抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体(McAb)。方法将pET32(a)-trSAG1重组质粒转化EscherichiacoliBL21(DE3),用0.1mmol/LIPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性。结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1,轻链均为κ链;Western blot分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合。结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

弓形虫SAG1重组抗原的特征及其应用的研究

用昆虫细胞中表达的弓形虫主要表面抗原（SAGI）为试剂检测弓形虫IgG抗体。方法将昆虫细胞中表达的重组蛋白（rSAGI）通过单克隆抗体制备的亲和层析柱纯化．用纯化的rSAGI为抗原试剂检测弓形虫病血清，与其他试剂盒检测结果比较，然后再用免疫印迹试验确认．结果重组杆状病毒Bac304感染的Sf9细胞与空载bacmid感染的细胞比较，Bac304的SDS裂解物比空载株在SDS—PAGE考马斯亮蓝染色胶上明显多出一条带，分子量约为30kDa．在恒定条件下，分批收集Bac304感染的昆虫细胞，用免疫荧光鉴定，95％以上的细胞可被感染．在Balb／C小鼠中生产的抗SAGI的单抗XllA10C与Bac304的表达产物发生反应，用纯化的单抗与CNBr—Sepharose4B偶联制备的亲和层析柱从1．3X109感染Bac304的昆虫细胞裂解液中获得1．4mgrSAGI，以纯化rSAGI为抗原，采用EIA法检测了412份妇产科就诊者及不明原因淋巴结肿大等病人血清，检出弓形虫lgG抗体阳性13例，其中10例经全虫体蛋白印迹法确认为阳性．结论昆虫细胞表达的重组SAG1能识别人弓形虫病血清，可以用作诊断试剂．     

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的?摇在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38（SjP38）抗原分子，并以其纯化产物为抗原，制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。 方法 将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，在1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达，超声破菌后获得可溶性表达产物，通过镍柱一步法纯化，以纯化的重组SjP38为抗原，免疫BALB/ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹法（Western blotting）分析其特异性。 结果 筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株，均为IgG1； Western blotting 分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。 结论 制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。     

抗弓形虫表膜抗原P30单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗弓形虫主要表膜抗原Ｐ３０单克隆抗体并进行鉴定,进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合,筛选出能够稳定分泌高滴度抗Ｐ３０单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价,用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位,并通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析鉴定。结果获得了两株抗Ｐ３０抗原的杂交瘤细胞株Ｅ３和Ｇ２,其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。２株单抗均属ＩｇＧ１亚类,且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明,制备的抗Ｐ３０抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。     

抗弓形虫表膜抗原P30单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗弓形虫主要表膜抗原P30单克隆抗体并进行鉴定,进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选出能够稳定分泌高滴度抗P30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价,用IFAT进行单抗识别的抗原定位,并通过SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。结果获得了两株抗P30抗原的杂交瘤细胞株E3和G2,其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。2株单抗均属IgG1亚类,且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明,制备的抗P30抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。     

抗弓形虫单克隆抗体的制备鉴定及应用

目的制备抗弓形虫全抗原、天然P30、重组P30的单克隆抗体（McAb），为抗原提纯、弓形虫病诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。方法用弓形虫全抗原、天然P30、重组P30分别免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定McAb亚类和效价；通过SDS—PAGE和Western blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目；利用电镜及IFAT观察McAb对弓形虫的杀伤作用及其作用位点。结果筛选出3株（4810、283、1H6）特异性较好的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示，283、1H6产生的MeAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30kDa处，4810反应带主要在22kDa处；283，1H6，4810MeAb的效价（ELISA）分别为：1：102400、1：51200、1：12800；283、1H6为IgM，4810为IgG2b；3株细胞的染色体数均在100条以上。电镜观察到McAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀，表面出现缺口和空洞，虫体变形破碎、膜变厚。抗弓形虫全抗原及天然P30的McAb能准确识别重组体pET-30a—ROP2、pET-30a-P30的表达蛋白。结论抗弓形虫全抗原、P30抗原的McAb均对弓形虫具有明显的杀伤作用，能准确识别P30抗原，可应用于弓形虫病诊断、抗原鉴定及亚单位疫苗的研制。     

