抑制Homer-1b/c基因表达对创伤性神经元损害的保护作用

目的研究抑制Homer-1b/c基因表达对神经元的保护作用。方法采用RNA干涉技术,通过逆转录聚合酶链式反应和Western blotting分析抑制Homer-1b/c表达效果。免疫组化检测代谢性谷氨酸受体1a(mGluR1a)表达变化。共聚焦显微镜观察神经元细胞内钙含量变化。通过乳酸脱氢酶(LDH)活性测定,研究抑制Homer-1b/c表达对神经元损伤的保护作用。结果转染神经元后36 h,Homer-1b/c表达明显被抑制,mGluR1a仅出现在胞浆部分。转染组较对照组细胞内钙荧光强度单位明显下降(23.4±2.8 vs 51.8±7.5),两组间差异有显著的统计学意义(P<0.05)。各组神经元损伤前培养液LDH活性差异无统计学意义(P>0.05),损伤后24 h,对照组和空载体组LDH活性分别为(158±23.0)U/L和(145±25.1)U/L,而转染组为(93±20.1)U/L,与对照组及空载体组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Homer-1b/c对于mGluR1a从胞体向树突部位转运以及受体在突触后膜锚定都具有重要作用。Homer-1b/c参与了细胞内钙释放,降低Homer-1b/c表达对神经元具有保护作用。     

神经元机械性损伤后Homer蛋白表达及意义

目的研究体外培养神经元机械损伤后不同亚型Homer蛋白表达的变化规律,进一步阐明Homer与神经元损伤的关系.方法胎鼠脑皮质神经元体外培养7 d,以微量移液器塑料滴头划割培养的神经元,横、竖各划8道,划伤宽度约1 mm,造成机械性损伤.在伤后不同时间(10、30 min,1、3、6、12、24、72 h),采用链酶亲合素-过氧化物酶复合物法(SABC法)行免疫组化染色.对照组不进行机械性划割,其它处理同损伤组.结果对照组神经元在各时间点Homer 1a免疫组化染色呈弱阳性.机械性损伤后从伤后10 min持续至24 h Homer 1a表达量增加,免疫组化染色呈阳性.阳性染色呈颗粒状分布于胞浆、胞膜及突起.Homer 1b/c,Homer 2a/b和Homer 3在对照组神经元中即有一定程度表达,机械性损伤后,其表达量无明显变化.结论神经元机械性损伤后Homer 1a表达明显升高,而Homer 1b/c、2a/b和3表达无明显变化. Homer 1a对第1组代谢型谷氨酸受体(mGluR)的功能具有负反馈作用,Homer 1b/c、2a/b和3则调节mGluR在细胞表面的分布,提高其稳定性.据此推测,增加Homer 1a表达或减少Homer 1b/c、2a/b和3的表达可能改变mGluR受体信号的传递效率,对神经元具有保护作用.     

Homer与缺血性脑损伤中谷氨酸、γ-氨基丁酸相关性研究

目的探讨Homer与神经元缺血性损伤中谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）相互关系。方法培养大鼠脑皮层原代神经元,先分为对照组、空载体组和Homeda siRNA转染组,检测Homefla变化。再将上述三组各分成正常组,缺氧缺血再灌注损伤后30min、1h、3h、12h、24h、48h共7小组,并进行Glu、GABA和Homeda的检测。结果①转染组神经元HomeHa表达量明显减少;②损伤中,乳酸脱氢酶（LDH）活性增强;与其它两组比较,转染组培养液LDH活性最低;③损伤中,Glu和GABA与LDH变化正相关;Glu和Homerla的变化成反比;而GABA和Homerla的变化成正比。结论缺血性神经元损伤后,Homerla蛋白不仅调控Glu变化,还通过调控GABA变化保护神经元,在兴奋性和抑制性神经递质平衡中发挥重要作用。     

siRNA细胞色素c基因静默对大鼠脑皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤的影响

目的探讨体外模拟缺血再灌注（ischemia／reperfusion，IS／RE）后大鼠脑皮质神经元内质网应激凋亡的机制及抑制细胞色素c（Cyt c）表达对内质网应激的影响。方法体外培养SD乳鼠脑皮质神经元，用免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度；用流式细胞术AnnexinV、PI双标检测调亡率及活性Caspase-3，-7，-9表达水平；用Westernblot免疫印迹方法检测Caspase-12、GRP78、Bcl-2、Cytc蛋白表达水平。结果SD乳鼠皮质神经元可纯化体外培养；空转染组神经元模拟缺血6h再灌注24h及48h（IS6h／RE24h、48h）细胞凋亡率分别是17．95％、22．62％；CytC基冈静默后凋亡率分别降至10．26％、9．37％，空转染组与转染组比较有统计学意义（P＜0．05）；空转染组神经元模拟缺血再灌注后GRP78、Cytc、活性Caspase-3、caspase-9、caspasel2表达均增加．Bcl2表达减少；siRNA Cyt c基因静默后神经元Bcl-2表达增加，GRP78、活性caspase-12、caspase-3、caspase-9表达明显降低，2组比较有统计学意义（P＜0．05）；空转染组和转染组均未检测到caspase-7表达。结论体外模拟缺血再灌注后脑皮质神经元发生凋亡，线粒体、内质网应激参与了神经元凋亡；抑制细胞色素c释放对内质网应激凋亡有抑制作用。     

