应用液相芯片技术快速检测常见食源性致病菌的研究

目的建立一种基于多重PCR技术联合液相芯片技术快速、准确同时检测沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌的方法。方法针对5种食源性致病菌的目标基因设计特异性的引物探针,建立5种食源性致病菌的多重PCR检测方法,将PCR产品与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,利用液相芯片检测仪来检测杂交结果,并对检测方法的重复性、灵敏度、特异性进行评价,以及使用实际样本对该方法进行初步验证。结果该方法检测5种食源性致病菌,重复性良好,变异系数均2%;沙门菌inv A与霍乱弧菌hly A的检测灵敏度为50 cfu/ml,单核细胞增生李斯特菌Hly、金黄色葡萄球菌Sa442、副溶血性弧菌toxR的检测灵敏度为100 cfu/ml;检测的特异度为100%。结论本研究建立的液相芯片检测方法能快速、准确、特异地同时检测沙门菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌5种常见的食源性致病菌。     

凭祥边境互市入境水产品致病菌污染状况分析

目的通过对凭祥边境互市点水产品的致病菌监测,了解边境互市点水产品致病菌的污染状况,为进境水产品检验检疫工作更加规范化提供依据。方法 2013年1月—2014年12月从互市点随机采集5类水产品样本1 080份进行沙门菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌的检测。沙门菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌的检测分别依据GB 4789.4-2010、SN/T1022-2010、GB/T 4789.7-2008、GB 4789.30-2010进行检测。结果检测的入境水产品中,副溶血性弧菌阳性率最高,为1.4%、单核细胞增生李斯特菌次之,阳性率为0.5%,沙门菌较少,阳性率为0.3%,霍乱弧菌未检出。5类水产品中虾类和贝类阳性率最高,为3.3%,其次为蟹类,阳性率为2.2%,鱼类为1.1%,软体类最低,阳性率为1.0%。结论凭祥边境互市点入境水产品中副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌均有带菌,且样本存在多重污染,同一品种出现两种菌感染的情况。副溶血性弧菌及单核细胞增生李斯特菌污染较严重,今后还将是检测的重点致病菌。     

汕头市海产品中常见致病菌的检测评价

目的了解汕头市海产品中常见致病菌的检测状况,为卫生行政部门制定相关控制措施提供科学依据。方法根据国家标准方法分别检测副溶血性弧菌、创伤弧菌、沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和霍乱弧菌。结果 155份海产品中有20份样品检出致病菌,总检出率为12.90%,其中鲜活虾蟹类的检出率最高,为15.00%,其次为鲜活(冰鲜)鱼类(13.33%)和生食水产品(12.50%)。共检出致病菌21株,检出率为13.55%。其中副溶血性弧菌的检出率最高,为7.74%,其次为创伤弧菌(4.52%)、霍乱弧菌(1.00%)和沙门菌(1.00%)、单核细胞增生李斯特菌(0.91%)。结论汕头市海产品中存在常见的致病菌,其中副溶血性弧菌依然是主要的致病菌,创伤弧菌位居第2位,沙门菌、创伤弧菌、单核细胞增生李斯特菌的污染也不可忽视。     

舟山地区冰鲜海产品中常见食源性致病菌污染状况调查

目的了解浙江省舟山地区冰鲜海产品中食源性致病菌污染状况。方法针对舟山地区码头、农贸市场、工厂的163份17类冰鲜海产品,利用荧光PCR方法进行副溶血性弧菌、沙门菌和单核细胞增生李斯特菌检测。结果 163份样品中,有29份样品检出致病菌,总阳性率为17.8%。其中贻贝肉的阳性率最高,为50.0%,在所检秋刀鱼样品中未发现致病菌。副溶血性弧菌阳性率最高,为13.5%,其次是沙门菌(4.9%)、单核细胞增生李斯特菌(3.1%)。结论副溶血性弧菌、沙门菌和单核细胞增生李斯特菌是冰鲜海产品中重要的食源性致病菌,对舟山地区冰鲜海产品致病菌的控制和监测不能放松。     