抗弓形虫主要外膜蛋白单克隆抗体的分析与鉴定

用杂交瘤技术制备抗弓形虫单克隆抗体，经蛋白印迹试验证实：12A10、12C4杂交瘤株分泌抗弓形虫主要外膜蛋白P30的单克隆抗体。其免疫球蛋白均为IgG类。     

弓形虫表面抗原SAG1的可溶性表达及其免疫学活性分析

目的表达和纯化弓形虫表面抗原1(SAG1),并分析其免疫学活性。方法构建pET15b-SAG1质粒,转化到宿主菌E.coil BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,使用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用间接ELISA检测目的蛋白的抗原性。结果 SDS-PAGE显示表达的SAG1蛋白为可溶性的,经纯化后其纯度可达到90%以上;ELISA检测表达蛋白能被弓形虫感染者血清识别;棋盘滴定显示重组SAG1蛋白适宜包被浓度为0.5μg/ml。结论本研究表达的SAG1蛋白为可溶性的,且具有良好的抗原性,为进一步建立弓形虫血清学诊断方法和研制弓形虫病疫苗奠定了基础。     

弓形虫主要抗原基因（SAG1）在昆虫细胞中表达的研究

用PCR技术从弓形虫DNA扩增出一段长约902bp编码弓形央主要膜蛋白抗原（SAG1）的基因，将SAG1基因插入带有转座子供体的pFastBacl质粒，得到重组质粒pFT9，pFT9转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，通过转座重组作用使SAG1基因整合到杆状病毒载体上，将两株转座重组子BaC101和Bac304DNA分别转染Sf9昆虫细胞，用弓形虫免疫血清所作的免疫印迹试验证实这两株重组杆状病毒的昆虫细胞株均表达了SAG1蛋白。本文首次报告弓形虫SAG1蛋白在昆虫细胞中的表达。     

三种方法提纯弓形虫单克隆抗体的比较研究

用硫酸铵沉淀法、辛酸沉淀法和聚乙二醇（PEG）沉淀法提纯抗弓形虫单克隆抗体（McAb），且比较它们的蛋白得率、纯度和免疫活性。结果显示，PEG法纯化IgM型McAb，得率和纯度高，活性好，可简单快速地处理大量样品，值得推广应用。     

抗P30 McAb对弓形虫感染的保护性作用

用杂交瘤技术获得抗弓形虫Ｐ３０ＭｃＡｂ,按不同剂量分别与同等数量的弓形虫ＲＨ株（２×１０５／ｍｌ）作用后,经腹腔注射ＢＡＬＢ／ｃ鼠,发现该ＭｃＡｂ对弓形虫感染具保护性作用。ＲＨ株致死量试验显示：每鼠注射１０个虫体,１ｗｋ内死亡率达６２．５％,９ｄ内全部死亡,而在３．００ｍｇ的ＭｃＡｂ保护下注射１０５ＲＨ株虫体的小鼠可在１０ｄ内无一死亡。用目测概率法计算其ＥＤ５０为每鼠１．２３ｍｇ／１０５ＲＨ株虫体。对照组与实验组小鼠存活时间及存活率间经统计学检验均有显著性差异。     

