莱菔子素诱导结肠癌细胞凋亡及其机制

十字花科蔬菜中的异硫氢酸盐成分对癌症具有重要的化学预防作用，莱菔子素(sulforaphane，SFN)为异硫代氰酸盐衍生物，可诱导机体产生Ⅱ型解毒酶，增加对致癌物的代谢解毒作用。我们在SFN诱导结肠癌细胞株Caco-2葡萄糖醛酸转移酶1A(UGT1A)表达的研究中发现，这种植物化学保护剂的浓度超过35μmol／L时，细胞的形态学发生较明显变化，我们设想，     

携带凋亡素VP3基因重组腺病毒的制备及其在人结肠癌SW480细胞中的表达

目的利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其在人结肠癌SW480细胞中的表达。方法扩增目的基因VP3 cDNA,与EcoRⅤ酶切线性化的pShuttle-IRES-hrGFP穿梭质粒连接构建重组穿梭质粒pShuttle-VP3-hrGFP,PmeⅠ酶切线性化pShuttleVP3-hrGFP并转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,并经PCR、EcoRⅤ、PacⅠ酶切电泳及测序鉴定,线性化的重组腺病毒质粒经脂质体包裹转染AD293细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法行病毒浓缩和纯化并将其感染人结肠癌SW480细胞中进行表达,观察其感染效率及VP3蛋白表达水平。结果 pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建鉴定成功,PCR反应扩增出402 bp的片段;pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒经酶切获得大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,重组腺病毒质粒经测序证实VP3-hrGFP编码区成功克隆入腺病毒p Ad中,且其序列与Gen Bank中VP3 CDNA序列完全一致。成功包装出携带VP3基因的重组腺病毒,滴度为1.738×10~(12)opu/ml,重组腺病毒可在SW480细胞内得到有效表达。结论用细菌内同源重组法可快速、高效地制备携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒,并可在人结肠癌细胞中高效表达。     

蜂毒素基因重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的作用

目的 观察蜂毒素基因重组腺病毒诱导肝癌细胞凋亡的作用。 方法 通过形态学观察、DNA电泳、原位缺口末端标记(TUNEL)、流式细胞仪等方法观察携蜂毒素基因重组腺病毒对肝癌细胞凋亡的影响。 结果 光镜下见部分肝癌细胞出现凋亡形态学变化,DNA电泳可见梯形条带,TUNEL染色结果显示,Ad-rAFP-Mel组、Ad-rAFP组和对照组的凋亡率分别为(21.5±2.4)％、(10.5±4.4)％和(3.0±1.4)％,各组间差异有显著性(F=3 8.0,P<0.0 5)。流式细胞仪定量分析结果显示,3组凋亡率分别为(7.3±0.5)％、(3.9±0.1)％和(0.8±0.1)％,各组间差异有显著性(F=415.1,P<0.05)。 结论 诱导细胞凋亡可能是蜂毒素抗肿瘤的作用机制之一。     

人结肠癌中凋亡抑制基因Survivin的表达

背景:细胞增殖和凋亡失衡将导致肿瘤的发生,并直接影响肿瘤的生物学行为。survivin是一种新的凋亡抑制基因,在大多数肿瘤中显著高表达。目的:探讨survivin基因在人结肠癌发生、发展中的作用,及其与p53基因的表达和结肠癌生物学行为的关系。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT鄄PCR)检测33例结肠癌组织及其相应癌旁组织和正常结肠黏膜中survivinmRNA和p53mRNA的表达,分析survivinmRNA的表达与p53mRNA的表达和结肠癌生物学行为的相关性。结果:69.7%的结肠癌组织中有survivinmRNA表达,表达率显著高于癌旁组织和正常结肠黏膜(42.4%和21.2%,P<0.01);survivin表达阴性癌组织的相应癌旁组织和正常结肠黏膜无一例有survivinmRNA表达。结肠癌组织中survivinmRNA的表达值显著高于癌旁组织和正常结肠黏膜(P<0.01)。33例结肠癌组织中仅2例p53mRNA表达缺失,癌旁组织和正常结肠黏膜中均有p53mRNA表达。结肠癌组织中p53mRNA的表达值与癌旁组织和正常结肠黏膜无显著差异;survivin表达阳性癌组织中p53mRNA的阳性表达率和表达值与survivin表达阴性组无显著差异。survivinmRNA和p53mRNA的表达与结肠癌的生物学行为无显著相关性。结论:survivin基因在人结肠癌组织中表达上调,提示其可能通过抑制结肠癌细胞凋亡,在结肠癌的发生、     

