应用抑制消减杂交技术克隆人胰腺癌差异表达基因

目的应用抑制消减杂交技术克隆胰腺癌差异表达基因。方法提取胰腺癌和癌旁正常胰腺组织中的RNA和mRNA并合成双链cDNA,经Rsa1酶切后,将胰腺癌双链cDNA分为2组,分别加上不同的接头,再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物克隆至T／A载体,并转化大肠杆菌TOPIOF’构建消减cDNA文库。随机挑选有插入片段的阳性克隆进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到251个白色克隆,随机挑取53个白色克隆进行PCR扩增分析,其中50个克隆有插入片段,克隆阳性率为96％。片段大小主要集中在300—600bp之间。对50个有插入片段的阳性克隆进行测序,得到45个可用序列。同源性分析发现44个为已知基因,1个为无任何功能线索的未知基因,可能代表了新基因。结论应用SSH技术成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,并筛选出1条差异表达基因可能为新的胰腺癌相关基因。为进一步研究胰腺癌发生,发展的分子机量提供了新的线索。     

胰腺癌P53与细胞凋亡相关性研究

目的研究胰腺癌P53基因表达与细胞凋亡的关系及其临床意义.方法采用原位DNA末端标记技术和SP免疫组织化学方法分别对150例异常和正常胰腺组织石蜡包埋标本(其中包括97例胰腺癌、32例胰腺炎和21例正常胰腺组织)进行P53基因表达和细胞凋亡检测.结果(1)P53基因阳性表达率在胰腺癌、胰腺炎和正常胰腺组织中分别为59.8%、3.1%和0%,P53基因表达在胰腺癌组织中明显高于胰腺炎和正常胰腺组织(P＜0.05),细胞凋亡平均指数分别为13.15±8.3、14.21±9.0和11.67±7.9,三种组织内细胞凋亡指数无显著性差异(P＞0.05).(2)P53基因表达与肿瘤分化程度、转移和TNM分期相关,而与病人年龄、性别、肿瘤部位和大小无关.低分化、转移和TNMⅢ与Ⅳ期肿瘤细胞的P53基因阳性表达率显著高于高分化、未转移和TNMI与Ⅱ期肿瘤病人的胰腺癌细胞P53基因阳性率(P＜0.05),P53基因阳性表达胰腺癌患者术后平均生存期为28.7±6.9个月,明显低于P53基因阴性表达患者(39.5±3.4个月),P＜0.05.高分化、TNMI与Ⅱ期肿瘤细胞凋亡指数明显高于低分化和TNMⅢ期与Ⅳ期病人细胞凋亡指数(P＜0.05).(3)胰腺癌P53基因表达与细胞凋亡指数呈负相关关系(r=-0.5016,P＜0.05).结论胰腺癌P53基因表达与细胞凋亡有关,P53可能通过其过度表达抑制胰腺癌细胞凋亡形成的机理,参与胰腺癌形成及发展,特别在胰腺癌后期起作用.P53可作为胰腺癌预后的一个重要指标.     

KAl1基因在十二指肠乳头癌及胰腺癌不同表达的意义

为探讨 KAI1 基因对十二指肠乳头癌及胰腺癌转移的作用,用 Northern blot 分析、原位杂交及免疫组织化学法对9例正常乳头、24例乳头癌、16例正常胰腺和29例胰腺癌进行研究。结果表明,KAI1基因主要定位在细胞质中,在正常乳头及乳头癌之间表达无明显差别(P>0.05);而 KAI1 基因在正常胰腺及胰腺癌组织中的表达明显不同(P<0.05);在非转移的胰腺癌中呈高表达,在转移的胰腺癌中呈低表达。结论:KAI1 基因对乳头癌的转移无明显调控作用,但在胰腺癌中有明显抑制转移的功能。     

基因芯片在肾癌相关基因研究中的应用

目的 :通过研究人肾癌组织和癌旁正常组织中差异表达的基因 ,寻找肾癌相关基因以用于诊断和治疗。方法 :以包含8000个cDNA基因表达谱芯片研究一组肾癌组织样本的基因表达谱。按一步法抽提肾癌和对照组癌旁正常组织的总RNA并纯化mRNA ;将等量的对照组组织和肾癌组织mRNA分别逆转录合成荧光分子掺入的cDNA—链做探针 ,混合后杂交上述基因芯片。经严格洗片后用ScanArray3000扫描仪扫描芯片荧光信号图像 ,计算后分析比较两种组织中差异表达的基因。结果 :共筛选出差异表达基因95条 ,其中未知基因44条。结论 :基因芯片在筛选肾癌相关基因的改变具有快速、高通量、灵敏的特点 ,肾癌在细胞代谢、信号转录、蛋白合成的相关基因方面有异常表达     

