小鼠内皮抑素基因的克隆及序列测定

目的 获取小鼠内皮抑素（endostatin)基因并进行序列测定,为今后研究其机制及应用创造条件。方法 以小鼠肝脏总RNA为模板,用RT-PCR法从中扩增endostatin基因,并将所得基因重组入pUC19载体质粒,采用自动测定仪及荧光素标记引物,测定目的基因序列。结果 从小鼠肝组织中成功扩增endostatin基因,莘成功克隆入pUC19载体。经酶切鉴定正确后,命名为pUC-Endo。经测序证实所获基因序列与已知的endostatin基因序列一致。结论 成功构建小鼠endo-statin基因的重组克隆pUC-Endo,为今后利用endostatin进行胶质瘤的抗血管生成治疗研究奠定了实验基础。     

内皮抑素抑制黑色素瘤浸润转移的实验研究

【目的】研究内皮抑素对小鼠B16黑色素瘤中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及组织基质金属蛋白酶抑制剂-2（TMP-2）表达的影响,并阐述相关分子机制。【方法】建立小鼠B16黑色素瘤动物模型,分为内皮抑素实验组和空白对照组,构建组织芯片,应用免疫组化方法检测两组肿瘤组织MMP-9、MMP-2及TIMP-2的表达。【结果】MMP-2、MMP-9和TIMP-2在实验组与对照组间的表达差异均具有统计学意义（t=15．002,t=9．852,t=12．893,P〈0．05）。【结论】内皮抑素影响黑色素瘤组织表达MMP-2和MMP-9,抑制肿瘤生长和局部浸润转移。     

人内皮抑素基因的克隆与测序

目的　获得人内皮抑素 (endostatin)功能区段基因片段 .方法　从人肝组织提取 m RNA,用反转录聚合酶链反应技术克隆 endostatin基因 ,2 0 g· L- 1 脂糖凝胶电泳后将其重组入 p UC19载体 ,双脱氧末端终止法测定其核苷酸序列 .结果　经 Genbank分析证实 ,所获得的 5 5 2 bp基因片段属于endostatin功能区段基因 ,序列正确 .结论　本研究为应用endostatin基因进行实体瘤抗血管生成治疗奠定了基础     

基因转染内皮抑素与阿霉素协同作用对小鼠肝癌细胞的影响

目的 探讨内皮抑素作为一种抑制血管生成的蛋白,能否与阿霉素协同作用治疗肝细胞癌(HCC).方法 构建内皮抑素表达质粒和在BALB/c裸鼠皮下建立HepG2人肝细胞肝癌动物模型,用阿霉素和生长抑素表达质粒基因转染治疗.结果 构建的内皮抑素表达质粒在体内、外均可稳定表达.内皮抑素蛋白与阿霉素协同抑制肿瘤和血管内皮细胞的增殖.内皮抑素基因治疗及阿霉素均可抑制裸鼠皮下肿瘤的生长及新生血管的生成,并且呈现协同作用.内皮抑素基因转染下调了缺氧诱导因子(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,而阿霉素仅能下调VEGF的表达.内皮抑素及阿霉素协同下调VEGF的表达.结论 内皮抑素及阿霉素联合作用对抑制HCC治疗有确切效果,内皮抑素可提高阿霉素对肝癌细胞生长的抑制.     

携带内皮抑素基因的重组腺病毒的构建

目的 利用AdEasy-1系统,构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,为后续的实验奠定基础.方法 以PshuttleEndostatin质粒为模版PCR扩增内皮抑素基因片断,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在AAV293细胞中包装并扩增.结果 重组腺病毒经测序、酶切鉴定正确,病毒滴度为2.06×1010 pfu/ml.结论 人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功.     

内皮抑素基因治疗肾细胞癌的进展

肾细胞癌(RCC)是泌尿系统中常见的恶性肿瘤,其生物学行为极为复杂,对放疗和化疗均不敏感,肿瘤血管形成丰富为其主要特点.肿瘤新生血管形成在肿瘤生长、侵袭和转移过程中起着决定性的作用.内皮抑素(Endostatin,ES)是一种能够强烈抑制血管形成的因子,能够有效抑制RCC肿瘤细胞的生长和转移.本文就内皮抑素的发现、性质、结构、生物学功能,内皮抑素基因治疗RCC的抑制作用机理及其目前在临床上的应用进行了简要的总结和概括.     