大鼠弥漫性脑损伤后Homer1a及1b/c蛋白表达及意义

目的研究大鼠弥漫性脑损伤后Homer1蛋白3种亚型表达规律及其意义.方法 SD大鼠105只,体重(300±25)g,分为正常组、假手术组和弥漫性脑损伤(DBI)组,DBI组应用Marmarou大鼠DBI模型致伤,假手术组不予以自由落体打击,其余处理同DBI组,分别在损伤后30 min及1、6、12、24、72、168 h取大鼠主要脑区及核团进行Homer1a、1b/c蛋白分子的免疫组织化学和免疫印迹分析检测.结果两种检测方法均发现损伤组神经组织中Homer1a蛋白自伤后30 min起表达,持续至伤后168 h,而正常及假手术组未见该蛋白阳性表达,而Homer1b/c于正常组、假手术组及损伤组均可见明确的阳性表达.结论大鼠弥漫性脑损伤后Homer1a蛋白的表达于损伤前后有显著变化,而Homer1b/c于损伤前后无明显变化,提示Homer1a蛋白分子参与了神经元损伤修复过程.     

化学合成siRNA抑制原代皮层神经元NgR的表达

目的筛选能有效抑制神经元NgR表达的siRNA序列。方法根据siRNA靶序列设计原则,设计并化学合成针对大鼠NgR基因编码区的siRNA三对,并以一对无关序列的寡核苷酸作为阴性对照。原代培养的大鼠皮层神经元分为5组:siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组、无关序列组、非转染组,用阳离子脂质体TransMessenger Transfection Reagent转染。转染后48h行RT-PCR和免疫细胞化学检测NgR表达水平的变化。结果转染48h后,与序列2、3和无关序列转染以及未转染的细胞相比,序列1转染的神经元NgR mRNA水平明显下降,并且其NgR抗体免疫荧光染色的荧光强度也明显减弱。结论化学合成siRNA能有效地抑制原代皮层神经元NgR的表达。     

RIP1/3对创伤性脑损伤后神经元的作用及其机制研究

目的 探讨RIP1/3对创伤性脑损伤(TBI)后神经元的影响及其作用机制。方法 将体外培养的皮层神经元分为4组:siRIP组、Nec-1预处理组、阴性质粒转染组和对照组。通过慢病毒转染法分别干涉RIP1、RIP3表达,建立离体TBI损伤模型,通过流式细胞学检测划伤后神经元存活情况。对体外培养的皮层神经元敲除RIP1/3,建立谷氨酸诱导神经元损伤模型,通过流式细胞学检测谷氨酸刺激后神经元存活情况。结果 siRIP组及Nec-1预处理组机械性损伤后神经元存活率高于阴性质粒转染组和对照组。Nec-1预处理组谷氨酸损伤后神经元存活率高于对照组,而siRIP组存活率与对照组和阴性转染组比较未见显著差异。结论 RIP1和RIP3可能对TBI诱导后神经元死亡有作用,而RIP1抑制剂Nec-1可能对TBI具有脑保护作用。RIP1/3与谷氨酸兴奋毒性诱导细胞死亡无关,而Nec-1对于谷氨酸损伤具有潜在保护作用,并可能存在特异性靶点。     

逆转大鼠胶质瘤细胞耐药性MRP1-SiRNA的筛选实验

目的拟筛选出能逆转大鼠胶质瘤多药耐药细胞株C6／VP16对依托泊苷耐药性的多药耐药相关蛋白1基因小干扰RNA（MRP1-siRNA）。方法人工合成4对靶向MRP1的siRNA分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4,以脂质体2000作为载体;以6-羧基荧光素标记转染siRNA的c6细胞评价转染效率;采用逆转录-PCR和免疫印迹分别检测MRP1mRNA和蛋白的表达。细胞计数盒-8试剂盒检测转染前后依托泊苷对肿瘤细胞的半生长抑制浓度（IC50）。结果与siRNA1、siRNA4相比,siRNA2、siRNA3对MRP1基因的抑制作用更明显。转染siRNA2前后,依托泊苷对C6细胞的半生长抑制浓度分别为（0．873±0．0462）、（0．0927±0．039）ug/ul,两者相较差异显著（P〈0．05）。结论siRNA2、siRNA3可以有效抑制MRP1基因的表达,并能逆转肿瘤细胞对依托泊苷的耐药性。     

