PCR指印技术对新疆结核病病原Bacter460液体培养标本进行菌株分型

以结核分枝杆菌特异插入序列IS6 110两端序列为模板 ,设计一对外向PCR引物进行PCR扩增 ,从而建立一种结核分枝杆菌的快速分子生物学分型技术 ,该试验的基础是利用IS6 110在结核分枝杆菌染色体DNA中反复重复且IS6 110序列之间相距较近 ,经PCR扩增呈现多条带型构成DNA指印。在对新疆结核病人的 31份液体培养标本的PCR检测呈现 6种指印 ,该PCR分型技术对结核分枝杆菌的分型所需时间短 ,不需细菌再培养 ,DNA纯化和酶切、萨瑟恩转印或核酸杂交等繁琐步骤。证明该法是一种快速、准确的鉴定与分型方法并可直接进行分子流行病学研究     

利用PCR技术检测537份新疆结核病人痰标本中的结核分枝杆菌

目的 提高聚合酶链反应在检测人结核分枝杆菌中的特异性和敏感性。方法 在聚合酶链反应中对4种DNA片段即结核杆菌特异插入列IS6110,IS1081,和16SrRNA,65kDa摸板进行了比较;为获取较多的细菌DNA,临床痰标本处理采用了国际标准化方法主要包括用一定量的N－乙酰－L半胱胺酸和氢氧化钠处理痰标本;改进了RCR混和液的成份即添加了甘油,dUTP－尿嘧啶糖基化酶。结果 选择IS6110作为结核杆菌特异性摸板用于检测细菌DNA,制备出了6批人结核杆菌PCR检测试剂盒,在对来自新疆结核病研究所的537份痰标本的检测中发现,谝试剂盒检测的特异性为65.97%,敏感性为93.53%。结论 改良TB－PCR试剂盒显示有较高的敏感性,特异性还有待于进一步完善,该试剂盒在临床诊断中有一定的价值。     

DNA固定技术对结核分枝杆菌PCR产物杂交结果影响的研究

目的 比较各种ＤＮＡ固定方法对结核分枝菌ＰＣＲ产物杂交结果的影响。方法 选取结核分杆枝菌ＰＣＲ扩增产物并点于尼龙膜上,用紫外线、加热和碱液三种方法固定ＤＮＡ,然后以ＰＣＲ产物作探针用增强化学发光标记试剂进行标记,并对三种不同方法固定的ＰＣＲ产物杂交分析。结果 结核分枝杆菌ＤＮＡ固定方法对ＰＣＲ扩增产物的检测结果较大的影响,碱液固定具有较好的敏感性和重复性。结论 各地结核分枝杆菌ＰＣＲ实验室可考虑用     

临床标本中结核分枝杆菌扩增直接试验的评价

背景:最近10年结核病例数有所增加,寻找快速特异的方法直接检测呼吸道标本的结核分枝杆菌十分必要。结核分枝杆菌扩增直接试验(AMTDT)是一种直接从标本中检测结核杆菌的方法。目的:评价AMTDT的敏感性和特异性。方法:我们对426例病人进行了试验,其中包括58例培阳和(或)临床诊断为结核病的病人,386例培养阴性和临床诊断为非结核病的病人作为对照组。将试验结果与培养以及结核病的临床诊断作比较。结果:在58例培阳和(或)临床诊断为结核病的病人中,AMTDT阳性数为35例,而在368例对照组中,71例AMTDT阳性,17例涂片阴性的结核病人中11例AMTDT结果阳性。AMTDT试验的敏感性和特异性分别是60％和80％。结论:AMTDT能作为临床上高度疑似结核病的补充诊断技术。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan(R)荧光PCR检测的建立

目的 对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法 .结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果 呈典型阳性反应,牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果 呈典型阳性反应,对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应.两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝,对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞.对临床样品的检测结果 显示,荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞.所建立的方法 ,全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测,可在5～6h内完成.采用上述荧光PCR方法 从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品.     

PCR技术在结核病诊断中的价值

目的探讨结核分支杆菌核酸扩增PCR技术及结核分支杆菌噬菌体生物扩增法对肺结核病及肺外结核患者临床诊断的意义。方法对入选46例菌阳肺结核患者进一步做上述两种方法。结果46例患者PCR阳性为36例（78.3%）噬菌体阳性为11例（23.9%）。结论PCR技术对肺结核病及肺外结核患者的诊断具有一定实际意义。     

