沉默Dnmt1基因对结肠癌细胞株HT-29细胞增殖及细胞周期的影响

目的 利用RNA干扰技术研究沉默DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,Dnmt1)对结肠癌细胞株HT-29细胞增殖及细胞周期的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 利用LipofectamineTM 2000将Dnmt1 siRNA转染HT-29细胞,实验中将细胞分为3组:未处理组、对照siRNA组和Dnmt1 siRNA组.利用CCK-8试剂盒和流式细胞术分别研究其对HT-29细胞增殖和细胞周期的影响,进一步通过Real-time PCR和Western blotting技术研究与增殖和周期相关基因表达的变化.结果 与未处理组和对照siRNA组相比,Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞的增殖受到明显的抑制(P<0.05).Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞在G0/G1期的比率高达66.93%,高于未处理组和对照siRNA组中HT-29细胞在G0/G1期的比率(分别为53.45%和54.71%)(P<0.05).此外,与未处理组和对照siRNA组相比,Dnmt1 siRNA组中HT-29细胞的cdk2,cyclin D1和cyclin E基因的mRNA和蛋白的表达明显下调(P<0.05).结论 干扰Dnmt1能明显诱导HT-29细胞周期静止,其可能的机制与cdk2,cyclins D1和cyclin E基因的表达下调密切相关,操纵该基因有可能成为新的结肠癌的分子治疗靶点.     

Glut1基因沉默对人结肠癌HT-29细胞株增殖、分化及凋亡的影响及机制研究

目的 探究葡萄糖转运蛋白1(Glut 1)基因沉默对人结直肠癌HT-29细胞增殖、分化及凋亡的影响及机制.方法 将Glut 1干扰序列(siRNA)转染至人结肠癌HT-29细胞作为shGlut 1组,非干扰序列转至HT-29细胞作为NC组,HT-29细胞作为Blank组,癌旁正常组织细胞作为Control组,应用qRT-PCR法和Western blot法检测各组细胞中Glut 1、TGF-β1、PI3K、AKT、PTEN、mTOR mRNA和相应蛋白的表达水平,并检测Bcl-2/Bax比值,p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1、p-T 70-4 EBP1、Cleaved Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表达;MTT法检测各组细胞增殖能力变化,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况,克隆形成实验检测肿瘤细胞体外增殖成瘤能力.结果 免疫荧光结果表明shGlut 1组转染效率较高,符合实验标准;与Control组比较,结肠癌组织中Glut 1、TGF-β1、PI3K、AKT、mTOR、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达上调,而PTEN、Bax的mRNA和蛋白的表达下调,p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1和p-T 70-4 EBP1蛋白表达上调,Cleaved Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白表达下调(P均<0.05);与Blank组和NC组比较,shGlut 1组Glut 1、TGF-β1、PI3K、AKT、mTORC 1、Bcl-2 mRNA和蛋白的表达下调,PTEN、Bax mRNA和蛋白的表达上调,p-PI3K、p-S 473-AKT、p-S 389-S6K1和p-T 70-4 EBP1表达下调,Cleaved Caspase-3、Cleaved-PARP蛋白的表达上调,增殖率下调,G0/G1期较多而S期较少,凋亡率上调,克隆形成细细胞生长较慢(P均<0.05).结论 Glut 1基因沉默能抑制结直肠癌细胞的增殖与分化,促进其凋亡,考虑为抑制TGF-β/PI3 K-AKT-mTOR信号通路.     