大鼠Rars基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠Rars基因的siRNA重组腺病毒载体,并观察大鼠神经元细胞病毒转染前后目的蛋白表达量变化。方法 将原代培养的大鼠神经元细胞随机分为观察组、阴性对照组及空白对照组。观察组细胞转染携带Rars siRNA序列的重组腺病毒,阴性对照组细胞转染携带Scramble无意义序列的重组腺病毒,空白对照组不转染任何病毒。观察各对照组表达绿色荧光蛋白（GFP）的阳性细胞数,计算转染率,并检测转染前后Rars基因对应产物精氨酰-tRNA合成酶（ArgRS）蛋白的表达量,评价基因沉默效率。结果 成功构建包含Rars基因干扰序列及Scramble序列的重组腺病毒,病毒滴度达1010级。利用重组腺病毒感染大鼠神经元细胞48 h后,绝大部分细胞表达GFP,转染率>95%。含Rars干扰序列的病毒转染细胞可使ArgRS蛋白表达量显著降低（P<0.01）,沉默效率>60%。含Scramble对照序列的病毒则不能产生明显的基因沉默效应。结论 本实验所构建的siRNA重组腺病毒载体可有效沉默大鼠Rars基因,降低ArgRS蛋白表达。     

孤啡肽受体拮抗剂对机械性损伤神经元存活率的影响

目的既往研究表明,孤啡肽在脑损伤后的表达明显升高,本研究通过特异性阻断孤啡肽受体(opioid-receptor-like receptor,ORL-1),观察对受损神经元是否具有保护作用。方法建立神经元机械性损伤模型,用孤啡肽受体特异性阻断剂([Nphe1]-NC(1-13)-NH2,Nphe)阻断孤啡肽受体,通过四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,钙离子水平测定,研究Nphe对机械性损伤神经元存活率的影响。结果 MTT法测定神经元机械性损伤后12 h细胞存活率显示:单纯损伤组细胞存活率为46%±4%,与对照组相比显著下降(P<0.05),不同剂量Nphe(30、300、1 200 nM)干预组的细胞存活率分别为56%±5%、67%±7%、72%±8%,与单纯损伤组存活率46%±4%相比差异显著(P<0.05)。LDH活性检测提示损伤后12 h和48 h,Nphe干预组LDH活性与损伤组相比有显著差异(P<0.05)。神经元机械性损伤后12 h,Nphe能够降低损伤后细胞内钙离子水平(P<0.05)。结论 ORL-1的特异性拮抗剂Nphe能够减少机械性损伤后继发性神经元损害,对神经元具有一定的保护作用。     

代谢型谷氨酸受体5对创伤性神经元损伤保护作用研究

目的研究代谢型谷氨酸受体5（mGluR5）的特异性激动剂对创伤性脑损伤后神经元的保护作用,并初步探讨其作用机制。方法原代培养2W大鼠皮层神经元细胞,采用神经元机械性损伤模型,加入两种mGluR5特异性激动剂2-氯-5羟苯基甘氨酸（CHPG）和3-氰．氮苯甲酰胺（CDPPB）,通过乳酸脱氢酶（LDH）释放率、caspase-3活性检测,研究mGluR5激动剂对神经元损伤可能具有的保护作用;通过western—blot检测细胞外信号调节激酶（ERK）、c—Jun氨基末端激酶（JNK）、p38表达变化并研究这种保护作用的产生机制。结果损伤后LDH释放率和easpase-3活性显著增加,CHPG和CDPPB明显抑制了LDH的释放率和easpase-3的活性,并呈剂量依赖性;Westernblot结果提示,CHPG和CDPPB显著增加了ERK的磷酸化水平,而对JNK、p38无影响。结论mGluR5的激动剂CHPG和CDPPB对机械性神经元损伤具有保护作用,这种保护作用可能是通过激活ERK通路实现。     

PI3K／Akt信号通路对神经元机械性损伤诱导的自噬调节作用

目的研究机械性神经元损伤后自噬的发生情况以及磷脂酰肌醇3激酶（P13K）／蛋白激酶B（Akt,即PKB）信号通路对其发挥的调节作用。方法小鼠皮层神经元原代培养2W后,采用机械性神经元损伤模型,通过蛋白印迹法（Westernblot）定量分析损伤后不同时间点自噬相关分子微管相关蛋白轻链3（LC3）I／II、Beclin-1和Akt蛋白磷酸化的表达情况;使用不同浓度的P13K抑制剂LY294002预处理神经元1h后给予机械性损伤,通过Westernblot来研究自噬相关分子LC3I／Ⅱ和Beclin-1的表达情况。结果自噬相关分子LC311于机械性神经元损伤后3h表达开始逐渐增加,而Beclin-1无明显变化;p-Akt的表达于损伤后3h达到高峰,此后逐渐恢复到正常水平;用P13K抑制剂LY294002预处理神经元,可以使损伤后神经元的自噬相关分子LC3lI和Beclin-1的表达上调。结论机械性神经元损伤可以诱导自噬发生,且PI3K／Akt信号通路在其中可能发挥调节作用。     