2015—2016年滨州市水产品卫生监测结果

目的了解滨州市水产品卫生学特征,为水产品的食用安全及食源性疾病的防控提供依据。方法按照国家标准检测方法对2015—2016年市售水产品中铅、镉、总汞、总砷、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌进行常规监测。结果化学污染物监测中,水产品中重金属含量合格率为98.33%。食源性致病菌检测中,单核细胞增生李斯特菌、沙门菌未检出,副溶血性弧菌检出率为29.60%。结论滨州市市售水产品存在不同程度的化学污染物和副溶血性弧菌污染,应加强水产品的监管力度。     

无公害畜禽肉和水产品中常见致病菌及其毒力因子

肠出血性大肠杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、沙门菌和副溶血性弧菌是无公害畜禽肉和水产品中常见的4种食源性致病菌。这些致病菌的致病性与其毒力因子密切相关。肠出血性大肠杆菌的菌毛、pO157质粒、eaeA、志贺毒素和溶血素都是其重要的毒力因子；单核细胞增生性李斯特菌的重要毒素：李斯特菌溶血素O和内化素，也是其重要的毒力因子；沙门菌的毒力因子包括致病岛的众多基因和毒力质粒；副溶血性弧菌的毒力因子TDH、TRH。研究和了解这些毒力因子的特征，对于寻找食源性致病菌的快速特异的分子诊断方法具有重要意义。     

廊坊市食品中沙门菌等6种食源性致病菌的监测

目的:了解廊坊市高危食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、空肠弯曲菌的污染状况,提高我市食源性疾病检测、预警和控制能力,为食物中毒监测提供科学依据。方法:依据国家食源性疾病监测网工作手册进行。结果:检测生畜肉、生禽肉、非定型包装熟肉制品、动物性水产品、蔬菜、速冻米面食品、非发酵豆制品共300件,检出沙门菌31株,单核细胞增生李斯特菌26株,副溶血性弧菌11株,金黄色葡萄球菌2株,肠出血性大肠杆菌O157:H71株,未检出弯曲菌。结论:廊坊市居民主要食品存在食源性致病菌污染,其中动物性水产品副溶血性弧菌株污染较重,生肉沙门菌和单核细胞增生李斯特菌污染较重。     

深圳市罗湖区2010年-2014年市售水产品受食源性致病菌污染状况分析

目的分析深圳市罗湖区2010年-2014年市售水产品受食源性致病菌污染状况。方法采集2010年-2014年深圳市罗湖区市售水产品样品819份,对沙门菌、单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌5类食源性致病菌污染现状进行分析。结果 819份水产品中检出致病菌样品175份,检出率为21.4%,鲜活虾蟹、鲜活(冰鲜)海水鱼和鲜活贝壳检出率较高,分别为29.1%、24.6%和22.4%;副溶血性弧菌检出率最高,为20.0%,其次为创伤弧菌(8.7%)、沙门菌(1.2%)、单核细胞增生李斯特菌(0.6%)、霍乱弧菌(0.1%);2010年-2014年水产品中食源性致病菌的检出率分别为28.7%、22.6%、20.8%、19.7%、17.7%,总体呈下降趋势;而副溶血性弧菌检出率则呈现逐年升高趋势。结论深圳市罗湖区市售水产品受食源性致病菌污染不容忽视,主要的食源性致病菌种类是副溶血性弧菌和创伤弧菌,应进一步加强对水产品致病菌的监测及卫生监管。     