肝硬化及肝癌组织共同差异基因表达的筛选

目的 筛选肝硬化和肝细胞癌(HCC)共同表达的差异基因.方法 按TRIzol法分别抽提2例肝硬化、2例HCC和1例正常肝组织总RNA,逆转录合成掺人生物素标记cDNA合成探针,应用基因芯片进行肝硬化及HCC的相关基因表达谱差异分析,扫描芯片荧光信号图像,计算机分析,比较三种组织基因表达谱差异.结果 发现2例肝硬化组织中共有1424条基因(9.82%)表达差片;2例HCC组织中共有2756条基因(19.01%)表达差异;而2例肝硬化与2例HCC组织中有851条基因(5.87%)共同表达差异,其中共同上调基因有649条,共同下调基因有202条.结论 基因芯片技术能快速筛选肝硬化及HCC相关基因,分析这些共同差异性表达的基因,为阐明肝硬化及HCC复杂的生物学特性与基因表达之间的内在联系,寻找识别肿瘤的标记物提供了可能.     

DPC4/Smad4在胰腺癌组织中的表达

目的 检测胰腺癌组织和正常胰腺组织中DPC4/Smad4基因的表达差异,探讨其在胰腺癌发病机制中的作用.方法 分别运用RT-PCR和免疫组化技术检测40例胰腺癌和36正常胰腺组织中的DPC4 mRNA及蛋白的表达.结果 胰腺癌组织中DPC4阳性16例(40%);正常胰腺组织的DPC4的阳性表达率100%(36/36).免疫组化显示癌组织中的弥漫阳性数为4例,局灶阳性数为10例,阳性表达率35%(14/40);正常胰腺组织的弥漫阳性数为16例,局灶阳性数为20例,阳性表达率100%(36/36).两者比较有显著性差异(P＜0.05).结论 DPC4基因在胰腺癌组织中有明显的表达异常,可能与胰腺癌的发病有一定的关系,可考虑作为胰腺癌患者一个临床诊断或预后的指标.     

ATM基因与胰腺导管腺癌发病及放疗增敏研究进展

DNA损伤促修复基因ATM基因在保持机体DNA的完整性及稳定性方面起着重要作用,是重要的抑癌基因。ATM基因在胰腺导管腺癌（PDAC）的发病中同样扮演着重要的角色,在PDAC组织标本中观察到ATM基因缺失或沉默表达的概率显著升高。ATM基因的缺失或沉默表达可促使正常胰腺导管组织中的上皮 间质转化（EMT）,EMT被认为是PDAC的初始病变;另外,ATM基因的缺失或沉默表达,其相关信号通路中的p53和Mdm2基因将呈现过表达,与较短的总体生存期显著相关。同时,ATM基因被认为是胰腺癌放疗的潜在靶点,通过抑制ATM基因能显著提高胰腺癌细胞对放射线的敏感性,值得开展下一步的临床研究。     

胰腺癌中凋亡抑制基因的表达意义

目的　探讨凋亡抑制基因 (survivin)在胰腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法　应用免疫组织化学链霉菌抗生物素 -过氧化酶连接法 (SP法 )检测survivin的表达情况。结果　胰腺癌中survivin阳性表达率为 87.88% ,高于 12例正常胰腺组织 (41.6 7% )具有差异性 (P <0 .0 5 ) ;而 10例良性胰腺疾病组织中均为阴性表达 ,与癌组织比较 ,具有差异性 (P <0 .0 5 ) ,且survivin与胰腺癌病理分级、TNM分期及淋巴结转移情况无关。结论　survivin在胰腺癌中的高表达提示其可能与肿瘤的发生有关 ,是胰腺癌早期而普遍的事件 ,有望成为一新的肿瘤标志物应用于临床 ,协助胰腺癌早期诊断和靶向性治疗。     

K-ras基因在胰腺癌中的研究进展

胰腺癌Ｋ ｒａｓ基因点突变率高达 6 7～ 1 0 0 % [1～ 15] ,突变几乎总是发生在第1 2位密码子上 ,突变方式也几乎皆为ＣＧＴ、ＧＴＴ及ＧＡＴ ,而正常胰腺组织、急慢性胰腺炎、胰岛素瘤、胰腺良性囊肿及胰腺其他疾病均无Ｋ ｒａｓ基因突变。因此 ,检测Ｋ ｒａｓ基因第 1 2位密码子有无突变 ,有助于临床判断胰腺肿块的良恶性及胰腺癌的诊断。本文就近十年来的研究进展及方法作一综述。一、ＰＣＲ ＲＭＣＭ研究ＰＣＲ ＲＭＣＭ (ＲＮＡａｓｅＡｍｉｓｍａｔｃｈｃｌｅａｖａｇｅｍｅｔｈｏｄ ,ＲＮＡ酶不配对分裂法 ) :采用Ｋ ｒａｓ基因的特…     

