CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达

目的对肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶（EsBk）进行基因克隆和重组表达，探讨其特性。方法以产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌49号菌总基因组DNA为模板，PCR扩增CTX-M-3，将其克隆入pGEM-T载体后测定该核苷酸序列，再将CTX-M-3基因克隆到pBV220／DH5α系统进行重组，重组菌经42℃热诱导，SDS-PAGE电泳鉴定酶蛋白的表达。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段，与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100％。大肠杆菌DH5α转化pBV220／CTX-M-3重组质粒后，ESBLs试验为阳性，药敏试验结果与原菌株相比耐药性下降。此基因能在大肠埃希菌中大量表达，SDS-PAGE电泳显示，蛋白分子质量大约为31KD。结论成功表达重组的CTX-M-3型酶，为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。     

β-内酰胺酶及超广谱β-内酰胺酶的研究进展

β-内酰胺抗生素制剂是目前世界上最普通的细菌感染的治疗方法,但近年来,细菌对抗生素的耐药性的发生率越来越高[1],而细菌耐药性最常见的机制是β-内酰胺酶的产生[2],这些酶的种类非常多,并且在抗生素使用过程中的选择压力下经常发生变异,导致了超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)类的发展[3]。其TEM及SHV基因发生变异的例子,主要发生在E.coli和K.peneumoniae中,特别是在医院偶发或爆发感染的产ESBLs菌株,结果造成了治疗费用的增加及住院时间的延长。为弄清细菌耐药机制,并选择适当的抗生素,给医院的治疗提供更好指导,本文就近年来β-内酰胺…     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶原核表达条件的研究

目的 探讨重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3分别在大肠埃希菌ER2566和BL21(DE3)中进行原核表达的最佳条件.方法 分别在不同的宿主菌、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度中诱导pET-28a(+)/CTX-M-3融合表达载体,目的 产物经SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件分析,以获得最佳表达条件.结果 表达载体的最佳诱导条件是重组质粒在BL21(DE3)中18℃诱导24 h,IPTG终浓度为0.8 mmol/L:表达载体在最佳条件下表达时,目的 蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的33%.结论 获得pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌中表达CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)蛋白的最佳条件,为此酶的大量纯化奠定了基础.     

10-23脱氧核酶及其应用进展

1023脱氧核酶是近年来利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平上抑制基因表达,从而调控相应蛋白的表达,可能成为治疗肿瘤、病毒感染等疾病的新型工具。     

10-23 脱氧核酶的生物催化功能研究进展

10-23脱氧核酶是利用体外筛选技术得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平上抑制基因表达,具有潜在的治疗应用价值。     

超广谱β-内酰胺酶基因型分析

目的 了解同济医院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)细菌基因型分布状况.方法 采用纸片扩散法检测产ESBLs细菌,通过基因扩增、序列分析技术研究ESBLs基因型.结果 49株产ESBLs细菌中,以CTX-M-14(n=33)亚型最常见,其它亚型包括CTX-M-3(n=3)、CTX-M-9(n=1)、CTX-M-12(n=1)、CTX-M-15(n=1)、CTX-M-24(n=1)、SHV-5a(n=1),1株细菌同时产CTX-M-3、CTX-M-14两种CTX-M型ESBLs;4株表型确证试验阳性细菌未能分型.结论 同济医院ESBLs基因型以CTX-M酶为主,CTX-M-14亚型最常见,亦存在SHV-5a,CTX-M-12、15中国少见亚型.     

肠杆菌科超广谱β-内酰胺酶检测

目的 :研究临床分离出的肠杆菌科产生超广谱β 内酰胺酶 (ESBLs)的检测及主要分布情况。方法 :NCCLs推荐的初筛和表型确证试验方法。结果 :临床分离到的 74株肺炎克雷伯菌 ,产 β ESBLs株占 2 0 .3% ;14 5株大肠埃希菌 ,产ESBLs株占15 .2 % ;2 5株产气肠杆菌 ,产β ESBLs株占 8.0 % ;30株阴沟肠杆菌 ,产β ESBLs株占 3.3 % ;结论 :肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是产ESBLs的主要菌株 ,且肺炎克雷伯菌较大肠埃希菌更容易产ESBLs     