内皮抑素抑制黑色素瘤血管生成的实验研究

【目的】研究内皮抑素对黑色素瘤血管生成的影响,及其对肿瘤细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达的影响,并阐述其相关分子机制。【方法】C57/BL6小鼠40只,建立小鼠B16黑色素瘤动物模型,分为内皮抑素组和空白对照组,比较两组肿瘤内血管生成拟态(VM)和内皮依赖性血管的数目;构建组织芯片,应用免疫组织化学技术染色检测肿瘤组织PCNA的表达;电镜观察两组肿瘤内微血管的超微结构变化。【结果】实验组肿瘤中VM和内皮依赖性血管数量均少于对照组,且差别有统计学意义;实验组PCNA表达阳性率与对照组相比差异有统计学意义。【结论】内皮抑素可抑制黑色素瘤内皮依赖性血管和拟态样血管的生长,进而影响肿瘤细胞PCNA的表达。     

超声微泡介导内皮抑素基因转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

目的：探讨超声微泡介导内皮抑素（endostatin,ES）基因对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells ,HUVECs）转染的效率及可行性。方法 HUVECs种于24孔板内,培养24 h后加入5μg pIRES2-EGFP-ES质粒及超声造影剂SonoVue微泡,启动超声照射进行转染,设定MI分别为0.7、1.0、1.5,辐照时间分别为10 s、30 s、60 s、120 s,微泡浓度分别为10％、20％、50％。转染24 h后观察绿色荧光蛋白表达,计数活细胞数,MTT检测细胞增殖抑制率。结果超声爆破微泡介导了内皮抑素基因转染HUVECs,并具有强度、时间及微泡浓度依赖关系,但随着强度、微泡浓度增加及辐照时间延长,细胞凋亡率增加、细胞活力下降,转染率随之下降,当超声强度MI1.5、辐照时间60 s、微泡浓度20％转染率相对最高。结论超声微泡可介导内皮抑素基因转染脐静脉内皮细胞,但转染受多因素影响,在相对最佳转染条件下可实现内皮抑素的高表达。     

血管内皮抑素基因转染人脐带血CD34+造血干细胞的实验研究

目的：探讨人血管内皮抑素(内抑素)基因转染人脐带血CD34^ 造血干细胞的方法及检测。方法：用逆转录病毒载体pLNCX，将人内抑素基因导人人脐带血CD34^ 造血干细胞。应用PCR及Western bolt方法检测人内抑素基因的转染和表达。结果：PCR证实，转染内抑素基因的人脐带血CD34^ 造血干细胞基因组中有550bp人内抑素特异性片段，Western bolt分析示人内抑素基因在转染细胞中获得稳定表达和分泌。结论：人内抑素基因可转染到人脐带血造血干细胞中并稳定表达。     

表达内皮抑素基因的内皮祖细胞治疗肝癌的初步研究

目的:观察内皮抑素(endostatin,ES)基因转染的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对小鼠肝癌细胞H22增殖的影响,探讨联合自体EPCs和ES基因治疗肝癌的可行性和有效性?方法:构建表达ES基因的慢病毒载体,培养小鼠骨髓源EPCs,运用qPCR检测培养内皮细胞表面标记CD31?血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)?血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)表达,电镜观察内皮细胞特征小体?实验分EPCs组?EPCs+LV空病毒载体组?EPCs+ES组?CCK-8法检测各组细胞增殖的情况?同时构建原位肝癌小鼠模型,尾静脉注射3组细胞后不同时间点处死小鼠,测量肿瘤大小并进行统计分析?结果:①酶切和测序?PCR鉴定证实成功构建慢病毒载体pLenti6.3-ES-Monomer-DsRed;②qPCR显示培养细胞表达内皮细胞标志CD31?VEGFR?vWF,透射电镜下在细胞质内可见多个散在内皮细胞特征性Weibel-Palade小体(WP小体);③慢病毒载体Lenti6.3-ES-Monomer-DsRed转染小鼠骨髓源性EPCs后荧光显微镜下可见细胞呈红色荧光;EPCs+ES组细胞上清较对照组上清液对小鼠肝癌细胞H22体外增殖具有明显抑制作用,体内实验显示EPCs+ ES组肝癌生长速度慢于对照组?结论:小鼠骨髓源单个核细胞体外可以诱导培养为内皮祖细胞,负载ES基因的EPCs体外可以抑制小鼠肝癌细胞H22的增殖,体内可以抑制小鼠肝癌生长?     

