穿透支原体P35蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的为研究穿透支原体(Mpe)35 kD脂质相关膜蛋白(P35)的生物学活性,构建其原核细胞表达载体,并在大肠杆菌(E.coli)中表达.方法 PCR扩增p35基因片段,克隆至pQE31载体, 用PCR介导的突变将p35基因中两个“TGA”终止密码子定点突变为“TGG”,使其在E.coli中编码表达色氨酸.IPTG诱导pQE31/P35在E.coli 中表达目的蛋白rP35,经Ni-NTA Spin亲和纯化, Western blot分析鉴定表达产物. 结果 PCR扩增出约1kb的DNA片段,克隆至pQE31载体,筛选到阳性克隆pQE31/P35,测序分析 p35基因中两个“TGA”终止密码子成功突变成“TGG”. IPTG诱导pQE31/p35在E.coli 中表达分子量约37.4 kD的蛋白质,Western blot分析鉴定其为rP35. 结论构建的pQE31/p35原核表达载体,在E.coli中成功地表达rP35.     

人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

肺炎嗜衣原体Pmp21蛋白原核表达载体的构建

目的 PCR扩增肺炎嗜衣原体多形态膜蛋白Pmp21基因,构建pGEX-6p-2/Pmp21原核表达载体。方法筛选Pmp21优势抗原表位,PCR法扩增Pmp21目的基因;并亚克隆至pGEX6p-2原核表达载体;经PCR与测序鉴定。结果软件分析选择Pmp21优势抗原表位编码基因的154bp～885bp位碱基序列,设计引物PCR法扩增得到目的片段;构建重组质粒经测序鉴定,BLAST比对与Genbank上登录序列完全一致。结论成功构建pGEX-6p-2/Pmp21载体,为研究Pmp21在Cpn感染中的作用奠定基础。     

乳糖酶在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的克隆并分析乳酸菌LacZ基因,构建其原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,并纯化得到纯度较高的目的蛋白。方法采用PCR方法从乳酸菌中扩增出LacZ基因,测序和序列分析。将其克隆至克隆载体pGM-Tvector中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-6p-1/LacZ。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析鉴定,最后通过纯化得到单一的目的蛋白。结果 PCR扩增获得3024bp的LacZ基因,测序得知序列与GeneBank报道的序列一致,序列分析表明,该序列开放读码框有3024bp,推测肽链具有1008个氨基酸,蛋白分子量为114KDa,等电点为4.9。构建了重组表达质粒pGEX-6p-1/LacZ,IPTG诱导其高效表达出融合蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析鉴定出所表达蛋白的分子量为140KD,与融合蛋白的分子量一致。最后利用Glutathione Sepharose 4B对表达产物进行纯化,得到单一的目的蛋白。结论成功地构建了乳酸菌LacZ基因的原核表达质粒,通过序列分析并诱导表达,最后纯化得到单一的目的蛋白,为进一步生产低乳糖奶奠定基础。     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

粪肠球菌明胶酶的克隆及原核表达

目的克隆粪肠球菌明胶酶gelE基因并原核表达。方法 gelE基因克隆连接至pGEX-4T-1载体,转化至E.coliBL21诱导表达。结果成功扩增基因并构建gelE-pGEX-4T-1重组质粒,测序无碱基突变,在E.coli中高效表达。结论粪肠球菌明胶酶成功原核高效表达。     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

SARS冠状病毒受体结合域在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的为了研究SARS冠状病毒感染与免疫和跨种属传播机制,从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒spike蛋白基因中,克隆病毒受体结合域（receptor binding domain,RBD）基因片段,在大肠杆菌中进行表达。方法用PCR方法扩增RBD基因,先经T-A连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆测序鉴定,双酶切后进一步亚克隆至质粒pGEX-6p-3,构建原核表达重组质粒,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达,并用SDS-PAGE和Western-blotting方法检测表达情况。结果扩增了RBD的编码基因并成功构建了其原核表达载体pGEX-6p-3-hsRBD和pGEX-6p-3-csRBD,RBD能够在大肠杆菌中获得良好的表达,表达的融合蛋白相对分子质量约为47000。结论本工作利用基因工程技术表达了两物种来源的SARS冠状病毒的RBD,两者具有高度的同源性,因此我们可通过配基受体结合实验,为进一步研究SARS冠状病毒感染与免疫及跨种属传播机制奠定了基础。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体构建及表达的实验研究

目的 研究改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达.方法 首先通过基因拼接法合成VP3基因并委托生物技术公司合成改良型TAT基因.然后于原核表达载体pGEX-6p-1上构建改良型TAT-VP3融合蛋白的基因.最后将构建好的原核表达载体转导入基因工程菌DH-5α中并诱导其表达.结果 成功合成了VP3基因,构建了改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达载体,并经基因测序证明构建无误;成功的在基因工程菌DH-5α中诱导了改良型TAT-VP3融合蛋白的表达.结论 改良型TAT-VP3融合蛋白的基因合成、原核表达载体的构建及其原核表达是可行的,为进一步的蛋白制备及活性研究打下了基础.     