对产超广谱β-内酰胺酶的监测分析

随着第三代头孢菌素的广泛大量使用。细菌因产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药的现象愈来愈多。由质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)．几乎对所有β-内酰胺类抗生素均有较强的灭活力。并能使其产生的突变基因传递到同种或异种菌株，使更多的细菌产生耐药。从而对临床治疗造成极大危害，导致治疗失败．给临床感染的控制带来巨大的挑战。为了     

超广谱β-内酰胺酶的分子生物学研究进展

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)由质粒介导,能水解青霉素、广谱头孢菌素及单环类抗生素并产生耐药。大部分超广谱β-内酰胺酶是由广谱β-内酰胺酶TEM-1和SHV-1突变而来,此外还有CTX-M族、OXA族以及不属于上述任何一个家族的类型,本文主要对近年来有关β-内酰胺酶的分类、ESBLs的特性等分子生物学研究进展进行综述。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及纯化

目的对肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行基因重组表达及纯化。方法以产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌总基因组DNA为模板PCR扩增CTX-M-3,将其克隆入pET-28a(+)载体,重组质粒转入大肠埃希菌ER2566中表达,表达产物经过Ni-琼脂糖凝胶柱纯化,用SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定纯化蛋白。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100%。此基因能在大肠埃希菌ER2566中大量表达,蛋白分子质量大约为32KD得到SDS-PAGE电泳和Western-blot的证实,与理论值相符。结论成功表达及纯化CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶,为进一步酶生物学特性及酶的抗体制备研究奠定了基础。     

10-23脱氧核酶对新生大鼠心肌细胞ET-1mRNA表达的影响

目的:将体外筛选具有切割内皮素-1(endothelin-1,ET-1)mRNA的10-23脱氧核酶转染原代培养新生大鼠心肌细胞,观察其对心肌细胞ET-1 mRNA的影响.方法:体外转录ET-1全长RNA底物,设计并合成5条ET-1 10-23脱氧核酶(DZ1～DZ5),其5‘及3‘端各有2个核苷酸硫代修饰,体外切割ET-1 RNA底物,筛选有效脱氧核酶;5‘标记荧光素FAM的10-23脱氧核酶瞬间转染新生大鼠心肌细胞以观察对10-23脱氧核酶的摄取;采用半定量RT-PCR检测ET-1基因的表达.结果:DZ2、DZ3、DZ4及DZ5在体外均可切割RNA底物,其中DZ4两侧结合区结合自由能之差最大,其切割效率最高,达83.5%,而DZ3两侧结合区结合自由能之差最小,其切割效率亦最低(47.3%);瞬间转染新生大鼠心肌细胞24h,心肌细胞内可见10-23脱氧核酶的分布,半定量RT-PCR结果显示转染24h后的DZ4(0.2μmol/L)可减少血清诱导肥大心肌细胞ET-1mRNA及细胞总蛋白,降低细胞活力与蛋白质合成速率(P＜0.05).结论:本研究设计的10-23脱氧核酶能切割体外转录的ET-1全长RNA底物,转染心肌细胞后,可抑制ET-1 mRNA的表达,减缓血清诱导心肌细胞肥大,10-23脱氧核酶两侧结合区自由能的差值与切割效率有关.     

