杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶在真核细胞中的表达

目的:分别构建杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶(DsGPI)绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。方法:PCR扩增得到上、下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的DsGPI基因,双酶切后与绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1连接,得到重组载体pEGFP-C1-DsGPI,转染狗肾细胞MDCK,观察绿色荧光蛋白在细胞中的定位;同理将上、下游分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的DsGPI基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,得到pcDNA3.1-DsGPI,转染食管癌EC9706细胞,分别应用RT-PCR法和Westernblot法检测DsGPI mRNA和蛋白的表达。结果:DsGPI在MDCK细胞中定位于细胞核,在EC9706细胞中被有效表达。结论:成功构建了DsGPI的绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。     

类风湿性关节炎中葡萄糖-6-磷酸异构酶的检测及其临床意义

目的研究类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）中葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原（glucose-6-phospbate isomerase，GPI）的检测及其临床意义。方法用ELISA方法分别对87例RA患者、40例其他自身免疫性疾病患者和72例正常人的血清进行GPI抗原检测；用免疫透射比浊法检测类风湿因子（rheumatoid factor，RF）。结果GPI抗原在RA中有59例阳性，阳性率为67．82％，在其他自身免疫性疾病中有1名，阳性率为2．50％，在正常人中全部阴性。RF在RA中有66名阳性，阳性率为75．86％，在其他自身免疫性疾病中有9例，阳性率为22．50％，在正常人中有8名，阳性率为11．11％。GPI抗原和RF对RA的特异性分别为99．11％和84．82％。GPI的敏感性与RF无明显差别（P〉0．05），而特异性显著高于RF（P〈0．01）。结论GPI抗原是检测RA的一项特异性很高的血清学指标，检测GPI抗原可能成为诊断RA患者的一个新的实验诊断指标。     

类风湿性关节炎中葡萄糖-6-磷酸异构酶的检测及其临床意义

目的 研究类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)中葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原(glucose-6-phospbate isomerase,GPI)的检测及其临床意义.方法 用ELISA方法分别对87例RA患者、40例其他自身免疫性疾病患者和72例正常人的血清进行GPI抗原检测;用免疫透射比浊法检测类风湿因子(rheumatoid factor,RF).结果 GPI抗原在RA中有59例阳性,阳性率为67.82%,在其他自身免疫性疾病中有1名,阳性率为2.50%,在正常人中全部阴性.RF在RA中有66名阳性,阳性率为75.86%,在其他自身免疫性疾病中有9例,阳性率为22.50%, 在正常人中有8名,阳性率为11.11%.GPI抗原和RF对RA的特异性分别为99.11%和84.82%.GPI的敏感性与RF无明显差别(P》0.05),而特异性显著高于RF(P《0.01).结论 GPI抗原是检测RA的一项特异性很高的血清学指标,检测GPI抗原可能成为诊断RA患者的一个新的实验诊断指标.     

高水平葡萄糖-6-磷酸异构酶与类风湿性关节炎活动度的关系

目的检测活动性类风湿性关节炎(RA)患者血清中葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)含量,研究高水平葡萄糖-6-磷酸异构酶与类风湿性关节炎活动度的关系。方法应用ELISA方法检测89例活动性RA患者、20例骨关节炎患者,20例2-DM患者和30例健康志愿者血清GPI含量,同时检测活动性RA患者血清抗CCP抗体、AKA、RF、CRP、C3和C4。用Spearman’s rho相关分析评价GPI与RA病情活动指标之间的相关性。结果 RA患者组血清中GPI含量为8.33(0.21～4.53)mg/L,明显高于骨关节炎组(0.88±0.68)mg/L、2-DM组0.12(0.05～0.16)mg/L和正常对照组(0.09±0.02)mg/L。GPI含量与DAS-28、RF、ESR、疼痛关节数、关节肿胀疼痛加重时间以及α-胞衬蛋白呈明显正相关关系。结论血清GPI是辅助诊断RA有价值的指标,亦是反映RA病情活动状态的实用指标。     