脂质体介导转染的绿色荧光蛋白基因在骨髓基质细胞内的表达

目的研究脂质体转染法对骨髓基质细胞进行基因修饰的可行性。方法在体外分离和扩增大鼠骨髓基质细胞,用脂质体转染法介导绿色荧光蛋白基因进入到骨髓基质细胞内,荧光显微镜下检测荧光蛋白的表达,台盼兰排斥试验检测转染细胞的活力。结果绿色荧光蛋白可以在大鼠骨髓基质细胞内表达,转染效率为(28.9±3.6)%;脂质体法转染后的细胞活力为(93.6±4.8)%。结论脂质体转染法可以介导外源基因进入到骨髓基质细胞内表达。     

生存素基因对细胞凋亡调控的研究进展

自从 1 972年Ｋｅｒｒ提出细胞凋亡概念以来 ,对于这种不同于坏死的细胞死亡方式已经积累了 30年的研究经验 ,并对细胞凋亡在胚胎发育、免疫耐受、维持内环境稳定以及肿瘤和自身免疫性疾病等的发生、发展过程中的作用有了越来越多的认识。特别是近年来分子生物学、遗传学、免疫学等的飞速发展 ,已能在分子水平对细胞凋亡的调控进行研究。生存素 (ｓｕｒｖｉｖｉｎ)是 1 997年发现的一个凋亡抑制因子 ,属凋亡抑制蛋白家族 (ＩＡＰｓ) ,是ＩＡＰｓ家族中相对分子质量最小的成员 ,仅有 1 4 2个氨基酸和Ｎ 末端一个单独的ＢＩＲ(杆状病毒凋亡抑…     

p53基因在亚砷酸钠致人胚胎肺成纤维细胞凋亡中的作用

目的 探讨p53、Bax、bcl-2基因在亚砷酸钠(NaAs02)致人胚胎肺成纤维细胞(HELF)凋亡中的作用.方法 分别取转染了p53质粒HELF细胞(p53组)、转染了PC质粒的HELF细胞(PC组)、常规培养的HELF细胞(正常组),在6孔板中培养48 h后,分别加入0、3、9、15 mmoL/L NaAsO2溶液,培养24 h后,用real-time PCR法检测p53、Bax、bcl-2 mRNA基因表达水平,采用免疫组织化学SABC法检测p53、Bax、bcl-2基因蛋白表达水平;用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 p53组细胞p53基因mRNA表达水平(0.51±0.29)低于PC组及正常组[(1.32±0.26),(1.00±0.20),P均<0.05],p53组p53基因蛋白表达水平[(4.10±1.20)%]低于PC组和正常组[(8.00±1.63)%、(7.90±1.79)%,P均<0.05];p53组、PC组、正常组在染砷0、3、9、15 mmol/L时,细胞凋亡率[(0.57±0.28)%、(22.91±4.86)%、(40.05±3.93)%、(44.87±3.58)%,(0.65±0.24)%、(14.09±3.49)%、(20.31±3.66)%、(32.42±3.63)%,(0.56±0.25)%、(12.14±3.70)%、(19.61±3.63)%、(30.43±2.83)%]、Bax mRNA表达水平[(12.73±3.96)、(25.12±6.42)、(104.96±26.77)、(154.04±3052),(14.63±3.57)、(36.75±3.67)、(272.26±66.11)、(846.12±243.36),(14.75±5.65)、(37.22±11.27)、(278.51±37.42)、(861.67±369.29)]、Bax蛋白表达水平[(15.07±0.83)%、(23.79±3.99)%、(3851±158)%、(53.86±124)%,(15.43±1.45)%、(36.11±1.37)%、(56.86±1.97)%、(76.09±2.01)%,(15.20±1.03)%、(35.25±1.09)%、(55.56±2.17)%、(74.48±2.85)%]均随着染毒剂量的增加而增高(P均<0.05),而bcl-2 mRNA表达水平[(443.00±244.47)、(156.79±53.18)、(62.13±13.66)、(23.10±6.44),(420.55±110.77)、(48.15±10.02)、(14.91±6.53)、(7.54±2.62),(577.75±123.22)、(49.68±10.11)、(12.41±1.28)、(7.22±1.89)]、bcl-2蛋白表达水平[(47.20±3.77)%、(41.80±2.94)%、(36.00±2.36)%、(29.00±2.91)%,(45.90±4.15)%、(35.70±2.77)%、(29.80±2.78)%、(24.80±2.66)%,(46.70±3.47)%、(36.20±2.90)%、(30.10±3.21)%、(25.10±2.28)%]均随着染毒剂量的增加而降低(P均<0.05);在染砷3、9、15 mmol/L时,p53组的细胞凋亡率、bcl-2 mRNA表达水平、bcl-2蛋白表达水平均高于同一染砷剂量的正常组和PC组(P均<0.05),而Bax mRNA表达水平、Bax基因蛋白表达水平均低于同一染砷剂量的正常组和PC组(P均<0.05).结论 p53基因减少了NaAsO2致HELF的凋亡,可能是通过改变部分凋亡途径实现.     