新型10-23脱氧核酶表达载体的构建及其效能研究

目的 构建一种新型10-23脱氧核酶(DZ)真核表达载体,并鉴定其在细胞内表达10-23DZ的能力以及10-23DZ抑制巨噬细胞TACO表达的效果.方法 设计1条寡脱氧核糖核苷酸ODN-PSL,其序列包含鼠莫洛尼白血病病毒逆转录酶(MLV-RT)的引物结合序列、1个多克隆酶切位点(MCS)及1个逆转录终止信号序列.将ODN.PSL插入框架质粒pBUDCE4.1中启动子P_(CMV)的下游,获取重组质粒pBUD-PSL.将MLV-RT的编码基因克隆至pBUD-PSL中另一启动子P_(EF-1α)的下游,构建重组质粒pSDE01.将pSDE01转染入鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,采用RT-PCR方法鉴定细胞中MLV-RT的表达及其表达产物的逆转录酶活性.通过计算机软件模拟巨噬细胞TACO mRNA的二级结构,以此确定10-23DZ的作用靶位并设计一相应的10-23DZ-DZ1,将DZI表达序列插入pSDE01中ODN-PSL的MCS中,获取重组表达载体pSDE01-DZ1.将pSDE01-DZ1转染入RAW264.7细胞,并设未转染对照组.转染后48 h,采用PCR法和斑点杂交方法鉴定DZ1在细胞中的表达;并分别采用半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测TACO mPNA和蛋白的表达,各组实验均独立重复3次.结果 限制性内切酶酶切及测序结果显示pSDE01构建成功,将其转染入RAW264.7细胞后检测到MLV-RT的表达,而且表达产物具有逆转录酶活性.pSDE01-DZ1转染入RAW264.7细胞后48 h,PCR和斑点杂交方法均检测到DZ1的表达;半定量RT-PCR和蛋白质印迹检测结果显示,与未转染组相比,pSDE01-DZ1转染后48 h巨噬细胞TACO mRNA表达水平下降了77.7%(0.193 ±0.008比0.864 ±0.005,P＜0.05),TACO蛋白表达最下降了73.3%(0.114 ±0.051比0.427 ±0.043,P＜0.05).结论 成功构建了一种操作简便的新型10-23DZ表达载体,所携带的特异性10-23DZ可在细胞内有效表达,并抑制相应靶基因的表达.     

“10～23”型脱氧核酶的研究进展

脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有酶活性的单链DNA分子。迄今为止，利用该技术已筛选出多种具有催化功能的脱氧核酶分子，其中研究最多的是具有RNA切割活性的脱氧核酶，尤其是10～23型脱氧核酶，该酶能催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平使基因灭活，从而调控蛋白质的表达，在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景。     

10-23型脱氧核酶对HBV S、C基因体外切割作用研究

目的:探讨10-23脱氧核酶(10-23 DRz)对HBV S基因及C基因体外转录产物的特异性切割作用.方法:分别构建含有HBV S基因或C基因的重组质粒,以线性化的重组质粒为模板,体外转录获得相应HBV S基因RNA及C基因RNA.设计并合成针对HBV S基因的DRz-hbvs-1和针对C基因的DRz-hbvc-1,观察其对靶RNA的体外切割作用.结果:DRz-hbvs-1及DRz-hbvc-1能对各自相应的靶RNA进行有效的特异性切割;无DRz对照组及反义寡核苷酸对照组均未见特异性切割.结论:10-23 DRz能特异性切割HBV S基因及C基因体外转录产物.     

计算机辅助设计抗MRSA耐药基因mecR1的10-23型脱氧核酶

应用Primer Premier 5.0和RNA structure 4.6两种软件设计和筛选有效抗mecR1的10-23型脱氧核酶（DRz）,采用电转化的方法将其导入细菌体内,实时PCR的方法定量检测其对mecR1转录的影响,并通过平板克隆形成实验观察脱氧核酶抑制细菌生长的情况。结果表明,计算机辅助设计合成的5条抗MRSA耐药调控基因mecR1的10-23型脱氧核酶,它们能不同程度的降低mecR1的转录水平,有效抑制临床耐药菌MRSA080309的生长,其中DRz6抑制效果最显著。说明联合应用这两种计算机软件设计抗mecR1的10-23型脱氧核酶,是一种经济实用而有效的方法,能够大大缩短有效反义药物的筛选时间。     

icl mRNA特异性10-23DRz在小鼠体内抗结核分枝杆菌感染的实验研究

目的探讨iclmRNA特异性10-23脱氧核酶(deoxyribozyme,DRz)对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)在小鼠体内感染的影响,及其单独或与异烟肼(isoniazidum,INH)联合应用治疗小鼠结核病的效果。方法分别用DZ4、INH、INH+DZ4-S或INH+DZ4对Mtb进行预处理,再用上述经过预处理的Mtb感染BALB/c小鼠,一定时间后进行小鼠肺组织Mtb培养及病理学改变观察。利用DZ4-FITC溶液对BALB/c小鼠进行滴鼻处理,检测滴鼻途径给药的效果。采用尾静脉注射法建立小鼠结核病模型,将模型小鼠随机分为5组(n=10),分别给予生理盐水、DZ4、INH、INH+DZ4、INH+DZ4-polyG治疗,于治疗完成2周后进行小鼠肺组织Mtb荷菌量检测和病理学改变观察。结果Mtb感染后2周,各组小鼠的肺组织荷菌量均无显著性差异(P>0.05)。感染进行至4～12周时,INH+DZ4预处理组Mtb感染小鼠的肺组织荷菌量较其它各组均显著偏低(P<0.05),肺组织的病理改变较其他各组也明显轻微。经滴鼻途径给予DZ4-FITC溶液4h后,小鼠肺组织冰...     