葡萄糖-6-磷酸异构酶水平测定与类风湿关节炎早期诊断

目的：探索葡萄糖-6-磷酸异构酶（glucose-6-phosphate isomerase,GPI）水平测定对于日常门诊中类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）早期诊断的意义,及其与RA疾病活动度的相关性。方法： 选择2010年至2012年北京大学人民医院风湿免疫科门诊中有多关节肿痛表现的关节炎患者1 051例,选取健康人90例作为对照,ELISA法检测其血清GPI水平,根据临床特点及辅助检查,符合类风湿关节炎分类标准的RA患者525例,其余患者包括骨关节炎（osteoarthritis, OA）患者134例、血清阴性脊柱关节病（seronegative spine joint disease, SpA）患者104例、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）患者31例、原发性干燥综合征（primary Sj-gren syndrome, pSS）患者24例、痛风（gout arthritis,GA）患者22例、其他结缔组织病（包括风湿性多肌痛、皮肌炎、系统性硬化症、成人Still病等）患者46例、其他疾病（包括骨质疏松、股骨头坏死、骨髓炎、外伤所致骨和关节疾病、幼年类风湿关节炎、肿瘤等）患者165例。评估GPI的诊断价值,分析GPI阳性与阴性组RA患者在临床特点、疾病活动性、严重程度及炎性指标的差别。结果： RA患者中血清GPI的阳性率达55.4%（而其他自身免疫病为14.3%,健康对照组为7.78%,P＜0.001）,相较于OA及SpA患者RA患者组滴度显著升高,差异具有统计学意义（P<0.001）。单独应用GPI诊断RA的最佳界值为0.39 mg/L,敏感性54.2%,特异性87.3%。RF阴性患者中GPI阳性率为36.1%;抗环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide, CCP)抗体阴性患者中GPI阳性率34.2%; RF和抗CCP抗体双阴性患者中GPI阳性率为24.1%。GPI水平与ESR、 RF、抗CCP抗体及HRF IgG滴度呈正相关（P＜0.05）。结论： GPI在RA患者中有较高的敏感性,抗CCP抗体和/或RF阴性患者中GPI阳性对RA有一定的诊断意义,GPI滴度与RA的疾病活动度可能有关。     

葡萄糖-6-磷酸异构酶、抗环瓜氨酸肽抗体诊断类风湿关节炎的临床意义

目的:研究血清葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)抗原、抗环瓜氨酸肽(抗CCP)抗体对类风湿关节炎(RA)的诊断意义。方法:回顾分析122例RA患者、198例非RA患者和177例健康正常人血清中的GPI、抗CCP抗体、类风湿因子(RF)浓度,计算RA组患者的DAS28评分,将各项指标进行统计分析。结果:RA组中GPI浓度为(0.41±0.23)μg/ml,高于健康组(P<0.01),GPI对类风湿关节炎诊断的灵敏度和特异度分别6.08%和24.14%;RA组中抗CCP抗体为(126.94±104.48)Ru/ml,高于非RA组和健康组(P<0.01),抗CCP抗体对类风湿关节炎诊断的灵敏度和特异度分别69.67%和93.41%;抗CCP抗体联合GPI对类风湿关节炎诊断的灵敏度和特异度分别84.43%和57.22%。结论:抗CCP抗体对类风湿关节炎诊断特异度高,GPI联合抗CCP抗体提高了类风湿关节炎诊断的灵敏度,可增加RA的检出,对类风湿关节炎的诊断有所帮助。     

葡萄糖6-磷酸异构酶与类风湿性关节炎研究新进展

类风湿性关节炎（RA）是以关节组织慢性炎症为主要表现的自身免疫病,近年来发现葡萄糖6-磷酸异构酶（GPI）与RA病情相关。本文阐述RA的病因病机、GPI及其与RA的研究新进展,并指出存在的问题及建议。     

葡萄糖-6-磷酸异构酶及相关自身抗体诊断类风湿性关节炎的价值

目的 探讨葡萄糖-6-磷酸异构酶对类风湿性关节炎的诊断价值,与抗环瓜氨酸肽抗体、类风湿因子之间的相关性以及在临床诊断上的意义.方法 对165例RA患者血清和161例非RA患者血清和32例正常人血清用酶联免疫吸附试验、粒子增强免疫透射比浊法进行检测.结果 165例RA患者葡萄糖-6-磷酸异构酶敏感度和特异度分别为71.5%和97.9%,与非RA对照组和正常对照组比较差异有显著性(P<0.05);葡萄糖-6-磷酸异构酶与抗CCP抗体和RF重叠阳性率分别为60.6%和57.0%.经统计学分析,葡萄糖-6-磷酸异构酶与抗CCP抗体、RF之间相关性不明显,不完全重叠;三项试验同时检测,以任两项试验阳性为标准诊断RA,则敏感性可提高到77.0%(127/165),特异性97.4%(188/193).若GPI和抗CCP抗体两项中任一项阳性为标准诊断RA,则敏感性可提高到89.1%,特异性达98.0%.结论 葡萄糖-6-磷酸异构酶是协助诊断RA的一个新的实验指标,与抗CCP抗体、RF联合检测能提高RA的早期诊断率.     

