肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物,以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板, RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α,IPTG诱导表达,使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体,进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对,同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×10^3,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有 N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521）,COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314）,健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。     

肠道病毒71型VP1蛋白原核表达及初步鉴定

目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。     

西安市手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征分析

目的：了解西安市2012年手足口病肠道病毒71型分离株VP1区基因特征,探讨基因型与病情轻重间的关系。方法采集肠道病毒71型（EV71）患者咽拭子或粪便标本,按等概率法随机选择6例普通型和6例重型EV71分离株,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对EV71分离株进行VP1区基因扩增及核酸测序,并将测序结果与EV7各基因型代表株进行同源性和遗传进化分析。结果12株EV71分离株的基因型为C4基因亚型,其与C4亚型代表株VP1区核苷酸和氨基酸同源性最高,分别91.8%~93.0%和98.3%~99.3%,6例普通型和6例重型EV71分离株在VP1基因型区无明显差异,对12株EV71分离株进行遗传进化分析显示,12株流行株与C4亚型代表株聚集于同一个分支。结论西安12株EV71流行株的基因型属于C4亚型,基因型与病情严重程度可能无关。     

2011~2012年武汉地区肠道病毒71型VP1基因的遗传进化分析

摘要：目的：观察武汉地区手足口病（HFMD）患儿肠道病毒71型（EV71）的基因型及其重组特点。 方法：收集2011年4月至2012年3月武汉地区1 844例HFMD患儿EV71阳性的咽拭子标本并进行病毒分离鉴定,对124株EV71病毒分离株的508 bp VP1基因序列进行测序,选择2株来自重症和1株来自轻症患儿的EV71毒株,构建VP1序列系统进化树并分析其全基因组序列的重组特点。 结果：VP1序列系统进化分析显示,124株EV71型均属于C4基因型,其中56株属于C4a亚群,68株属于C4b亚群,Bootscan和5′UTR、P1、P2、P3区的进化树证实3株EV71分离株均为亲本株C4a型毒株guangdong/GD/CHN/2009和C4b型毒株SHZH98/GD/CHN/1998在P2区2A-2B基因交界处发生型内重组所产生。 结论: 2011年4月至2012年3月武汉市及周边地区的EV71分离株均为C4基因型,与1998年以来中国大陆的优势株流行一致,且C4基因型存在型内重组现象。     

湖北省手足口病肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VP1基因特征

目的 了解湖北省手足口病肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Cox A16）的VP1基因特点,研究该省EV71和Cox A16的基因型别及分子进化特征。方法 对2014-2015年湖北省26株EV71和27株Cox A16流行株的VP1基因测序,分析其同源性和遗传进化特征。结果 2014-2015年湖北省EV71和Cox A16流行株VP1核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性均较高,EV71流行株的蛋白氨基酸和核苷酸序列同源性分别为97.6%~100.0%和92.3%~100.0%。Cox A16流行株的蛋白氨基酸和核苷酸序列同源性分别为96.6%~100.0%和92.3%~100.0%。EV71的VP1基因系统进化分析表明,湖北省流行的EV71与我国其他地区流行的EV71均位于一个大的分支上,均为C4基因型的C4a亚型。Cox A16流行株与B1b亚型代表株位于同一分支上,主要为B1b亚型。结论 2014-2015年湖北省EV71和Cox A16流行株分别为C4a亚型和B1b亚型,其核苷酸和氨基酸与国内外其他地区的手足口病病毒株均有较高同源性。     

982例手足口病患者EV71-IgM抗体检测结果分析

目的研究临床就诊的手足口病肠道病毒71型(EV71)型分布特征。方法以黄梅县人民医院2012年5～11月急性期就诊病例为研究对象,用酶联免疫吸附试验检测患者血浆中EV71-IgM抗体来确诊。结果在就诊的982例患者中检出EV71阳性383例(39.0%),其中男250例,女133例,男女阳性检出比为1.88∶1;检出阳性年龄最小4个月,最大10岁,平均2.133岁,6个月至3岁年龄组检出阳性344例,占阳性总数的89.8%,以6个月至3岁的婴幼儿检出为主(χ2=144.10,P=0.000);阳性383例测量均值为1.212±0.101,中值为0.864。结论 6个月龄至3岁为HFMD EV71的重点感染人群,男性较女性易感染。HFMD仍然是黄梅县重要的公共卫生问题,其中EV71在黄梅县婴幼儿中感染率较高,应引起重点关注,并对临床可能出现重病病例保持高度警惕。     