快速培养法对结核病诊断的评价:拉丁美洲的一个多中心研究

地点:拉丁美洲的结核病(TB)诊断实验室.目的:薄层琼脂(thin-layer agar,TLA)和罗氏培养(Lowenstein-Jensen,LJ)对结核病诊断的对比评价.设计:6个实验室Ⅱ期前瞻性研究.临床诊断的TB病人样本包括痰标本和肺外结核的标本.呼吸道标本用NaOH/NALC去污;根据推荐的操作程序对所有标本进行离心,萋尼氏法进行抗酸菌(AFB)染色,用LJ和TLA法培养检查.计算两种培养基的敏感度和似然比、生长检测时间和污染率.结果:总共研究了1118份临床标本.所有AFB阳性标本培养后均检出结核分枝杆菌,AFB阴性标本中,LJ检出率为3.2%,TLA为4.4%.TLA和LJ的敏感性分别为92.6%(95%CI:87.9-95.9)和84.7%(95%CI:78.8-89.0).阳性和阴性LR相似.TLA和LJ的污染率分别为5.1%和3.0%.TLA和LJ对培养阳性的检出平均时间分别为11.5天(95%CI:9.3-15.0)和30.5天(95%CI:26.9-39.0)(P＜0.0001).结论:参加研究实验室的不同特点、疾病流行情况和标本处理的不同并不影响TLA和LJ的总体效果,建议不同实验室使用这种方法,因它具有可靠性和可行性.     

快速培养法对结核病诊断的评价:拉丁美洲的一个多中心研究

地点：拉丁美洲的结核病（TB）诊断实验室。 目的：薄层琼脂（thin-layer agar,TLA）和罗氏培养（Lowenstein-Jensen,LJ）对结核病诊断的对比评价。设计：6个实验室Ⅱ期前瞻性研究．临床诊断的TB病人样本包括痰标本和肺外结核的标本．呼吸道标本用NaOH／NALC去污；根据推荐的操作程序对所有标本进行离心，萋尼氏法进行抗酸菌（AFB）染色，用LJ和TLA法培养检查。计算两种培养基的敏感度和似然比、生长检测时间和污染率． 结果：总共研究了1118份临床标本．所有AFB阳性标本培养后均检出结核分枝杆菌，AFB阴性标本中，LJ检出率为3．2％，TLA为4．4％。TLA和LJ的敏感性分别为92．6％（95％CI：87．9-95．9）和84．7％（95％CI：78．8-89．0）。阳性和阴性LR相似．TLA和LJ的污染率分别为5．1％和3．0％．TLA和LJ对培养阳性的检出平均时间分别为11．5天（95％CI：9．3-15．0）和30．5天（95％CI：26．9-39．0）（P〈0．0001）。 结论：参加研究实验室的不同特点、疾病流行情况和标本处理的不同并不影响TLA和LJ的总体效果，建议不同实验室使用这种方法，因它具有可靠性和可行性。     

骨关节结核各类标本进行结核分枝杆菌培养与PCR检测的阳性率结果分析

目的 比较骨关节结核病灶中脓液、干酪、肉芽及死骨组织的结核分枝杆菌培养阳性率,及结核分枝杆菌BACTEC MGIT 960（简称“MGIT 960”）培养、改良罗氏培养基培养、PCR检测的联合阳性率.方法 2011年6月至2012年5月首都医科大学附属北京胸科医院收治的经病理明确诊断为骨关节结核的患者50例,通过手术获取病灶中的脓液（50份）、干酪（42份）、肉芽（48份）及死骨组织标本（43份）,分别进行结核分枝杆菌MGIT 960培养及改良罗氏培养基培养,比较4种组织标本的培养阳性率,计算2种培养方法的联合阳性率;对脓液标本单独通过PCR方法进行了阳性率检测;计算脓液标本3种方法的联合阳性率.结果 4种标本MGIT 960培养的阳性率依次为：死骨组织（41.9％,18/43）＞脓液（40.0％,20/50）＞肉芽（33.3％,16/48）=干酪（33.3 ％,14/42）;4种标本改良罗氏培养阳性率依次为：肉芽（20.8％,10/48）＞脓液（20.0％,10/50）＞死骨组织（16.3 ％,7/43）＞干酪（14.3％,6/42）;脓液的PCR检测阳性率为48.0％（24/50）.MGIT 960和改良罗氏培养2种结核分枝杆菌培养方法的联合阳性率为50.0％（25/50）,而PCR检测、MGIT960和改良罗氏培养3种方法的联合阳性率为68.0（34/50）.结论 骨关节结核患者,应尽可能选择多种标本以提高培养阳性率.MGIT 960培养可以作为首选的细菌学诊断方法,但如果再联合使用改良罗氏培养和PCR扩增技术,能够进一步提高检出阳性率.     