生存素基因突变体诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的 生存素(survivin)基因在胃癌组织中高水平表达，而在正常胃黏膜中无表达。生存素表达的水平与胃癌的预后密切相关。通过基因重组构建生存素基因突变体(pcDNA3—survivin—mutant，Cys84Ala)质粒，并以脂质体转染的方法将质粒DNA转入胃癌细胞株，观察其对胃癌细胞的生物学特性及多药耐药性的影响。方法 应用RT—PCR、Western blot、免疫组化等方法检测胃癌细胞中生存素基因mRNA和蛋白的表达，流式细胞仪和吖啶橙染色检测胃癌细胞凋亡。结果 通过RT—PCR检测，在所有的胃癌细胞株中均有不同程度生存素基因表达，生存素基因突变体Cys84Ala通过抑制野生型生存素基因的功能诱导胃癌细胞凋亡，增加caspase—3活性和促进细胞色素C的释放，增加胃癌细胞对化疗药物的敏感性。结论 突变体Cys84A1a能诱导胃癌细胞凋亡和增加胃癌细胞对化疗药物的敏感性。因此，生存素基因突变体Cys84Ala有可能成为胃癌治疗的一个候选基因。     

中药抗癌方诱导人结肠癌细胞株细胞凋亡的实验研究

目的;研究中药的抗癌方（ＫＡＦ）对人结肠细胞凋亡的影响。方法：选择人结肠癌细胞株ＨＢ８６９３作为靶细胞,用ＭＴＴ掺入试验测定细胞毒作用,用流式细胞仪检测计算ＨＣ８６９３细胞株的亚Ｇ１峰细胞（凋亡）的百分率,并与空白对照组比较。     

脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗实验研究

目的　用杂交瘤技术制备脐血树突状细胞 (DC)和食管癌细胞融合疫苗 ,分析其生物学特征及体外诱导特异性免疫应答的能力。方法　 2 0 0 2 - 0 12 0 0 3- 0 3汕头大学医院第一附属医院分离脐血CD3 4 干细胞并诱导扩增为成熟DC ,并与EC10 9细胞融合 ,免疫磁珠法筛选EC10 9 DC ;流式细胞术鉴定疫苗表型 ;绘制疫苗生长曲线 ;MTT法测定瘤苗诱导淋巴细胞增殖能力及体外特异性免疫应答能力。结果　疫苗可体外生长 ,高表达CD80 、CD83 和CD86,并能有效刺激淋巴细胞增殖反应 ,体外诱导细胞毒T细胞 (CTL)对EC10 9的杀伤活性显著高于对照组 (P <0 0 5 )。结论　EC10 9 DC具备了刺激免疫细胞活化的分子表型 ,能在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导特异性CTL杀伤作用     