应用基因芯片技术研究非毒性结节性甲状腺肿基因表达的初步研究

目的筛查非毒性结节性甲状腺肿（NTNG）相关基因,探讨NTNG发生机制。方法分别抽提NTNG患者甲状腺组织及正常甲状腺组织总RNA,逆转录合成相应以Cy5和Cy3标记的探针与基因表达谱芯片进行杂交,扫描芯片荧光信号图像,用对扫描图像进行数字化处理和分析。利用实时荧光定量PCR技术对筛选出的部分表达差异明显的基因进行验证。结果筛选出表达差异明显的基因48个,其中NTNG组中表达上调的基因36条,表达下调的基因12条。荧光定量PCR结果与基因芯片一致。结论NTNG患者甲状腺组织与正常甲状腺组织之间存在明显的基因表达差异,为NTNG患者提供相当数量的与细胞外基质、细胞因子、受体信号转细胞信号传递等相关的差异表达基因,为NTNG早期诊断和治疗提供了线索。     

基因芯片技术筛选宫颈癌相关基因

目的:利用基因芯片技术对原发性宫颈癌标本进行分析,以期探讨宫颈癌基因组中存在的癌基因表达的变异,确定与宫颈癌相关的候选原癌或抑癌基因,为宫颈癌致病机理的研究提供新的线索和依据。方法:对原发性宫颈癌标本组织和正常对照组织进行mRNA抽提,分别给予荧光素Cy5和Cy3标记以制备cDNA探针,并与基因芯片进行杂交和分析。结果:在原发性宫颈癌标本组织中共筛选出存在表达差异的原癌或抑癌基因共11条,占候选基因的3.4%,其中表达明显下降的基因7条,上调基因4条。结论:运用基因芯片技术筛选出与宫颈癌相关的候选原癌或抑癌基因,为宫颈癌致病机理的研究提供新的线索和依据。     

Microarray-based expression profiling in prostate tumors

High throughput gene expression profiling is increasingly becoming a desirable method for identifying genes differentially expressed in disease versus normal tissues. Microarrays and gene chips containing hundreds to thousands of genes of interest, both known and novel, can be used to establish the expression profile of numerous genes in a single experiment. In order to validate the hits emerging out of such an experiment it is necessary to use an appropriate panel of the cDNA repository. We investigated the usefulness of such a method to identify prostate cancer-specific genes. A microarray containing 588 known genes was analyzed using cDNA probes derived from normal and three independent prostate tumors. At least 19/588 genes were found to be differentially expressed in the tumors in comparison to the normal tissue. Among the nine test genes chosen, one gene, Glutathione-S-transferase theta 1 (GSTT1), showed a correlation with the microarray results when analyzed by RT-PCR. Using a comprehensive panel of normal and tumor tissues and cancer-derived cell lines, we have rapidly validated the expression relevance of GSTT1 in solid tumors. The microarray was also useful in the preliminary identification of androgen-regulated genes in the prostate tumor models. These results indicate that microarray in combination with a relevant cDNA repository can facilitate rapid identification of potential targets for therapy and diagnosis of prostate and other cancers.     

表达谱基因芯片筛选肝癌细胞中ATRA下游基因的应用研究

目的：全反式维甲酸( All Trans-Retinoic acid, ATRA)处理肝癌细胞系HepG2细胞后进行表达谱基因芯片技术分析,探索其对肝癌细胞基因表达谱的影响。方法80μmol/L的全反式维甲酸处理HepG2细胞24 h后,提取细胞的mRNA,应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析,以等体积无水乙醇处理作为对照组。结果全反式维甲酸处理HepG2细胞后,共筛选出661个差异表达基因,这些差异基因与肿瘤细胞的信号转导、增殖分化等都有密切的关系。结论成功的应用表达谱芯片技术筛选出ATRA处理细胞后的差异表达基因,为进一步探讨ATRA对肝癌细胞的作用机制奠定了基础,也为临床应用ATRA诱导肝癌分化提供理论依据。     

Identification of novel pancreatic adenocarcinoma cell-surface targets by gene expression profiling and tissue microarray

Pancreatic cancer has a high mortality rate, which is generally related to the initial diagnosis coming at late stage disease combined with a lack of effective treatment options. Novel agents that selectively detect pancreatic cancer have potential for use in the molecular imaging of cancer, allowing for non-invasive determination of tumor therapeutic response and molecular characterization of the disease. Such agents may also be used for the targeted delivery of therapy to tumor cells while decreasing systemic effects. Using complementary assays of mRNA expression profiling to determine elevated expression in pancreatic cancer tissues relative to normal pancreas tissues, and validation of protein expression by immunohistochemistry on tissue microarray, we have identified cell-surface targets with potential for imaging and therapeutic agent development. Expression profiles of 2177 cell-surface genes for 28 pancreatic tumor specimens and 4 normal pancreas tissue samples were evaluated. Expression in normal tissues was evaluated using array data from 103 samples representing 28 organ sites as well as mining published data. One-hundred seventy unique targets were highly expressed in 2 or more of the pancreatic tumor specimens and were not expressed in the normal pancreas samples. Two targets (TLR2 and ABCC3) were further validated for protein expression by tissue microarray (TMA) based immunohistochemistry. These validated targets have potential for the development of diagnostic imaging and therapeutic agents for pancreatic cancer.     