葡萄糖-6-磷酸异构酶抗原检测在类风湿关节炎患者中的诊断意义

目的探讨血清中葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI）抗原检测在类风湿关节炎（RA）患者中的诊断意义。方法用ELLSA方法分别检测类风湿关节炎患者组、其它风湿病患者组和正常对照组血清和关节液中的G6PI抗原浓度。结果98例RA患者组血清G6PI抗原平均浓度高于其它结缔组织组和正常对照组,经单因素方差分析,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论G6PI抗原可能成为类风湿关节炎的一个新的诊断指标。     

类风湿关节炎血清葡萄糖-6-磷酸异构酶治疗前后变化特点

目的：通过测定葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）在类风湿关节炎（RA）治疗前后的变化,分析GPI对RA疗效判断的意义。方法：检测RA组、健康对照组血清的GPI、类风湿因子（RF）浓度,并对结果进行统计分析。结果：RA组的GPI浓度值和阳性率均显著高于健康对照组（P〈0．001）,且RA活动组GPI浓度值和阳性率显著高于RA非活动组（P〈0．001）;治疗后随病情缓解,GPI浓度值显著下降。结论：GPI在RA中的升高程度与关节炎的活动性有关,并随病情缓解下降,可作为治疗后病情缓解的指标。     

葡萄糖-6-磷酸酶多克隆抗体对大鼠血管源性脑水肿的治疗作用

目的观察葡萄糖-6-磷酸酶多克隆抗体（G-6-PpAb）对大鼠血管源性脑水肿（VBE）的治疗作用。方法将60只Wistar大鼠随机分为正常、脑水肿、脑水肿甘露醇、脑水肿G-6-PpAb共4组。Wistar大鼠腹腔注射苯肾上腺素造成VBE模型,然后分别股静脉注射甘露醇、腹腔注射G-6-PpAb,用Evans blue（EB）法测定血脑屏障（BBB）的通透性,并以远红外水分分析仪分别测定各组脑灰、白质水分含量百分比。结果G-6-PpAb组同甘露醇组相比对降低BBB通透性及大脑白质水分含量均有显著效果（P〈0．01）,对灰质的脱水作用无显著性差异（P〉0．05）。结论G-6-P活性与VBE中BBB的通透性改变有关,G-6-PpAb对VBE尤其是脑白质水肿有选择性治疗作用。     

血清葡萄糖6-磷酸异构酶在类风湿关节炎诊断中的意义

目的 探讨葡萄糖6-磷酸异构酶(gheose-6-phosphate isomerase,GPI)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)诊断中的意义.方法 用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)双抗体夹心法检测108例RA患者、42例系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者、50例其他风湿病患者及112例健康体检者血清GPI浓度,RA患者同时检测了抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP)、类风湿因子(rheuma-toid factor,RF).结果 GPI浓度:RA患者为(1.840±2.821)μg/ml, SLE患者为(0.143±0.426)μg/ml,其他风湿病患者为(0.074±0.279)μg/ml,健康体检者为(0.092±0.232)μg/ml.RA患者血清中GPI浓度显著高于SLE、其他风湿病患者和健康体检者(P＜0.01).Spearman等级相关分析显示RA患者GPI浓度与类风湿因子(RF)浓度呈显著正相关(r=0.622,P＜0.01),与其他检测指标无相关性.结论 GPI浓度大于0.209μg/ml时对RA的诊断有较高的特异性, 其特异性可达93.7%,敏感性为56.5%.表明GPI的变化在RA诊断有较重要的意义.     