肠道病毒71型手足口病ELISA诊断试剂盒研制与临床应用

目的 研制早期快速检测抗肠道病毒71型(EV71)抗体的ELISA血清学诊断性试剂盒,评价其临床应用价值.方法 将表达纯化的EV71重组蛋白VP1作为包被抗原,建立EV71型手足口病间接ELISA的血清学检测方法 .通过与逆转录(RT)PCR方法 、EV71病毒分离试验和微量血清中和试验比较,评价抗.EV71 IgM和抗-EV71 IgG血清学诊断方法 在EV71型手足口病的诊断价值.结果 与RT-PCR比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为83%、85%、81%和87%;抗.EV71 IgG敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为72%、74%、68%和77%.与EV71病毒分离方法 比较,抗-EV71 IgM敏感度、特异度分别为85%和97%;抗-EV71 IgG敏感度、特异度分别为75%和77%.通过直线相关分析发现,抗-EV71 IgG抗体滴度和中和抗体滴度呈显著正相关(r=0.72,P＜0.05).EV71型手足口病患儿恢复期血清抗IgG滴度较急性期升高(P＜0.01),但抗IgM滴度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用VP1重组蛋白作为包被抗原,成功开发ELISA检测人血清抗-EV71 IgM和抗-EV71 IgG抗体的诊断试剂盒.     

肠道病毒71型感染

1 引言 新型肠道病毒指的是1969年以后鉴定的,除脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒以后,陆续发现符合肠道病毒的理化特性的小RNA病毒.新型肠道病毒感染即由新型肠道病毒所引起的感染.     

肠道病毒71型病毒学及致病机制研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)属小RNA病毒科、肠道病毒属A组,是一种新型嗜神经组织性肠道病毒。EV71引起的重症手足口病患儿病情进展迅速,若未及时治疗可并发脑干脑炎、致死性肺出血和肺水肿,危及患儿生命。本文就EV71的病毒学特性、致病机制及检测方法对重症手足口病的早期诊断及其并发症的预防治疗研究进展作一综述。     

肠道病毒71型致病机制及检测方法研究进展

正肠道病毒71型(EV71)是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一~([1])。受EV71病毒感染的患者因免疫反应不同会有不同的表现症状,主要为手、足、口、咽峡等处疱疹和发热、皮疹等轻微症状,但部分婴幼儿可能出现中枢神经系统感染及心肌炎等,严重威胁到婴幼儿的健康。因此对EV71致病机制和早期检测的研究十分必要。目前,学者们对EV71的发病机制有一定的认识,但仍然需要进一步探索。EV71感染检测的主要途径有分子生物学检测和血清学检测,各具特色。本文主要对EV71的致病机制和检测方法研究进展作一综述。     

ELISA法与免疫层析法检测抗EV71-Ig M抗体的结果对比分析

目的：比较ELISA法和胶体金免疫层析（GICA）法检测抗EV71-IgM抗体的结果。方法用ELISA法和GICA法分别对96例发病初期手足口病患儿进行抗 EV71-IgM抗体的实验室检测,并对结果进行比较。结果当 ELISA 法 A≥0．150时,GICA法阳性率为92．3％;GICA法的检测阳性率明显高于ELISA 法,两者比较差异有统计学意义（P＜0．05）。结论对于手足口病初期患儿,GICA法检测阳性率高于ELISA法,将该法应用于日常诊断更可取。     

南通地区2014年肠道病毒71型的分子流行病学研究

目的分析2014年江苏南通地区肠道病毒71型(EV71)的分子流行病学特征。方法采集52例手足口病患儿咽拭子标本,提取病毒核酸,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)扩增病毒的VP1序列。获得的序列与来自其他地区的序列进行比对分析,构建系统发育树。结果 52份临床标本中分离到12株EV71 VP1序列,12株VP1序列的核苷酸、氨基酸同源性为93.4%~99.1%,进化树分析显示12株VP1序列全部属于C4基因型的C4a亚型。结论 2014年南通地区分离的EV71流行病毒株与近年来中国其他地区的流行株有相同的起源,均属于EV71C4基因的C4a亚型。     