NF-κB信号通路的阻断对皮肤鳞癌SCL-1细胞凋亡的影响

目的：利用siRNA技术抑制核因子-kappa B（nuclear factor-kappa B,NF-κB）亚单位p65基因的表达,研究其对p65表达的抑制作用,并探讨其对皮肤鳞癌SCL-1细胞凋亡的影响。方法：将终浓度为50 nmol/L的p65 siRNA转染皮肤鳞癌SCL-1细胞,通过RT-PCR检测p65 mRNA的表达;利用Western blotting检测p65、bcl-2和bax蛋白表达,利用Caspase-Glo^®-3/7,8和9检测试剂盒检测caspase-3/9的活性;最后通过流式细胞术检测细胞凋亡。结果：p65 siRNA转染SCL-1细胞后的48 h,p65 mRNA的表达水平最低,与0 h相比, 差异有统计学意义（0.23±0.10 vs. 0.66±0.05, P<0.05）;转染48 h后,p65和bcl-2蛋白表达水平下调,而促凋亡蛋白bax的表达上升,进一步caspase-3/9的活性也显著升高。流式细胞术结果表明,p65 siRNA能明显诱导SCL-1细胞发生凋亡,其早期凋亡的比率为20.28%±1.87%,显著高于未处理组和对照siRNA组（凋亡率分别为9.13%±1.51%和9.37%±1.38%,F=47.532,P<0.01）。结论：p65 siRNA能够阻断皮肤鳞癌细胞中NF-κB信号通路,并下调抑凋亡蛋白bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白bax的表达以及提高caspase的活性,提示NF-κB信号通路有望成为皮肤鳞癌基因治疗的分子靶点。     

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在人结肠癌中的表达及其对HT-29细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mTOR)基因在人结肠癌组织中的表达及其对HT-29细胞增殖与凋亡的影响.方法 免疫组织化学方法检测磷酸化mTOR (p-mTOR),在郑州大学第一附属医院普通外科2009年10月至2010年6月50例结肠癌组织和50例正常结肠组织中的表达情况.体外合成mTOR小干扰RNA(siRNA),转染人结肠癌HT-29细胞为实验组,同时设空白对照组(不转染)及无义对照组(转染无义siRNA),Western印迹法检测各组HT-29细胞的mTOR蛋白表达;四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖;原位末端标记法检测细胞凋亡.结果 结肠癌组织中p-mTOR的表达高于对照组[60％(30例)比14％(7例),P＜0.05],mTOR的表达和淋巴结转移、肿瘤的分化程度相关(r=0.311、0.427,均P＜0.05).实验组HT-29细胞mTOR的表达和细胞增殖均低于空白对照组和无义对照组(0.39±0.25比1.18±0.05、1.46±0.09,0.275±0.033比0.460±0.028、0.450±0.037,均P＜0.05);细胞凋亡指数则均高于空白对照组和无义对照组(12.33±1.53比0.33±0.31、1.67±0.58,均P＜0.05).结论 在结肠癌组织中存在mTOR高表达,mTOR siRNA对HT-29细胞mTOR基因的表达有抑制作用,能抑制HT-29细胞的增殖并促进其凋亡.     

siRNA沉默膀胱癌T24细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的研究

目的 研究siRNA对膀胱癌细胞T24 DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的沉默作用.方法 将筛选出的siRNA转染入膀胱癌T24细胞分为空白组、脂质体组、阴性对照组和siRNA组,分别运用RT-PCR、Western blot检测转染后不同时段DNMT1 mRNA水平、蛋白水平变化.结果 筛选出的siRNA转染膀胱癌T24细胞DNMT1 24 h开始出现mRNA减少,24 h、48 h、72 h分别降至(66.05±4.87)％、(39.36±4.53)％和(40.86±4.81)％(P＜0.05).转染后24 h、48 h、72 h蛋白水平分别降至(90.21±3.68)％、(71.45±3.44)％和(67.74±3.38)％(P＜0.05).结论 siRNA能有效地沉默膀胱癌细胞T24 DNMT1的表达.     

