。结论　本试验的结果证明 ,构建的两种含SV4 0T不同区段的策略是成功的 ,其建立的阳性转基因小鼠确实是弱化了SV4 0T转基因小鼠高发瘤的特性。     

乙肝病毒转基因小鼠品系的建立和饲养管理

采用受精卵原核显微注射的方法，成功获得稳定整合乙肝病毒基因组ＤＮＡ的转基因小鼠。经ＰＣＲ、Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ或Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ等方法检测确认后的阳性鼠通过近交或回交的方式现已繁育到第７代，有望育成乙肝病毒转基因小鼠品系。     

带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体的构建

目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒.     

SV40T基因介导的永生化对细胞生物学特性的影响

目的研究SV40 T基因对其诱导的永生化细胞系细胞表型的影响。方法以手术切除的卵巢肉瘤样癌腹壁转移组织为材料,进行体外培养。将永生化基因———SV40 T抗原基因转染第10代细胞,经筛选,抗性克隆扩大培养,得到永生化细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、双层软琼脂培养、裸鼠接种、免疫组化等,研究转染与未转染细胞的生物学特性,通过四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)在相同条件下检测转染与未转染细胞对顺铂、阿霉素、足叶乙甙、拓扑替康四种化疗药物的敏感性。结果建立人卵巢肉瘤样癌细胞系,命名为BUPH:OVSC-1。经SV40 T抗原基因转染,建立人卵巢肉瘤样癌永生化细胞系,命名为BUPH:OVSC-2,两者均已长期稳定传代。通过比较,两者的生物学特性无明显差别,对不同化疗药物的敏感性无明显差别。结论SV40 T基因永生化的细胞保留了原细胞的分化表型,SV40介导的永生化细胞系可作为体外研究的模型。     

SV40LT抗原介导的人源性肝细胞系的构建

目的：建立人源性永生化肝细胞系，为生物人工肝和肝细胞移植等提供合适的细胞源。方法：利用SV40L Tag基因和真核表达载体pcDNA3．1(-)经脂质体转染至来源于25岁男性脑死亡供肝的原代培养细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能。结果：经G418 700～300μg／ml筛选，42天后获一抗G418永生化肝细胞系。该细胞系呈单层贴壁、上皮细胞样形态生长。体外培养可无限传代，具有分泌ALB、ALT、AST及LDH的功能。超微结构观察发现，转染肝细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征，如较大的细胞核、胞浆内含有丰富的糖原颗粒、大量的线粒体和粗面内质网等。经RT—PCR和Westernb lot检测，转染肝细胞的ALB mRNA阳性和细胞色素P450 2E1阳性。结论：新建人源性肝细胞系与原代培养肝细胞具有类似的形态学特征和生物学功能。     

Cre/LoxP 系统联合SV40 LTag 诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立

 目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体（SSR69）转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag 的永生化成纤维细胞;用表达Cre 重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin 在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag 的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞（P < 0.05）,在体外培养传代>25 代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异（P > 0.05）,无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag 可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系     

Bcl-2高表达小鼠模型的建立

目的 建立Bcl-2高表达的转基因小鼠品系,为在活体动物上研究bcl-2蛋白的功能提供动物模型.方法 构建含人Bcl-2基因的质粒;通过显微注射将该质粒转入C57BL/6J×CBA的杂交小鼠的受精卵,并植入假孕母鼠的子宫,PCR检测后携带人Bcl-2基因的小鼠即为“Founder”鼠;将“Founder”鼠与C57BL/6J×CBA杂交小鼠不断回交,经PCR和Western bilotting筛选后即可获得阳性小鼠.结果 共获得5只“Founder”鼠,其中#6、#14成功建系,连续回交繁殖7代后,PCR和Western筛选后获得bcl-2高表达阳性小鼠42只.结论 成功将人bcl-2基因转入小鼠基因组内,并稳定传代,建立Bcl-2高表达小鼠,为进一步研究Bcl-2蛋白提供了很好的动物模型.