基于化学发光肠道病毒71型IgM抗体检测试剂的研制及初步应用

目的在肠道病毒71型(EV71)重组外壳蛋白VP1的基础上建立以化学发光为基础的IgM抗体检测技术,并与普通TMB显色酶联免疫吸附法比较,评价其临床应用前景。方法采用抗IgM单克隆抗体及辣根酶标记的重组VP1抗原,在此基础上建立EV71-IgM捕获法化学发光检测技术,并对比化学发光检测技术与普通酶联检测技术在45份EV71抗体阳性和30份阴性血清中的反应情况。结果化学发光法、普通酶联免疫吸附法、市售EV71-IgM检测试剂分别能与38份、19份、26份EV71抗体阳性血清发生阳性反应,灵敏度分别为84.4%、42.2%和57.8%;化学发光法灵敏度显著高于其他两种,差异有统计学意义(P<0.05);3种检测方法与阴性血清均无阳性反应。结论在EV71-VP1重组抗原的基础上建立的EV71-IgM捕获法化学发光检测技术具有很高的灵敏度,并有很好的临床应用前景。     

ELISA检测血清EV71-IgM诊断手足口病价值的Meta分析

目的系统评价酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肠道病毒71型IgM抗体(EV71-IgM)诊断手足口病(HFMD)的价值。方法检索PubMed、Embase、Web of Science、Cochrane、维普、万方、中国知网以及中国医学生物文献数据库中有关用ELISA检测EV71-IgM诊断HFMD的文献,检索时限从建库至2015年1月。对符合纳入标准的文献进行资料提取、方法学质量评价,采用Meta-disc 1.4软件进行Meta分析。结果共纳入文献8篇,合计4 126例,其中HFMD患者1 484例,非HFMD患者2 642例。Meta分析结果显示,各研究间存在非阈值效应引起的异质性,合并灵敏度、特异度和诊断比值比分别为84%、90%、28.77;拟合综合受试者特征曲线(SROC)下面积为0.906 8。结论 ELISA检测血清EV71-IgM诊断HFMD有较高的诊断价值,但因纳入研究存在一些方法学缺陷,该结论尚需进一步开展高质量的诊断性试验来进行验证。     

不同方法检测肠道病毒71型IgM抗体在手足口病诊断中的意义

目的：研究免疫层析法（ICA）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测肠道病毒71型（EV71）IgM 抗体在手足口病诊断中的意义。方法采集135例手足口病确诊患儿和44例排除手足口病诊断的患儿血清标本,采用ICA及ELISA检测EV71 IgM 抗体。结果135例手足口病患儿,ICA、ELISA 检测 EV71 IgM 抗体阳性率分别为21．48％（29/135）和20．74％（27/135）;44例非手足口病患儿,ICA、ELISA检测EV71 IgM抗体阳性率均为0．00％（0/44）。结论ICA或ELISA检测EV71 IgM抗体阳性者均可确诊为手足口病,但检测结果为阴性者,不能排除手足口病的可能性,应结合临床表现进行诊断。     

2014-2019年山东省潍坊市流行的肠道病毒A组71型的VP1区基因特征分析

目的 了解2014—2019年山东省潍坊市流行的肠道病毒A组71型（EV71）VP1区基因遗传特征、进化关系及VP1区密码子所处的选择性压力。方法 随机选取2014—2019年潍坊市EV71感染手足口病患者的阳性标本,经人横纹肌肉瘤细胞分离培养后提取病毒总RNA,采用反转录聚合酶链式反应对VP1区基因扩增后进行序列测定,并分析与EV71各基因型代表株的核苷酸及氨基酸的同源性,构建2008年以来我国不同省份EV71及本地EV71 VP1区系统进化树。通过Datamonkey在线服务器采用单似然祖先计数（SLAC）及固定效应可能性模型（FEL）方法对C4a亚型VP1区密码子进行选择性压力分析。结果 共获得的41株本地EV71毒株,均与C4a基因亚型的同源性最高,核苷酸同源性为94.9%～98.2%,氨基酸同源性为98.3%～99.6%。系统进化树显示本地EV71毒株均属C4a基因亚型,形成2个明显的支系,每一分支中既有成簇毒株也有散在分布毒株,并与多地毒株亲缘关系较近。采用SLAC和FEL分别鉴定出136和190个密码子为负向选择性压力位点,不存在正向选择性压力位点。结论 2014—201...     