血红素加氧酶-1基因转染对神经元损伤的保护作用

目的观察腺病毒介导的血红素加氧酶-1（HO—1）基因转染大鼠后对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法雄性SD大鼠随机分为4组：假手术对照组（SH）、生理盐水组（V）、空载体组（Ad）和Ad—HO-1转染组（HO）。后三组在缺血前3d于右侧脑室部分别注射20μl生理盐水、含1μl空载体腺病毒（1．0×10^10plaque-forming unit／ml,PFU／ml）的生理盐水或含1μl重组HO-1腺病毒（1．0×10^10PFU／ml）的生理盐水,连续注射3d后,采用右侧大脑中动脉栓塞法（MCAO）建立脑缺血再灌注模型。每组大鼠测定神经功能后,处死大鼠并取全脑标本,测定右脑梗死体积及细胞凋亡指标,荧光显微镜下观察脑组织荧光蛋白的表达情况,Western blot检测脑组织HO-1的表达。结果HO组中HO-1表达量明显高于Ad组和V组,Ad组和HO组可见有荧光蛋白表达,转染率为34．5％±3．4％。HO组神经功能显著优于Ad组和V组（P〈0．001）。与SH组比较,V组、Ad组脑梗死体积、神经细胞凋亡明显升高。与V组及Ad组比较,HO组脑梗死体积显著减小（P〈0．01）、神经元凋亡显著减少（P〈0．01）。结论腺病毒携带的HO-1基因能有效的转染脑组织,并在脑内稳定表达;HO-1基因转染显著减轻脑缺血再灌注后神经细胞损伤。     

百日咳毒素减轻脑缺血后神经元钙内流的实验研究

目的探讨百日咳毒素(PTx)对缺血性脑卒中后神经元的保护作用及其可能的机制。方法将C57BL6小鼠用大脑中动脉闭塞(MCAO)法建立卒中模型,随机分为两组,每组12只鼠。实验组卒中后予PTx 1000 ng溶于1 ml生理盐水腹腔注射干预;对照组予1 ml生理盐水腹腔注射。24 h后行TTC染色检测梗死面积,并行免疫组化检测细胞凋亡。在体外培养原代神经元,用谷氨酸兴奋刺激模拟卒中后神经元损伤模型。用MTT及乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测PTx对谷氨酸兴奋刺激后神经元的存活和损伤情况。然后,检测PTx对谷氨酸诱导神经元钙离子内流的影响。结果 PTx治疗可减小卒中后小鼠脑梗死面积,使之由(51±11)%降至(34±8)%(P0.05)。免疫组化发现PTx可使脑内Caspase-3阳性细胞数由(677.7±117.8)个/mm2减少至(297.5±83.6)个/mm2(P0.05),且较少细胞凋亡。体外结果提示,PTx可增加谷氨酸刺激后神经元的存活率,使MTT吸光值由(0.618±0.06)提升至(1.1±0.12)(P0.05);同时,PTx还可减少LDH的释放,使吸光值由(1.31±0.11)降低至(0.76±0.08)(P0.05)。PTx可减缓和减少钙离子进入神经元,经PTx治疗后钙内流可由基础值的5倍降低至基础值的2~3倍,且钙离子内流达到半峰值浓度的时间也由(18.5±2.5)s延长至(85.4±10.2)s。结论百日咳毒素可减少卒中后钙离子内流到神经元,继而减少神经元损伤,减小梗死面积。     

Down-regulation of Homer1b/c expression protects cultured neurons after traumatic injury

Activation of metabotropic glutamate receptor 1a aggravates traumatic brain injury. The constitutively expressed protein Homer1b/c participates in delivering and anchoring metabotropic glutamate receptors in neurons. Here, we aimed to verify whether down-regulation of Homer1b/c by RNA interference could protect cultured rat cortical neurons from traumatic injury. We showed that 36 hours after transfection of Homer1b/c small interfering RNA, metabotropic glutamate receptor 1a was present only in the neuronal cytoplasm, but not in the dendrites. Calcium fluorescence intensity was also decreased significantly. Moreover, lactate dehydrogenase concentration was significantly decreased in Homer1b/c small interfering RNA-transfected cells compared with that in untransfected and control small interfering RNA-transfected cells 24 hours after traumatic neuronal injury.Our findings indicate that down-regulation of Homer1b/c could reduce metabotropic glutamate receptor 1a transfer from the cell body to the dendrite, relieve calcium overload, and protect neurons from traumatic injury.