Rv1196基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 用PCR方法从结核菌基因组中扩增Rv1196基因,将之重组到pET24b载体,在大肠杆菌中进行融合表达,重组蛋白纯化后通过免疫印迹反应初步鉴定其抗原性和特异性.方法 提取H37Rv标准株的基因组DNA;设计Rv1196基因两端的引物,通过PCR方法从基因组DNA中扩增出Rv1196抗原的基因,直接连接到pGEMT载体上,经过筛选鉴定后,将重组子测序;将测序的质粒用NdeI和XhoI双酶切后连接到pET24b载体上,筛选得到重组载体pET24b-39;转化BL21并优化表达条件,采用金属鏊合层析纯化重组蛋白;选取7例结核病阳性临床血清标本和7例健康人血清标本进行Western blot分析.结果 获得了氨基酸编码序列正确的基因,与数据库中报道一致;Rv1196基因能够在大肠杆菌中高效表达,其表达量约占细菌总蛋白的30%以上;重组抗原不与健康人血清反应,但与结核标本血清呈强烈反应.结论 重组Rv1196抗原具有较好的特异性和抗原性,有较好的血清学分析价值.     

脂质体介导10-23脱氧核酶对人血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :研究针对增殖细胞核抗原 (PCNA)基因特异性的 10 - 2 3脱氧核酶 (DNAzyme)对人血管平滑肌细胞(VSMC)PCNA的表达和细胞增殖的影响。方法 :应用脂质体转染法将不同寡聚核苷酸转入体外培养的人脐动脉VSMC。采用3 H -TdR掺入法观察空白对照组、脂质体组和等摩尔浓度 (1.0 μmol/L)的DNAzyme、反义寡核苷酸 (A SODN)、mDNAzyme在干预 2d后VSMC的DNA合成速率 ;免疫组化检测 1.0 μmol/L的DNAzyme和ASODN转染 2d后对PCNA表达的影响 ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法分析不同剂量的DNAzyme(0 .12 5、0 .2 5、0 .5、1.0、2 .0 μmol/L)转染5d后VSMC增殖活性。结果 :1.0 μmol/LDNAzyme和ASODN转染 2d后 ,VSMC的3 H -TdR掺入量均较对照组显著减低 (P <0 .0 5 ) ,DNAzyme较ASODN更显著减低 (P <0 .0 5 ) ;1.0 μmol/LDNAzyme作用 2d后细胞增殖抑制率为 6 4 .5 % ,高于ASODN组 (37.7% )、mDNAzyme组 (11.9% )和脂质体组 (3.3% )。DNAzyme和ASODN处理细胞 2d后 ,PCNA的表达水平 (平均光密度值 )分别为 0 .2 95 6± 0 .0 2 5 1和 0 .3880± 0 .0 92 5 ,明显低于空白对照组 0 .7342± 0 .2 136 (P <0 .0 1)。转染 5d后 ,DNAzyme的作用呈剂量依赖性 ,0 .12 5 μmol/LDNAzyme处理后VSMC的增殖较对照组低 (P <0 .0 5 )。     

人TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人TRAIL基因，构建其原核表达载体。方法 采用RT-PCR（方法从人宫颈癌细胞系HeLa的总RNA中扩增TRAIL基因114～281片段的cDNA，并将目的片段克隆至原核表达载体pET32a（＋）。结果 克隆到人TRAIL基因114～281片段的cDNA，DNA测序结果与GenBank基因库报导的完全一致，经SDS～PAGE电泳。可见29kD大小的融合蛋白质表达。结论 人TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达。为进行研究sTRAIL的作用机制提供了实验依据。