多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的效果观察

目的:探讨多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的应用效果。方法:取四种常见的肠道致病菌作为研究对象,包括:大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌等,采用多重PCR法对四种肠道致病菌进行检测,并与临床模拟样品进行验证,分析多重PCR检测在多种常见肠道致病菌中的应用效果。结果:单重PCR结果显示:对于变形杆菌扩增出大小为522bp的特异性片段;单核细胞增生李斯特菌扩增出大小为155bp的特异性片段;大肠杆菌O157扩增出大小为366bp的特异性片段;副溶血性孤菌扩增出大小为199bp的特异性片段。多重PCR结果测定显示:大肠杆菌O157、副溶血性孤菌、普通变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌特异性表明只有该四种菌扩增出特异性条带,其他均为阴性;灵敏度结果显示:多重PCR测定菌落计数数量级为103CFU/mL。结论:将多重PCR技术用于多重常见肠道致病菌中效果理想,能快速、准确的筛查致病菌,为临床治疗提供依据。     

3种食源性致病菌的多重PCR检测方法研究

目的建立一种快速、经济、实用的多重PCR方法,期望能同时检测3种常见致病菌。方法根据沙门氏菌的侵袭蛋白A（invasion protein A,invA）、志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H基因（invasion plasmid antigen,ipaH）、副溶血性弧菌的不耐热肠毒素基因（thermolabile hemolysin,tlh）分别设计了3对引物,预计PCR扩增的目的片段依次为284、450、606bp。对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、敏感性试验以及优化反应体系,建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的单管多重PCR方法。结果含沙门氏菌：42cfu/g,志贺氏菌：36cfu/g,副溶血性弧菌：116cfu/g的肉陷样品经过增菌、DNA提取、扩增、电泳,在16～18h内应用多重PCR体系能够检出。通过对10株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高。结论初步建立能快速,灵敏,特异地检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌的多重PCR体系,可以作为食物中毒病原菌检测的有效方法。     

霍乱弧菌多重PCR检测方法的建立及优化

[目的]建立一种快速检测样品中霍乱弧菌的多重PCR方法,优化霍乱弧菌多重PCR的反应体系和循环参数.[方法]根据霍乱毒素ctxA、toxR、O139群特异性基因、O1群特异性基因序列,设计特异性引物,对引物浓度、PCR缓冲液的浓度、Mg2+浓度、退火温度及其延伸时闻等条件进行优化.[结果]4对引物在不同血清型霍乱弧菌DNA模板中能特异扩增出不同的条带.在同一反应体系中,较低的延伸温度可以提高霍乱弧菌多重PCR检测的灵敏度.[结论]通过对霍乱毒素多重PCR反应体系不同因素的优化,建立了稳定可靠的霍乱弧菌多重PCR检测平台.     

人感染2型猪链球菌快速多重PCR检测方法的建立

目的：用多重PCR从临床标本中同时检测猪链2型特异性及5个毒力相关基因，建立SS2实验室快速诊断及应急检测的核酸鉴定方法。方法：根据已报告的引物序列设计并合成8对引物（含1对内对照引物），经过PCR反应条件的优化与组合，采用同一PCR反应条件与循环程序，直接从临床标本或培养物中同时一次性扩增属特异性（tuf）、种特异性（16S rRNA）、荚膜多糖（cps2J）、溶菌酶释放蛋白（mrp）、细胞外蛋白因子（ef）、溶血素（sly）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapdh）等基因；并对方法的特异性和敏感性进行评估。结果：运用所建立的方法可直接从临床疑似猪链感染患者的脑脊液、血液、双相培养液和血培养物中一次性扩增出上述8对引物的目的基因，并经基因序列分析、细菌分离培养和生化鉴定进一步证实。其敏感性为78cfu（克隆形成单位）。结论：所建立的方法具有敏感、特异、快速、简便的特点，可应用于SS2感染应急检测、流行病学监测和实验室快速诊断。     