链置换扩增技术在结核病诊断中的应用

目的探讨链置换扩增（SDA）技术检测结核分枝杆菌复合群（MTBC）的临床意义和可信性。方法应用SDA技术与荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR），直接检测了453份结核性样本，其中痰标本332份、胸腔积液78份、脑脊液43份。结果332份痰标本培养阳性131份，其中110株（涂阳88份）为MTBC，21株（涂阳20份）为非结核分枝杆菌。在110份证实有MTBC、21份证实有非结核分枝杆菌生长的样本中，SDA和FQ-PCR的敏感性分别为99．1％和95．2％，特异性分别为94．6％和95．2％。在311例结核分枝杆菌感染的患者中，SDA和FQ-PCR的阳性率分别为55．3％（172／311）和47.0％（146／311）。121份结核性胸腔积液、脑脊液样本中，分枝杆菌阳性20例，经鉴定其中19例为结核分枝杆菌，1例为非结核分枝杆菌，SDA和FQ—PCR检测的阳性率分别为43．4％（52／120）和33．4％（40／120）。SDA技术设立的内扩增质量控制（IAC）可确保检测结果的准确性。结论自动检测分析系统能快速、特异地检测临床样本中MTBC，设立IAC可提高结果的可信性。     

TB-SA基因检测在结核病诊断的临床应用研究

目的研究结核分枝杆菌特异性基因(Tuberculosis-Specific AntigenTB-SA)在结核病诊断中的应用价值。方法选择2004年4—9月期间在成都市结核病防治院的住院结核病患者371例。其中肺结核307例;肺外结核64例(结核性胸膜炎47例、结核性腹膜炎7例、结核性脑膜炎10例);非结核病的呼吸系统疾病患者61例(肺炎4例、肺癌9例,急性支气管炎7例、慢性支气管炎14例、哮喘10例,COPD12例、肺间质纤维化1例、支气管扩张3例、矽肺1例);同时选择无结核疾患健康志愿者40例,全部选例均知情同意。入选肺结核病例和健康选择痰液、肺外结核病例选择胸腔积液、腹腔积液、脑脊液等标本进行抗酸杆菌浓缩集菌,结核杆菌培养和TB-SA基因扩增(PCR)。结果307例肺结核患者中PCR检测TB-SA阳性259例,敏感性为84.4%(259/307);细菌学培养阳性193例,敏感性62.9%(193/307);痰浓缩集菌镜检阳性95例,敏感性30.9%(95/307)。64例肺外结核患者中,TB-SA阳性35例;敏感性54.7%(35/64);核杆菌培养阳性5例,敏感性7.8%(5/64)。61例非结核呼吸系...     

TB-SA基因检测在结核病诊断的临床应用研究

目的　研究结核分枝杆菌特异性基因(Tuberculosis-Specific AntigenTB-SA)在结核病诊断中的应用价值。方法 选择2004年4—9月期间在成都市结核病防治院的住院结核病患者371例。其中肺结核307例;肺外结核64例(结核性胸膜炎47例、结核性腹膜炎7例、结核性脑膜炎10例);非结核病的呼吸系统疾病患者61例(肺炎4例、肺癌9例,急性支气管炎7例、慢性支气管炎14例、哮喘10例,COPD12例、肺间质纤维化1例、支气管扩张3例、矽肺1例);同时选择无结核疾患健康志愿者40例,全部选例均知情同意。入选肺结核病例和健康选择痰液、肺外结核病例选择胸腔积液、腹腔积液、脑脊液等标本进行抗酸杆菌浓缩集菌,结核杆菌培养和TB-SA基因扩增(PCR)。结果 307例肺结核患者中PCR检测TB-SA阳性259例,敏感性为84.4%(259/307);细菌学培养阳性193例,敏感性62.9%(193/307);痰浓缩集菌镜检阳性95例,敏感性30.9%(95/307)。64例肺外结核患者中,TB-SA阳性35例;敏感性54.7%(35/64);核杆菌培养阳性5例,敏感性7.8%(5/64)。61例非结核呼吸系统病患者中,TB-SA阳性2例,特异性96.7%(59/61)痰涂片无阳性病例。40例健康志愿者,TB-SA及痰涂片均无阳性出现,特异性达100%(40/40)。结论 TB-SA基因检测的特异性及敏感性都取得了满意的效果。操作也较为简单。     

适用于结核分枝杆菌微测序耐药基因芯片的多重PCR体系的优化与评价

目的优化结核分枝杆菌耐药相关基因多重PCR反应体系并评估其优缺点。方法利用改进的方法提取结核分枝杆菌基因组DNA,优化适合扩增rpoB,katG,mabA/inhA,pncA,embB,gyrA,rpsL,rrs和eis耐药基因片段的多重PCR体系,经测序确定所扩增出的基因片段,计算PCR操作过程所用的时间和材料成本等,分析多重PCR反应体系存在的优缺点。结果经过优化煺火温度、引物浓度以及添加NH 4^+和二甲基亚砜可以较好的扩增出5重和4重PCR产物,达到两管同时扩增9个结核分枝杆菌耐药相关基因的目的。利用该条件可以扩增出全部培养出的135株菌株DNA样本和80.56%的痰菌DNA样本,并且可以缩短PCR操作时间、降低试剂耗材成本,减少操作失误。结论优化的两管多重PCR法在同时扩增9个结核分枝杆菌耐药相关基因,具有明显的优势,具有良好的实用价值。     