Experimental inhibition of corneal neovascularization by endostatin gene transfection in vivo

Objective To investigate endostatin gene therapy of rat corneal neovascularization induced by acid cauterization. Methods pBlast-hEndostatin and pBlast-Mcs were identified by digestion with Nhe Ⅰand Sal Ⅰ, by PCR reaction, by sequence, and then by alignment of PCR products with the geneBank using NCBIBLAST software. They were then purified with QIAGEN Endofree plasmid maxi kit. Rat corneal neovascularization models were made with 75% AgNO3 and 25% KNO3 cauterization. The treatment method was subconjunctive injection of the pBlast-hEndostatin with the control of pBlast-Mcs. Results pBlast-hEndostatin was found to contain the human endostatin gene. The rat corneal neovascularization induced by acid cauterization was significantly suppressed after subconjunctive injection of the pBlast-hEndostatin with inhibition rates of 37%, 40.2%, and 42.8% respectively on the sixth, tenth, and fifteenth day. The inhibition rate for the density of corneal neovascularization was 40%. However, no inhibition effect on the length of the neovascularization and corneal inflammatory cells was observed. Corneal neovascularization areas were positively correlated with edema and corneal opacity.Conclusions The plasmid of pBlast-hEndostatin contained the human endostatin gene. The rat corneal neovascularization induced by acid cauterization can be partially inhibited by subconjunctive injection of the pBlast-hEndostatin mediated by liposomes. Endostatin produced by transfected fibroblast cells directly inhibits corneal neovascularization. This is not caused by inflammatory reaction inhibition.     

Retroviral endostatin gene transfer inhibits human colon cancer cell growth in vivo

Thegrowthandprogressionoftumorsisdependentonangiogenesis 1Theabilitytomodulatethe“angiogenicswitch”byup regulatingthereleaseofangiogenesisinhibitorsanddown regulatingtheproductionoftumor associatedangiogenicfactorsshouldprovideastrategytodisrupttumorsviatheirvascularnetwork 1,2 　Amongthealreadydescribed potentialangiogenesisinhibitors,themostpotentoneisafragmentoftype XⅧcollagen ,namelyendostatin 2 　Inthisstudy ,weconstructedaretrovirusthatexpressesasecretableendostatin ,andassesseditsbio…     

Anti-tumor effect of human endostatin mediated by retroviral gene transfer in nude mice

目的　探讨逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因 (endostatin)对人肝癌细胞的生长抑制作用。方法　利用逆转录病毒载体pLncx构建含有人endostatin基因及信号肽的重组逆转录病毒质粒 ,并将其导入PA317细胞制备重组病毒。用重组病毒感染人肝癌细胞SMMC772 1获得稳定转人endostatin基因细胞株 (SMMC endo)。同样用空白病毒质粒制备对照细胞株SMMC pLncx。免疫组化及Westernblot检测人endostatin基因在转染细胞株中的表达和分泌。应用血管内皮细胞生长抑制试验验证转染细胞株表达的人endostatin的生物学活性。同时对转染细胞株在体内外的生长情况进行观察。结果　免疫组化及Westernblot印迹分析证实转染人endostatin基因的肝癌细胞能表达并分泌人endostatin。与转染空白对照组 (SMMC pLncx)相比 ,表达人endostatin的SMMC772 1浓缩上清可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞生长 ,抑制率达 4 8% ,明显高于对照组 10 2 % (P <0 0 1)。体外生长实验显示 ,SMMC endo细胞与对照细胞SMMC pLncx体外生长速率无明显差别。而在转染细胞接种裸鼠 2 2d后 ,转染人endostatin基因的肿瘤细胞生长明显受到抑制 ,仅在部分裸鼠 (3/ 5只 )体内长出肿瘤 ,并且产生的腹侧肿瘤体积较对照组肿瘤缩小 94 5 % (P <0 0 0 1)。结论　逆转     