PCR和毛细管电泳技术检测沙门氏菌等5种病原菌的方法研究

目的采用多重PCR技术检测结合毛细管电泳成像技术建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的方法。方法根据沙门氏菌hilA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌TDH基因、金黄色葡萄球菌的pSa-442 Sau3AI fragment基因及大肠杆菌O157的rfbE基因设计异性特PCR引物,被检样品经4 h振荡培养后金属浴裂解制备DNA模板,使用全自动毛细管电泳核酸检测系统分析PCR扩增产物。结果在580 bp、423bp、257 bp、245 bp和194 bp处分别出现预期的特异性DNA条带,且无非特异扩增条带出现。敏感性试验显示在模拟标本中的检测灵敏度,沙门氏菌为101-2cfu/ml、志贺氏菌为101cfu/ml、副溶血性弧菌为102cfu/ml、金黄色葡萄球菌为102cfu/ml、大肠杆菌O157为101cfu/ml。结论该方法操作方便、特异性和灵敏度高、分辨率高,可同时完成5种病原菌的检测,在公共卫生突发事件中具有实用价值。     

多重PCR检测霍乱弧菌的毒素相关基因

目的 探索建立一种快速、敏感地检测霍乱弧菌O1群、O139群、非O1／非O139群的毒素相关基因的方法。方法 针对霍乱弧菌霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)、小带联结毒素基因(zot)、辅助霍乱肠毒素基因(oce)、霍乱弧菌毒素共调菌毛A基因(tcpA)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)分别设计引物，建立多基因PCR方法；通过一次扩增反应之产物经琼脂糖凝胶电泳，可检测出菌株的毒素相关基因的携带情况。结果 阳性对照菌株：MO45(霍乱弧菌O139群)检出5种毒素相关基因，结果符合设计要求；其他不同来源的霍乱弧菌(O1群、O139群、非O1／非O139群)检出1—5种不等的毒素相关基因；根据毒素相关基因携带情况，可将菌株分为5个基因型，并可区分为产毒株和非产毒株；多重PCR敏感度可达10^2cfu／ml。结论 该方法快速、特异、敏感，具有较大的应用价值。     

Rapid detection of methicillin-resistant staphylococci by multiplex PCR.

A multiplex PCR was developed to detect the coagulase gene (coa; pathognomic of Staphylococcus aureus) and the mecA gene (characteristically encoding for methicillin resistance in staphylococci) in a single, rapid test. Suitable primers for the gene targets and an internal, amplification control were incorporated into a multiplex PCR assay, which was then optimized on a capillary air thermal cycler to improve the turnaround time of the test to approximately 1.5 hours. The assay was evaluated with 111 fresh clinical isolates of staphylococci. The multiplex PCR correctly distinguished between isolates of S. aureus, which were sensitive to methicillin (MSSA) and those resistant to it (MRSA). It also correctly differentiated between similar isolates of coagulase negative staphylococci (MSSE and MRSE respectively). It was concluded that this multiplex PCR was a rapid and reliable method for the detection of methicillin-resistant staphylococci.     

广东省外环境O1/O139群霍乱弧菌毒力基因分型

目的 分析广东省外环境来源O1/O139群霍乱弧菌毒力基因的携带及基因分型特征,为霍乱防控提供依据.方法 选取2008 -2009年广东省O1/O139群霍乱弧菌水体分离株69株,水产品分离株16株和同期病例分离株5株,应用多重聚合酶链反应对ctxA、ace、zot、tcpA、tcpl、hlyA、ompU、toxR等8种毒力基因进行检测和分型分析.结果 90株O1/O139群霍乱弧菌均携带hlyA和toxR基因;5株病例菌株中有3株携带8种毒力基因,另外2株小川型菌株为非产毒株,基因型为hlyA+ toxR+ ompU+ zot+ tcpA+ tcpl+型和hlyA+ toxR+ tcpA+型;水体菌株中,稻叶型菌株以hlyA+ toxR+ ompU+ ace+ zot+ tcpl+型(34.15％)为主,小川型(66.67％)和O139群(70％)以hlyA+ toxR+型为主;水产品菌株中,稻叶型菌株以hlyA+ toxR+ ompU+ tcpl+型(75.00％)为主,小川型菌株各种基因型别均有分布,无明显优势基因型别.结论 广东省外环境来源O1/O139群霍乱弧菌以非产毒株广泛存在,毒力基因型别多样.     