shRNA沉默基因DNMT1的表达对膀胱癌T24细胞增殖与凋亡的影响

目的 体外研究shRNA(short hairpin RNA)沉默基因DNMTl的表达对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨DNMT1在膀胱肿瘤形成过程中的作用机制.方法 实验分为空白对照组(给予脂质体)、HK组(含无效干扰序列的质粒)及pshRNA-DNMT1组;常规培养膀胱癌T24细胞株,用脂质体Lipofeetamine 2000将构建成功的重组质粒pshRNA-DNMT1转染进入T24细胞,然后进行RT-PCR、Western blot检测各组DNMT1 mRNA及蛋白质水平变化;进行MTT,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测各组T24细胞增殖和凋亡情况.结果 重组质粒pshR-NA-DNMT1成功转染进入膀胱癌T24细胞;经RT-PCR检测pshRNA-DNMT1组DNMT1 mRNA表达减少,24、48、72h的抑制率分别是28.44%、52.48%、70.91%;转染pshRNA-DNMT1后,T24细胞中DNMT1蛋白24、48和72 h的抑制率分别为24.27%、57.79%、69.74%;在MTT检测中,pshRNA-DNMT1组的细胞增殖抑制率在24、48、72 h分别为(4.34±0.76)%,(9.87±1.54)%和(13.78±1.93)%,与空白对照组比较各时间点差异均有极显著性意义(均P<0.01);转染24、48和72 h后,pshRNA-DNMT1组细胞凋亡率分别为(3.87±0.81)%、(8.69±1.23)%和(11.46±1.24)%,与空白对照组比较差异均有极显著性意义(均P<0.01).结论 重组质粒pshRNA-DNMT1能有效降低膀胱癌细胞中DNMT1基因mRNA及蛋白的表达,并在一定程度上抑制T24细胞的增殖和促进凋亡.     

HDAC1基因小干扰RNA对人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞放射敏感性影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)抑制组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)表达对人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞放射治疗敏感性的作用及可能机制。方法体外合成针对HDAC1基因的siRNA,脂质体法转染人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞,应用蛋白印迹法检测细胞HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4的表达,应用实时定量聚合酶链反应方法检测HDAC1基因、核因子-κB(NF-κB)基因和p53蛋白调控的凋亡调控因子(PUMA)基因mRNA表达。应用6 MV直线加速器,以0、2、4、6、8 Gy不同剂量X线照射细胞,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率及克隆形成实验检测细胞放射敏感性。结果人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞经转染HDAC1基因siRNA后,正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组HDAC1基因mRNA表达分别为10.21±0.42、9.48±0.41和4.92±0.41;蛋白表达分别为0.81±0.14、0.79±0.16和0.42±0.18,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05);正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组乙酰化组蛋白H4表达分别为0.76±0.21、0.75±0.20和0.30±0.19,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组乙酰化组蛋白H4表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组细胞NF-κB基因mRNA表达分别为6.24±0.52、6.31±0.61和4.22±0.56,PUMA基因mRNA表达分别为3.84±0.26、3.69±0.29和5.42±0.31,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞NF-κB基因mRNA降低,PUMA基因mRNA表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。经X线照射后,正常对照组、阴性对照组和siRNA干扰组凋亡率分别为(16.25±2.64)%、(15.41±2.97)%和(29.62±3.11)%,存活分数(SF2)值分别为0.576±0.149、0.564±0.142和0.226±0.151,与正常对照组和阴性对照组比较,siRNA干扰组细胞凋亡率增加,SF2值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 HDAC1基因siRNA能够增强人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞对放射线损伤的敏感性。抑制人宫颈鳞状细胞癌SiHa细胞HDAC1基因表达,增加乙酰化组蛋白H4表达,下调NF-κB基因表达和上调PUMA基因表达可能是其作用机制。     

CacyBP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响

目的 观察干扰小RNA(siRNA)介导的Cacy BP/SIP基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响。方法 化学合成Cacy BP/SIP基因序列特异性siRNA(Cacy BP/SIP siRNA),采用脂质体法转染siRNA至MDA-MB-231细胞(Cacy BP/SIP siRNA组),MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率。Realtime PCR和Western blotting检测MDA-MB-231细胞内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白的表达。另设阴性对照组和空白对照组。结果 与阴性对照组和空白对照组比较,Cacy BP/SIP siRNA组MDA-MB-231细胞增殖能力显著下降(P<0.05),细胞凋亡率显著增高(P<0.05)。Caspase-3和Bax mRNA及蛋白表达上调(P<0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白表达下调(P<0.05)。结论 靶向沉默乳腺癌MDA-MB-231细胞中Cacy BP/SIP基因表达后,可以抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡,其作用可能通过下调Bcl-2表达,上调Caspase-3和Bax表达发挥诱导细胞凋亡的作用。     