肺炎嗜衣原体CPAF原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的对肺炎嗜衣原体蛋白酶样活性因子（CPAF）基因进行原核表达,为肺炎嗜衣原体的诊断及疫苗研究奠定基础。方法利用PCR技术从肺炎嗜衣原体标准株AR-39中扩增CPAF基因,将其克隆于原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达载体。并用双酶切、PCR及序列测定等方法进行鉴定后,在大肠杆菌中诱导表达GST融合蛋白。结果重组质粒中CPAF基因序列与肺炎嗜衣原体AR-39的同源性达到100％,CPAF在大肠杆菌中表达高效的GST融合蛋白。结论成功构建肺炎嗜衣原体CPAF基因的原核表达系统,并成功表达重组蛋白．为肺炎嗜衣原体疫苗的研究和临床检测试剂盒的研制打下基础。     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.     

GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

体外鉴定甲状旁腺激素相关蛋白与Bmi-1的相互作用

目的: 探索并鉴定甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)与Bmi-1的结合作用,为进一步研究PTHrP相关信号转导通路提供线索?方法:应用RT-PCR方法体外扩增鼠源性PTHrP基因,经测序后重组人原核表达载体pGEX-2TK,将构建正确的pGEX-2TK/mPTHrP原核表达载体转化E.coli BL21,IPTG诱导表达?表达产物经活性鉴定,通过体外GST pull-down技术和免疫印迹实验,检测PTHrP与Bmi-1蛋白的相互作用?结果:成功构建和表达了重组载体pGEX-2TK/mPTHrP;通过体外蛋白质结合实验证实了PTHrP与Bmi-1蛋白可以相互作用?结论:PTHrP与Bmi-1蛋白之间存在相互作用,此结果为研究PTHrP介导的下游信号转导通路的机制奠定了基础?     

不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达

目的 构建不同激酶活性的hPAK6原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达.方法 野生型、激酶活型和激酶死型pcDNA3.1-PAK6经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在E.coli BL21中诱导不同型GST-hPAK6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果.结果 野生型、激酶活型和激酶死型hPAK6编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,双酶切及测序鉴定正确,并在E.coli BL21中获得了诱导表达,蛋白的分子量均为101 kDa,免疫印迹检测到了融合蛋白表达.结论 成功构建不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体,并分别诱导表达出GST-PAK6融合蛋白.     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

GST-SRY融合蛋白原核表达和纯化

目的 构建GST-SRY融合蛋白原核表达载体, 在E.coli中诱导其表达, 并进行纯化.方法 PCR扩增SRY基因, 将SRY基因插入原核表达载体p GEX-6P-1, 经酶切和测序验证后, p GEX-6p-1-SRY转化到原核表达菌株E.coli Rosetta DE3, IPTG诱导表达GST-SRY融合蛋白, 用GST标签纯化树脂对其进行纯化.结果 经双酶切和测序证实p GEX-6P-1-SRY构建正确.重组质粒转化到Rosetta DE3经IPTG诱导后表达了分子质量单位约为49 KD的重组蛋白.结论 p GEX-6P-1-SRY原核表达载体构建成功, SRY蛋白成功诱导表达并纯化, 为今后深入研究SRY蛋白的功能奠定了实验基础.     

含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定含自杀基因酵母菌Fcy：：Fur融合基因的重组逆转录病毒表达载体，拟将用于肿瘤的基因治疗研究。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pORF5-Fcy：：Fur为模板，采用常规PCR方法扩增Fcy：：Fur融合基因，并将其分别克隆进测序载体PCS2^ 及原核表达载体pGEX-6p-1进一步进行核酸序列测定和原核诱导表达研究。用EcoRⅠ和BamHⅠ将Fcy：：Fur融合基因从测序载体上切出，按正确阅读框架克隆进pLXSN中，重组子鉴定采用PCR法和酶切消化。结果：序列测定表明，扩增的基因即为Fcy：：Fur序列．Fcy：：Fur融合基因在大肠杆菌中获得了融合表达；重组逆转录病毒表达载体经PCR及双酶切鉴定表明：Fcy：：Fur以正确方向插入到pLXSN中。结论：成功构建含有自杀基因Fcy：：Fur的逆转录病毒表达载体，为进一步进行肿瘤实验性基因治疗奠定基础。     

人MMP-11原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11的构建及其融合蛋白的表达和纯化

目的构建表达人基质金属蛋白酶-11(MMP-11)N-端肽段的重组原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,获得人源性MMP-11融合蛋白。方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从正常人子宫内膜组织扩增目的基因片段,利用体外基因重组技术将目的基因片段连接到原核表达载体pGEX-5X-3上构成重组的原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,并通过酶切和测序进行鉴定。将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,用异丙基硫代半乳糖苷诱导其融合蛋白的表达并进行纯化。结果RT-PCR获得预期大小的特异性DNA片段,经双酶切鉴定及测序证实已将人基质金属蛋白酶-11N-端肽段的cDNA片段正确插入原核表达载体中。融合表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,证实相对分子量大小为4550。结论成功构建了表达人MMP-11N-端肽段的重组原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,获得相对分子量为4550的GST-MMP-11融合蛋白,为进一步制备抗人MMP-11抗体及其在临床中进一步推广应用于恶性肿瘤的快速诊断及临床疗效的评价奠定了基础。