多重实时PCR检测沙门菌、志贺菌和致泻性大肠埃希菌

目的 建立多重实时荧光PCR检测沙门菌侵袭蛋白A基因（invA）、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）不耐热肠毒素基因（elt）、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌侵袭力基因（ipaH）的方法。方法 优化多重实时荧光PCR的反应条件,检测系列10倍稀释的阳性菌DNA提取物。90份腹泻患者粪便样品经缓冲蛋白胨水（buffered peptone water,BP）增菌6h后进行多重实时荧光PCR检测,并对阳性标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10CFU／μl的福氏2aF301株、10。CFU／μl的鼠伤寒沙门菌和ETEC44815株。检测腹泻患者粪便样品,elt基因阳性率为14．4％（13／90）,ipaH基因阳性率为5．6％（5／90）;并从阳性样品中分离到3株elt基因阳性大肠埃希菌和4株ipaH基因阳性大肠埃希菌。整个检测过程可在10h内完成,其中包括BP增菌6h。结论 建立了同时检测invA、elt、ipaH毒力基因的多重实时荧光PCR方法,具有高度的特异性,可用于沙门菌、肠产毒性大肠埃希菌、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌菌株的毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本的快速筛检。     

Survey of nasal colonization by,and assessment of a novel multiplex PCR method for detection of biofilm-forming methicillin-resistant staphylococci in healthy medical students

We surveyed the prevalence of nasal colonization by biofilm-forming methicillin-resistant staphylococci in healthy medical students, who had never had contact with patients, using polymerase chain reaction (PCR) to detect themec A gene, production of penicillin-binding protein 2' (PBP2'), and quantitative assay of biofilm formation on polystyrene. Anterior nasal swabs from 90 students were cultured on mannitol salt and oxacillin salt screening agar plates. In total, 231 staphylococcal isolates belonging to 10 species from 88 students were identified, of which 139 from 77 (88%) students were Staphylococcus epidermidis. The overall prevalences of methicillin-resistant and biofilm-forming staphylococci were 48% (43 of 90) and 59% (53 of 90) for the medical students, respectively. In total 30 (33%) students carried biofilm-forming methicillin-resistant staphylococci in the nares, all of which were identified as S. epidermidis. For rapid detection of biofilm-forming methicillin-resistant S. epidermidis (MRSE), we devised a novel multiplex PCR method to assess a total of 243 staphylococcal isolates, including the 231 isolates from the students. The multiplex PCR assay used six primers to amplify atl E and ica ADB, which are responsible for the biofilm formation ofS. epidermidis, and mec A genes. The multiplex PCR assay revealed that 68 (96%) isolates were detectable in 71 biofilm-forming MRSE isolates, which corresponded to 93% (28 of 30) of biofilm-forming MRSE carriers. Surveillance of nasal colonization with biofilm-forming MRSE using this multiplex PCR in healthcare workers and patients, might provide useful information for the establishment of infection control procedures toward biofilm-forming MRSE.     

水体污染中常见致病菌的多重PCR分子检测研究

[目的]建立同时检测沙门氏菌、志贺氏菌、绿脓杆菌、肠出血型大肠杆菌和副溶血弧菌等5种水体常见致病菌的多重PCR检测技术,为这些致病菌感染的快速诊断提供实验依据。[方法]筛选设计5对特异引物,建立优化的多重PCR扩增体系和条件。[结果]对5种致病菌的检测,多重PCR灵敏度分别为：肠出血型大肠杆菌O157102 cfu、志贺氏菌102 cfu、副溶血弧菌102 cfu、绿脓杆菌101 cfu、沙门氏菌102 cfu。应用于人工污染水样及天然水样的检测,均有清晰、特异的预期条带产生,并与传统检测结果一致,每个样品所需时间为6～8 h,相对于传统检测方法,极大地缩短了检测时间,提高了检测灵敏度。[结论]该方法适用于大通量样品的检测研究,可推广应用于食品检测、环境监测等领域。