5-碘代杀结核菌素对HT-29细胞DLC-1基因的去甲基化作用

目的探讨5-碘代杀结核菌素(5-iodotubercidin,ITU)对人结肠癌细胞HT-29株增殖凋亡及DLC-1基因表达的影响。方法不同浓度(0.1、0.5、1、2、4、6、8、10μmol/L)ITU作用于HT-29细胞48 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测HT-29细胞的增殖活性;ITU(0、2、4、6μmol/L)作用于HT-29细胞48 h,流式细胞仪检测其凋亡率;ITU(0、2、4、6μmol/L)作用于HT-29细胞48 h,亚硫酸氢盐克隆测序法(BSP)检测DLC-1基因启动子区Cp G岛甲基化情况;同上的处理细胞的方法,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)mRNA的表达;Western blot检测DLC-1基因蛋白表达。结果 1ITU可明显抑制HT-29细胞活力,在一定范围内随着药物浓度增加抑制细胞活力的作用越强(P<0.05),以6μmol/L组对HT-29细胞影响最大,IC50=(5.92±0.62)μmol/L。2分别以0、2、4、6μmol/L ITU作用于HT-29细胞后,流式细胞仪检测各组凋亡率,分别为(9.56±2.21)%、(22.18±3.16)%、(34.23±3.16)%、(40.50±3.16)%,表明随着ITU浓度增加,对HT-29细胞的促凋亡作用越强。3经0、2、4、6μmol/L ITU处理后DLC-1基因启动子区Cp G岛甲基化率分别为91.67%、75.00%、61.67%、43.33%,表明ITU可以引起DLC-1基因启动子区甲基化程度降低。4在HT-29细胞中可检测到少量DLC-1 mRNA和蛋白的表达;相同条件经0、2、4、6μmol/L ITU处理细胞后检测显示DLC-1基因mRNA和蛋白的表达增加,并随浓度增长,mRNA及蛋白表达随之增加。结论 ITU可抑制人结肠癌HT-29细胞增殖,促进HT-29细胞凋亡,而这种抑制增殖作用可能和ITU降低DLC-1基因启动子区甲基化水平而诱导DLC-1基因上调有关。     

Omi/HtrA2和Caspase-9在食管癌中的表达及与凋亡的关系

目的探讨在食管鳞癌中Omi/HtrA2、Caspase-9蛋白的表达及其与癌细胞凋亡的关系。方法采用免疫组化SP法对80例经病理确诊为食管鳞癌病例的正常组织、癌旁组织及癌组织进行Omi/HtrA2和Caspase-9蛋白免疫组化分析。采用TUNEL法检测细胞凋亡水平,并分析食管癌中Omi/HtrA2和Caspase-9的表达及其与肿瘤细胞凋亡的关系。结果 1 Omi/HtrA2、Caspase-9在食管鳞癌组织阳性表达率分别为76.25%、58.75%,在癌旁组织中的阳性表达率分别为27.50%、72.50%,在正常组织中的阳性表达率分别为22.50%、85.00%;Omi/HtrA2、Caspase-9在食管鳞癌组织中的阳性表达率与其在癌旁组织、正常组织中蛋白的阳性表达率分别进行比较,差异均有统计学意义(P0.05);癌旁组织与正常组织的Omi/HtrA2和Caspase-9蛋白阳性表达率进行比较,差异均无统计学意义(P0.05)。2 Omi/HtrA2蛋白表达阳性组癌细胞凋亡指数(18.186±1.331)‰,明显高于阴性组凋亡指数(5.108±1.783)‰(P0.01);Caspase-9蛋白表达阳性组细胞凋亡指数为(17.763±0.675)‰,明显高于阴性组细胞凋亡指数(11.619±0.712)‰(P0.05)。结论 Omi/HtrA2在食管癌中高表达,而Caspase-9在食管癌中低表达,两者在促进食管癌细胞凋亡中有相反的调节作用。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点,诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据,做出准确诊断,给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂,腹腔内疾病占64．63％,共17种病因;腹腔外疾病占35．37％,共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查,在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。