Smarcad1重组蛋白表达及多克隆抗体验证

目的:建立稳定的实验室多克隆抗体制备流程,选择Smarcad1作为目的基因进行重组蛋白表达纯化与多克隆抗体制备,并对其进行特异性验证。方法:以本实验室的pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板,构建pET-16b-Smarcad1-F1原核表达质粒。表达Smarcad1-F1蛋白,并纯化。利用蛋白质免疫印迹,蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光实验检测抗体特异性。结果:PCR鉴定结果显示,成功构建pET-16b-Smarcad1-F1表达质粒。蛋白表达纯化实验中,考马斯亮蓝染色检测,相较于诱导前,加入IPTG后Smarcad1蛋白成功诱导表达,且纯化出分子量为27 kD的目的蛋白。Western印迹证明,制备的抗体能够特异性识别内源性Smarcad1蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验显示,相较于对照组,制备的抗体能够与Smarcad1蛋白结合。免疫荧光实验检测所制备抗体的特异性,结果显示制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白。结论:成功构建了Smarcad1原核表达质粒,利用原核蛋白表达纯化出Smarcad1蛋白,利用该蛋白制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白,为后续原核表达蛋白及多克隆抗体制备提供思路。     

建鲤重组Cystatin蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体制备

目的:对建鲤半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPIs)Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并以重组Cystatin为抗原制备多克隆抗体。方法:用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导转入pET-30a-Cystatin的E.coli BL21(DE3)表达重组蛋白,经过Ni 2+-NTA镍离子亲和层析纯化重组Cystatin,高效液相色谱鉴定重组Cystatin的纯度,Azocasein法测定其对木瓜蛋白酶的抑制作用。利用QuickAntibody-Mouse5W快速佐剂和纯化的重组Cystatin免疫Balb/C小鼠获得抗血清,采用夹心ELISA法鉴定抗血清的效价,Western blotting和免疫组织化学法鉴定抗血清的抗原识别特异性。结果:原核表达的目的蛋白相对分子质量约20 000;镍亲和层析纯化后重组Cystain在SDS-PAGE上显示单一条带,纯度>95%;Azocasein法检测,0.014μg重组Cystain抑制木瓜蛋白酶活性达50%以上;ELISA夹心法检测获得的Cystatin抗血清效价达到1∶512 000;Western blotting检测,转入pET-30a空质粒的全菌蛋白中未检测到Cystatin存在,而在转入pET-30a-Cystatin的全菌蛋白及纯化各步样品中均检测到Cystatin信号,且均为单一条带;免疫组织化学检测,建鲤各组织呈现不同强度的Cystatin阳性染色,抗血清中的多克隆抗体与原核和真核表达的Cystatin均特异性结合。结论:成功表达和纯化了建鲤Cystatin;获得含高效价多克隆抗体的Cystatin抗血清,具有高特异性和灵敏性。     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

人睾丸特异表达基因PIAS-NY 原核表达 和多克隆抗体的制备

目的 构建PIAS-NY-pET30a 原核表达载体,并诱导其成功表达,经纯化后获得高浓度的可溶性融 合蛋白His-PIAS-NY,免疫小鼠获得鼠源性PIAS-NY 多克隆抗体。方法 以人精原cDNA 文库为模板,通过 聚合酶链反应（PCR）扩增PIAS-NY 开放阅读框,克隆到pET30a 表达载体中,酶切、PCR 鉴定构建重组质粒。 测序完全正确后将质粒PIAS-NY-pET30a 转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行大量扩增,异丙基-β-D- 硫 代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。超声、离心、His-Ni 柱亲和层析纯化包涵体蛋白,依次经过不同浓度尿素进 行蛋白质复性,获得高浓度的可溶性His-PIAS-NY 融合蛋白。分6 次BalB/C 小鼠腹腔注射乳化纯化蛋白。 2 个月后小鼠眼球取血,收集血清。结果 成功构建原核表达质粒PIAS-NY-pET30a ;利用终浓度1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h,大肠杆菌BL21 大量表达融合蛋白His-PIAS-NY,并以包涵体形式存在于菌体中;尿素 变性后His-Ni 柱纯化融合蛋白,复性后获得高浓度的可溶性蛋白His-PIAS-NY ;6 次免疫后收获存活小鼠 抗血清;酶联免疫吸附测定（ELISA）抗血清滴度达到1 ∶ 100 000 ;免疫印迹和免疫共沉淀证实PIAS-NY 抗血清能特异性识别293T 细胞和GC2 细胞中PIAS-NY 蛋白。结论 成功获得PIAS-NY 多克隆抗体,而且 具有高反应性和高特异性,PIAS-NY 在GC2 细胞和293T 细胞中表达,并且能够与RUVBL2 蛋白发生相互作用。     

大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a( )载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.