肠道病毒71型灭活疫苗安全性的主动监测分析

目的分析浙江省金华市肠道病毒71型（EV71）灭活疫苗的预防接种安全性。方法2016年9月至2018年7月,选择金华市6～47月龄儿童作为研究对象,采用主动监测方式进行面访和电话随访,并记录接种疫苗0～30 d的不良反应发生情况。结果研究纳入6 084名儿童,共主动监测疫苗9 090剂次,主动监测发现共有59名儿童发生不良反应,发生率为649.06/10万剂,96.61%发生于0～3 d。 不良反应以发热（72.88%）、腹泻（27.12%）和恶心呕吐（10.17%）等全身反应为主,转归良好。 ≥3级反应15例,均在观察期内痊愈。 不同性别、年龄、接种时间和接种剂次间的不良反应发生率差异无统计学意义（P＞0.05）,不同疫苗种类间的不良反应发生率差异有统计学意义（P<0.05）,≥3级不良反应发生率差异无统计学意义（P>0.05）。 Logistic回归模型分析结果显示,疫苗种类是不良反应发生的影响因素。结论EV71灭活疫苗0～30 d内不良反应发生率较低,发生率与疫苗种类有关。     

肠道病毒71型的快速纯化及其鉴定

目的 建立一种简单、快速有效的从细胞培养物中纯化肠道病毒71(EV71)的方法.方法 EV71病毒在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中增殖后,将获得的细胞培养物经反复冻融、聚乙二醇6000沉淀、超速离心、氯化铯垫层超速离心的方法纯化病毒.用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和透射电镜(TEM)的方法对纯化病毒进行鉴定,并测定其感染性的滴度及回收率.结果 SDS-PAGE显示出3个条带,相对分子质量分别为3.6×103、3×103和2.6×103与EV71的VP1、VP2和VP3相符合.Western blot证实为EV71特异性条带.经磷钨酸负染后电镜观察,能看到典型病毒颗粒.采用终浓度为10%的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率为82.0%,再经氯化铯垫层超速离心后浓缩病毒的感染性回性率为29.0%.结论 聚乙二醇6000沉淀结合氯化铯垫层超速离心的方法比氯化铯密度梯度区带离心方法更简便,易于操作,并且比单独聚乙二醇6000沉淀有更高的纯度,是一种简便、有效的病毒纯化方法.     

2001年深圳地区肠道病毒71型的监测

目的　了解 2 0 0 1年深圳地区肠道病毒 71型的感染情况。方法　应用RT -PCR对 79份疑似肠道病毒感染者的粪便标本进行肠道病毒 71型RNA检测。结果　肠道病毒 71型的阳性率为 30.38% (24 / 79) ,深圳地区及与深圳相邻的东莞地区存在EV71的感染 ,EV71在成年人中还存在健康带毒者 ,1 0月份存在一个EV71感染高峰。 5岁以下的儿童是EV71感染的高危人群。EV71可导致包括神经系统并发症在内的多种疾病 ,其中手足口病所占的比例较大 (62.5 % )。不同性别间EV71的感染率差异无显著意义。结论　深圳地区存在EV71的感染 ,尤其要加强对出现中枢神经系统并发症的EV71的监测     

景德镇市两例重症EV71手足口病毒VP1区基因型分析

目的分析2011年景德镇地区两例临床症状不同的EV71手足口重症病例病毒株的分子生物学特征。方法采集2例临床症状不同的手足口病重症患者咽拭子标本．进行病毒分离和逆转录一聚合酶链反应（aT—PCRl,并将其与GenBank已上传的其他EV71病毒株的VPl区进行相关生物信息学分析。结果两例临床症状不同的重症病例都由EV71病毒引起,他们都同属于C4a亚型．通过氨基酸序列比对发现它们在四个氨基酸的位点上存在变异引起不同临床症状．其中有神经症状的患儿出现第19位丙氨酸由缬氨酸取代（A→V）,第106位酪氨酸由苯丙氨酸取代（Y→F）;无神经症状的患儿出现第19位丙氨酸由半胱氨酸取代（A→C）,第38位精氨酸由谷氨酰胺取代（R→Q）,第293位丙氨酸由丝氨酸取代（A→S）。结论EV71病毒是引起手足口重症病例的主要病原．临床症状的差异性主要体现在有无神经系统症状．通过基因分析发现不同位点氨基酸的突变可能成为临床症状差异性形成的生物学基础．