中药姜黄素对肿瘤细胞周期及自由基的影响

姜黄素是中药姜黄根茎中的主要成份,具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理作用。早期研究认为,姜黄素能抑制体外淋巴瘤细胞的生长和体内由TPA、PMA、AOM等诱导的动物肿瘤的形成。本文探讨了姜黄素对人结肠癌细胞LoVo体外生长、细胞周期及其细胞内自由基的影响。MTT结果表明姜黄素对LoVo细胞具有细胞毒作用。20μM、40μM浓度的姜黄素对细胞的抑制率分别是为41.9％、78.1％。5-10μM浓度抑制作用小,姜黄素对LoVo细胞的IC_(50)为21.8μM。姜黄素处理24h时,主要使细胞阻滞于S,G_2 M期,使此期细胞比例增加。而G_(0/1)期的细胞比例减少。处理48h后,G_2 M期的细胞比例反而降低,部分可能由于G_2 M期细胞并发凋亡所致。姜黄素对肿瘤细胞内自由基形成的抑制作用结果表明,浓度大于10μM的不同姜黄素处理组和对照组比较MDA含量明显下降(p<0.01),各处理组间则无显著性差异(p>0.05),而5μM姜黄素无抑制作用。结论:姜黄素可抑制结肠癌LoVo细胞的生长。其机制可能与干扰细胞周期及抑制细胞内自由基的生成有关。     

人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP的建立及其生物学特征

目的:建立人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP,探讨其生物学特征.方法:采用顺铂(cDDP)中等浓度、间歇作用方法历时9mo建立耐药细胞系Ec9706/cDDP,采用MTT法测定其对cDDP的耐药指数,观察冻存、撤药对耐药性的影响,比较耐药与亲本细胞生长曲线、群体倍增时间及贴壁率的不同,流式细胞仪测细胞周期,软琼脂实验测细胞的恶性增殖能力,罗丹明实验测其对药物的摄入、排出能力.结果:人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP的耐药指数为15.7,冻存对耐药性影响不大,撤药培养可使耐药性降低,耐药细胞群体倍增时间延长(29.79±0.48hvs25.79±0.45h,P<0.05),生长缓慢,G0/G1、S期细胞比例增加(63.18%±5.21%vs52.81%±4.36%,P<0.05;36.49%±3.93%vs26.70%±2.62%,P<0.05),G2期细胞减少(0.33%±0.02%vs20.49%±3.71%,P<0.05),克隆形成率明显高于亲本细胞(69%vs24%,P<0.05),对罗丹明的摄入减少,排出增多.结论:成功建立了人食管癌顺铂耐药细胞系Ec9706/cDDP,且耐药性较稳定.     

人肝癌多药耐药细胞株survivin蛋白的表达及意义

目的探讨人肝癌多药耐药细胞株survivin蛋白表达与肝癌细胞多药耐药的关系.方法用阿霉素(DOX)浓度梯度递增导法,建立人肝癌多药耐药细胞株(Bel-7402/DOX).用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率,同时用蛋白印迹(Western blot)检测其survivin蛋白表达.结果随着培养液中 DOX 浓度的增加Bel-7402/DOX 的凋亡率逐渐增加,survivin蛋白的表达逐渐增强.结论Survivin蛋白的表达变化可能与人肝癌细胞获得性耐药有关.     

表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人结肠癌细胞的增殖

目的:建立稳定表达反义表皮生长因子受体(EGFR)的人结肠癌细胞系,研究细胞的生物学行为.方法:应用脂质体介导法将重组克隆携带反义EGFR的逆转录病毒载体转染人结肠癌细胞系LST174,利用细胞计数、生长曲线、MTT法及软琼脂集落形成率测定细胞生长、增殖及恶性表型的转化.结果:转染稳定后的细胞易脱落,细胞膜毛糙,细胞生长呈小片状,不密集.细胞继续培养后,LST174/AS-EGFR组细胞生长受到抑制,生长曲线较LST174组速度减慢,差别显著(A值:0.322±0.014vs0.422±0.033,P<0.05);细胞生长抑制率为23.7%,LST174/AS-EGFR组细胞几乎失去了集落形成能力,且少、松散,而对照组呈叠落堆积生长.结论:反义EGFR对内源性EGFR自分泌因子表达的阻断可抑制结肠癌细胞的生长、增殖及恶性表型的转化.     