利用基因芯片筛选藜芦定碱对SH-SY5Y细胞神经毒性相关基因

目的利用基因芯片技术研究藜芦定碱对SH-SY5Y细胞相关基因表达的影响。方法体外培养神经细胞SH-SY5Y,不同浓度的藜芦定碱作用8 h后,提取细胞总RNA,纯化mRNA后逆转录制备目标序列,与含有29000种人cD-NA的表达谱芯片HOA 5.1杂交,以AXON4000B荧光扫描仪扫描芯片上的荧光信号,获得的荧光信号的强度应用Rosetta ResolverSystem软件进行差异表达谱分析。结果与正常对照组相比,SH-SY5Y细胞受藜芦定碱50,200,800μmol.L-1作用后,显著差异表达基因分别有71,182,77条,其中上调基因分别有45,81,45条,下调基因分别为26,101,32条。差异表达基因涉及细胞物质与能量代谢、线粒体功能相关基因,细胞周期、细胞分化、细胞凋亡及细胞信号传导相关基因。结论采用基因芯片技术筛选藜芦定碱对SH-SY5Y细胞毒性相关基因,寻找藜芦定碱毒性作用的靶基因,可能为藜芦定碱对神经毒性机制研究提供新思路。     

抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱研究

目的研究抗癌活性肽对人胆囊癌细胞系GBC-SD细胞作用前后的基因表达谱,筛选与抗癌活性肽作用相关的基因表达改变。方法将1152条人类全长基因的PCR产物按微矩阵排列点样于特殊处理的玻片上制备成表达谱芯片;按一步法抽提抗癌活性肽作用前后体外培养的胆囊癌细胞的RNA并纯化mRNA,通过逆转录用两种荧光cy3-dUTP和cy5-dUTP标记对照和实验组胆囊癌细胞cDNA,制成cDNA探针并与表达谱芯片杂交,用ScanArray4000扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,计算机分析判定差异表达的基因。结果在1152条基因中筛选出有差异表达的基因245条,其中上调的121条,下调的124条。结论利用本基因表达谱芯片可同时研究数以千计的基因表达水平,从而在基因水平上探讨抗癌活性肽对胆囊癌GBC-SD细胞作用的机制。     

微小RNA在人髓母细胞瘤中的初步表达分析

目的检测人髓母细胞瘤(MB)与非肿瘤脑组织中微小RNA(miRNA)的表达差异情况,为进一步探讨miRNA参与MB发病的可能分子机制打下基础。方法选取经手术切除的MB组织标本及瘤旁正常小脑组织,分别提取总RNA和小分子RNA,在miRNA微阵列芯片中杂交检测,通过芯片扫描和数据分析,获得该病异常miRNAs表达谱。结果利用miRNA微阵列芯片技术筛选出9个MB的相关miRNAs,其中表达上调4个,表达下调5个。结论miRNA微阵列分析技术是一种快速、高效的研究生物信息的分子生物学技术;筛选出的差异表达miRNAs可能参与MB发病,为此病诊治提供了新的思路,值得进一步研究。     

四氯化碳损伤小鼠肝脏基因表达谱的变化四氯化碳损伤小鼠肝脏基因表达谱的变化

目的研究CCl₄肝损伤小鼠肝脏的基因表达谱，筛选与CCl₄肝损伤相关的基因网络，探讨其肝损伤机制。方法提取小鼠的肝组织总RNA，经反转录分别用Cy3和Cy5荧光标记，制备用于芯片杂交的cDNA探针；cDNA探针与联合基因公司BioStarM-141S小鼠基因表达谱芯片进行杂交，结果由扫描仪扫描并用软件进行分析统计。结果 在CCl₄肝损伤小鼠的基因表达谱中，有379条基因发生了差异性表达(2.69％)。其中，163条基因表达量明显上调，另外216条基因表达量明显下调。结论CCl₄引起小鼠肝脏基因表达谱变化，利用小鼠基因表达谱芯片能大规模、高通量筛选与CCl₄肝损伤相关基因，对进一步阐明CCl₄及类似的化学肝毒物对肝脏的损伤机制有十分重要的意义。