腺病毒介导血管内皮抑素基因转染肺癌细胞后的表达

目的:观察重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在体外转染A549细胞后的表达。方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入肺癌A549细胞,以免疫组织化学法、Western印迹法和ELISA法检测内皮抑素在A549细胞中的表达。结果:免疫组化染色、ELISA法和Western印迹法检测:A549细胞中内皮抑素蛋白表达阳性,Ad.Null组及PBS组内皮抑素蛋白未见有表达。结论:Ad.Endostatin转染A549细胞可表达具有生物学活性的内皮抑素。     

内皮抑素基因腺病毒联合化疗治疗小鼠Lewis肺癌

目的:研究腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因联合化疗对肺癌的综合治疗作用.方法:利用病毒重组技术将内皮抑素基因克隆入增殖缺陷型腺病毒基因组中,构建携带内皮抑素基因的重组腺病毒Ad-mES,复制小鼠Lewis肺癌的动物模型,随机分成4组,每组10只:化疗组,皮下隔日注射环磷酰胺150 mg/kg,共3次;基因治疗组,一次性瘤内多点注射6×1010 pfu/ml的Ad-mES病毒纯化液100 μl;基因联合化疗组,Ad-mES病毒纯化液联合环磷酰胺,剂量同上;对照组,以0.9%生理盐水100 μl替代环磷酰胺.定期测量各组肿瘤体积,采用Western印迹分析检测基因转导后肿瘤组织中内皮抑素的表达,应用免疫组化法检测肿瘤微血管密度(MVD),观察内皮抑素基因对肿瘤血管生长的抑制作用.结果:构建了表达内皮抑素的重组腺病毒载体Ad-mES;各治疗组荷瘤C57BL/6小鼠肿瘤生长抑制明显,以基因联合化疗组尤为显著(P＜0.01);基因治疗组和基因联合化疗组MVD与对照组和化疗组相比差异显著(P＜0.05).基因治疗过程中未见明显不良反应,且荷瘤鼠生存期明显延长,以联合治疗组为著(P＜0.05).结论:所构建的Ad-mES重组腺病毒载体可有效表达具有生物学活性的内皮抑素;并能减少肿瘤内微血管生成、减慢肿瘤增殖、延长生存期.     

endostatin基因重组腺病毒的构建及在人肺腺癌细胞的表达

目的 利用AdEasy系统构建鼠内皮抑素(ES)基因重组腺病毒Ad.ES,并观察其在人肺腺癌细胞SPCA-1的表达.方法 采用酶切、连接和转化等方法,将质粒pcDNA3.ES中的ES片段插入腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV,构建重组腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack.CMV.ES,经Pme Ⅰ酶切线性化后与含腺病毒基因骨架的质粒载体pAdEasy-1在细菌BJ5183内进行同源重组得到腺病毒质粒pAd.ES,重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后,转染人胚肾293细胞包装成腺病毒颗粒Ad.ES,将病毒上清反复感染293细胞获得高滴度病毒,应用氯化铯(CsCl)梯度离心的方法纯化病毒,利用AdEasy系统上的绿色荧光蛋白(GFP)标签测定重组腺病毒的功能滴度.用2 MOI重组腺病毒Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h,流式细胞仪检测GFP表达阳性率,ELISA法测定细胞培养上清液中ES的含量.结果 双酶切证实重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV.ES质粒构建正确,卡那霉素抗性筛选和Pac Ⅰ酶切鉴定证实腺病毒重组质粒构建成功.Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒导入293细胞3d,约20%的细胞表达GEP,回收病毒重复感染293细胞,CsCl梯度离心纯化最终获得约5.6×1010TU/mL滴度的重组病毒.Ad.ES体外转导SPCA-1细胞48h后,细胞GFP阳性率为93%,细胞培养上清液中ES的含量较Ad.GFP感染组和阴性对照组明显增加(P＜0.05).结论 应用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和ES的重组腺病毒,Ad.ES体外感染人肺腺癌细胞SPCA-1可显著提高ES表达,为进一步研究抗血管生成治疗肺癌奠定了基础.