重组Runx3腺病毒对顺铂致肝癌细胞凋亡效应的影响

目的观察腺病毒介导的Runx3基因（Ad-Runx3）联合顺铂（DDP））对肝癌细胞HLE增殖的抑制效果。方法通过Ad-Runx3感染HLE,采用RT-PCR方法检测Runx3基因在HLE中的转录,用Ad-Runx3联合DDP处理培养的HLE,采用Western blot法检测HLE中Runx3表达情况,MTT法检测HLE细胞生长抑制率,流式细胞术检测HLE细胞周期和凋亡率。结果 Ad-Runx3感染HLE后即有目的基因转录,感染48 h后,Runx3呈高表达;加入100感染复数（MOI）的Ad-Runx3与6.25μg/ml的DDP后5 d,HLE细胞生长抑制率达92.46%±1.13%,显著高于单加Ad-Runx3者的59.28%±1.37%和单加DDP者的46.37%±2.51%（P均〈0.05）。加入Ad-Runx3与DDP的HLE其细胞阻滞于G2/M期,S期细胞减少,细胞凋亡率为18.62%±2.48%,显著高于单用Ad-Runx3者的8.66%±0.78%和DDP者的7.48%±0.32%（P均〈0.05）。结论 Ad-Runx3可增强DDP致肝癌细胞HLE增殖抑制作用,提高其细胞凋亡率。     

A new human cholangiocellular carcinoma cell line (KMC-1)

We have recently established a cholangiocellular carcinoma (CCC) cell line, designated KMC-1, from a nude mouse subcutaneous tumor which developed after inoculation of a surgically resected peripheral type CCC from a 62-year-old Japanese male patient. KMC-1 cells grew over a 26-month period and passaged 57 times. These cells retained the morphologic characteristics of both the original tumor and the subcutaneous tumor in the nude mouse, which mainly consisted of irregular tubules and invaded surrounding interstitial tissue in part with an indurate pattern. KMC-1 cells grew in a monolayer pavement-like cell arrangement with tubular formation in part. Some cells and/or glands had a mucin-like substance inside. The doubling time of KMC-1 cells growing in serum-containing medium was 54 h at passage 31. Cell growth in serum-free medium was slow but steady. The number of chromosomes was distributed in range from 73 to 83 with modes of 76 and 78. KMC-1 cells secreted some tumor markers such as DUPAN-2, CA125, TPA, hCG, CA19-9 and ferritin, however, the secretion of DUPAN-2, and CA19-9 and ferritin were only detectable in serum-containing and serum-free medium, respectively. These findings suggest that KMC-1 cells will provide a variety of experimental models for research on CCC and the mechanisms of tumor marker secretion.     

血管活性肠肽对体外大肠癌 HT29细胞粘附和侵袭作用的影响

目的观察血管活性肠肽(VIP)和双丁酰环磷酸腺苷(db-cAMP)对体外大肠癌 HT29细胞对大鼠血管内皮的粘附和侵袭的影响。方法取出大鼠主动脉,建立体外癌细胞—血管内皮粘附试验模型。用光镜和扫描电镜观察 HT29细胞对大鼠血管内皮粘附作用和其形态学变化,以及 VIP 和 db-cAMP 对细胞粘附的影响并在扫描电镜上计数量化分析。结果在血管内皮上可清晰辨认癌细胞并可观察其对血管内皮的粘附和侵袭的形态学改变.VIP 组的粘附细胞和高活性粘附细胞显著多于对照组(P<0.05),相反 db-cAMP 则无此作用.结论 VIP可促进体外 HT29细胞对血管内皮的粘附和侵袭,其机制可能与激活癌细胞 A 激酶系统有关。     

二甲双胍对人胰腺癌细胞迁移的抑制作用

目的:研究二甲双胍对胰腺癌细胞迁移的影响,并初步探讨可能机制.方法:体外培养人胰腺癌细胞株Bxpc-3,予二甲双胍进行干预作为实验组(M组),无药物组作为对照组(C组).MTT检测二甲双胍对Bxpc-3细胞存活率的影响,细胞划痕实验检测划痕愈合率,RT-PCR检测MMP-2、MMP-9 mRNA的表达,Elisa检测细胞培养上清液MMP-2、MMP-9蛋白的分泌量.结果:与对照组相比,MTT结果示二甲双胍可以抑制人胰腺癌细胞株Bxpc-3的增殖,并呈时间-浓度依赖性(F=8.991,124,114.61,P<0.01);划痕实验示二甲双胍干预组12、24、48h与对照组相比划痕愈合率显著下降(t=7.683,9.013,10.471,P<0.01);RT-PCR示二甲双胍干预组MMP-2、MMP-9mRNA的表达显著降低(t=16.563,28.494,P<0.01);Elisa示二甲双胍干预组MMP-2、MMP-9蛋白分泌明显下降(t=9.428,13.542,P<0.01).结论:二甲双胍能显著抑制人胰腺癌细胞株Bxpc-3的增殖及迁移,其主要机制可能与抑制MMP-2、MMP-9活性有关.