DNA固定技术对结核分枝杆菌PCR产物杂交结果影响的研究

目的 比较各种DNA 固定方法对结核分枝杆菌PCR 产物杂交结果的影响?方法 选取结核分枝杆菌PCR 扩增产物并点于尼龙膜上,用紫外线?加热和碱液三种方法固定DNA,然后以PCR 产物作探针用增强化学发光标记试剂进行标记,并对三种不同方法固定的PCR 产物杂交分析?结果 结核分枝杆菌DNA固定方法对PCR 扩增产物的检测结果具有较大的影响,碱液固定具有较好的敏感性和重复性?结论 各地结核分枝杆菌PCR 实验室可考虑用碱液法对PCR 产物固定进而进行杂交分析。     

噬菌体技术用于结核病诊断的研究进展

结核病是一种主要由结核分枝杆菌（Mycobac—teriumtuberculosis,MTB）一少数为牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌感染而引发的危害严重的传染病。据WHO统计,全球约1／3的人口感染MTB,每年新增患者900万,并有300万人死于该病。因此,尽早、及时地诊断出结核患者,不仅能及时治疗结核患者,也有利于结核病的控制。     

实时定量PCR技术检测结核分枝杆菌蛋白编码基因表达水平研究

目的运用实时定量PCR(qRT-PCR)检测66株结核分枝杆菌蛋白编码基因(fbpB,psts1,mpt64)的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株与敏感菌株,北京基因型菌株与非北京基因型菌株的蛋白抗原在转录水平的差异。方法根据GenBank提供的序列,设计特异性引物,扩增目的基因片段,克隆入载体,重组质粒经纯化及梯度稀释,应用qRT-PCR检测基因的表达水平。结果北京基因型菌株psts1基因表达水平与非北京基因型菌株比较差异有统计学意义(t=3.721,P<0.01);耐药菌株mpt64基因表达水平与敏感菌株比较差异有统计学意义(t=3.951,P<0.01)。结核分枝杆菌活菌的扩增曲线呈典型的S型,结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,未检测到荧光信号。结论北京基因型结核分枝杆菌psts1基因的表达量低于非北京基因型,结核分枝杆菌耐药菌株mpt64基因的表达量低于敏感株。     

二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测临床标本结核分枝杆菌DNA

目的比较二聚体蝎型探针荧光定量PCR与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）的检出率、检测时间等，探讨二聚体蝎型探针荧光定量PCR检测临床标本中结核分枝杆菌DNA（T＆DNA）的实际应用价值。方法以建立的结核二聚体蝎型探针荧光定量PCR方法为基础，对43例结核确诊患者的标本及11例非肺结核患者的痰标本进行检测，并与抗酸染色、L-J培养法、结核分枝杆菌直接试验（MTD）进行比较。结果二聚体蝎型探针荧光定量PCR能快速准确的检测临床标本中的TB-DNA。其标准品浓度在10^2～10^6copies／μl时，方法能够保持良好的线性关系（相关系数为0．9994），阳性检出率（100％）显著高于抗酸染色法（16．28％）和培养法（37．21％）的检出率，与MTD试验的检出率（100％）一致。MTD试验检测时间约4～5h，而二聚体蝎型探针FQ-PCR检测约需80min即可得到检测结果，检测费用仅为MTD的1／4。结论二聚体蝎型探针荧光定量PCR用于临床标本结核分枝杆菌DNA的检测具有快速价廉、敏感特异的特点，该方法作为定量检测结核分枝杆菌的分子诊断新途径值得临床推广应用。     

DNA固定技术对结核分枝杆菌PCR产物杂交结果影响的研究

目的 比较各种ＤＮＡ固定方法对结核杆蓖ＰＣＲ产物杂交结果的影响。方法 选取结核杆菌ＰＣＲ扩增产物并点样于尼龙膜上，用紫外线，加热和碱液三种方法固定ＤＮＡ，然后以结核杆菌ＰＣＲ产物作探针用增强化学发光标记剂进行标记，并对三种不同方法固定的ＰＣＲ产物杂交分析，结果结核杆菌ＤＮＡ固定方法对结核杆菌ＰＣＲ扩增产物的检测结果具有较大的影响，碱液固定具有较好的敏感性和重复性。