弓形虫SAG1可溶性融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫SAG1抗原,为研制新型弓形虫病基因工程诊断试剂盒奠定基础。方法将重组pGEX-SAG1表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导下表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物的表达形式。通过降低培养温度和升高LB培养基的pH,诱导融合蛋白在上清中表达,表达产物以硫酸铵沉淀、GST亲和层析和Sephadex G-150凝胶过滤层析进行纯化。Western blot检测纯化融合蛋白的免疫反应性。结果37℃条件下,SAG1以融合蛋白(SAG1-GST)的形式在大肠埃希菌中高效表达,表达蛋白以包涵体形式存在。在27℃和升高LB培养基pH条件下,融合蛋白在上清中得到表达,经纯化后其SAG1可溶性蛋白纯度可达90%以上。Western blot分析纯化蛋白能被弓形虫感染者血清所识别。结论SAG1可溶性蛋白在大肠埃希菌中得到了表达,经纯化后能被弓形虫感染者血清所识别,可用于制备弓形虫感染诊断试剂盒。     

弓形虫SAG1可溶性融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫SAG1抗原,为研制新型弓形虫病基因工程诊断试剂盒奠定基础. 方法将重组pGEX-SAG1表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达融合蛋白,并通过SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物的表达形式.通过降低培养温度和升高LB培养基的pH,诱导融合蛋白在上清中表达,表达产物以硫酸铵沉淀、GST亲和层析和Sephadex G-150凝胶过滤层析进行纯化.Western blot检测纯化融合蛋白的免疫反应性. 结果 37 ℃条件下,SAG1以融合蛋白（SAG1-GST）的形式在大肠埃希菌中高效表达,表达蛋白以包涵体形式存在.在27 ℃和升高LB培养基pH条件下,融合蛋白在上清中得到表达,经纯化后其SAG1可溶性蛋白纯度可达90%以上.Western blot分析纯化蛋白能被弓形虫感染者血清所识别.结论 SAG1可溶性蛋白在大肠埃希菌中得到了表达,经纯化后能被弓形虫感染者血清所识别,可用于制备弓形虫感染诊断试剂盒.     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的　构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。　方法　设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。　结果　从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。　结论　真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。     

抗恶性疟原虫重组谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的　制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶 (GDH)的单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。　方法　用柱层析纯化的GDH/GST重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,用 protein G亲和层析纯化接种杂交瘤细胞的小鼠腹水 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,Westernblot分析其特异性。　结果　筛选出 6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,单抗均为IgG1,Westernblot分析显示 ,6株单抗都与重组的GDH发生特异性结合。　结论　制备的抗GDH杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗 ,为疟疾诊断技术的进一步研究奠定了基础。     

抗弓形虫特异性鸡卵黄抗体的制备与鉴定

目的　制备高效价特异性鸡卵黄免疫球蛋白 ( yolkimmunoglobulin ,IgY)抗体 ,为弓形虫病防治的研究探索新的方法和途径 ;方法　用提纯的弓形虫RH株抗原免疫育龄种鸡 ,获取大量含高效价IgY的卵黄 ,经水稀释法初步纯化浓缩后 ,用ELISA检定其免疫学活性 ,应用SDS -PAGE分析、鉴定IgY的分子基础 ;结果　获得ELISA效价为 1× 10 7的抗弓形虫IgY抗体 ,经SDS -PAGE分析 ,出现 1条蛋白带 ,其分子量大小根据电泳迁移率计算 ,初步鉴定为 4 6kDa用弓形虫抗原免疫Lyh ern种鸡制备的IgY抗体效价高、特异性强 ;水稀释法初步提纯获得的IgY抗体分子量为 4 6kDa,为在弓形虫病的特异性免疫学诊断、预防和治疗中的应用奠定基础。     

弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定

目的　扩增弓形虫表面抗原P2 2基因编码序列 ,并进行表达和鉴定。　方法　设计合成引物 ,PCR法从RH株弓形虫基因组DNA中扩增P2 2基因编码序列 ,克隆入载体pET 3 2a ,转化大肠埃希菌BL2 1,IPTG诱导表达 ,表达产物进行SDS PAGE和Westernblot鉴定。　结果　从弓形虫基因组DNA中扩增出P2 2基因编码序列 ,并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组P2 2。　结论　成功获得弓形虫表面抗原P2 2的表达产物 ,为弓形虫病的诊断和疫苗研究创造了条件。