绒癌耐药细胞系的建立及获得性耐药机制的研究

目的 :采用目前治疗绒癌最常用的药物诱导建立绒癌的耐药细胞系 ,比较不同药物引起耐药机制的差异。方法 :采用浓度梯度递增法和间歇诱导法 ,分别用 5 FU ,MTX ,VP 16诱导绒癌细胞系JEG 3,建立相应耐药细胞系 ,采用MTT法测定耐药细胞系对5 FU、MTX、KSM、VP 16和Taxol的耐药指数 ,用RT PCR测定亲本细胞及各耐药细胞系耐药相关基因如肺耐药蛋白 (LRP)、多药耐药相关蛋白 (MRP)、谷胱甘肽转移酶 (GST π)、二氢叶酸还原酶 (DHFR)和多药耐药基因 (MDR 1)的mRNA表达 ,比较各种细胞生长曲线 ,细胞群体倍增时间。结果 :JEG 3细胞系在诱导耐药细胞前即有LRP、MRP、GST π、DHFR的共表达 ,诱导耐药后上述各基因的表达无明显变化。诱导耐药前JEG 3细胞无MDR1的表达 ,用VP 16、5 FU间歇诱导的方法诱导形成的耐药细胞系有MDR 1表达 ,且耐药指数增加。结论 :JEG 3耐药细胞系耐药性的产生与MRP、LRP、GST π、DHFR表达的关系不密切 ,而与MDR1的表达有关。     

6种常见耐药标志物在氟尿苷耐药绒癌细胞系构建过程中的动态表达

目的:通过检测对氟尿苷(FUDR)耐药的绒癌细胞系构建过程中肺耐药相关蛋白(LRP)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、survivin、谷胱甘肽 S-转移酶-π(GST-π)、多药耐药基因(MDR1)和多药耐药相关蛋白基因(MRP)6种常见耐药标志物的动态表达,探讨其耐药机制并进行耐药标志物的初步筛选.方法:用化学发光法和荧光定量PCR技术,分别检测不同浓度FUDR诱导的JEG-3细胞中β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的分泌量和上述6种常见耐药标志物在耐药细胞构建过程中的动态表达.结果:不同基因在药物诱导过程中的变化趋势不尽相同.只有LRP基因的表达随着诱导药物浓度和肿瘤细胞耐药性的增加而逐渐上调.结论:耐药的产生是分阶段的,不同阶段有不同的因素参与.就目前的研究结果而言,只有LRP的表达变化与FUDR诱导浓度和耐药性有明显正相关,提示其可以作为绒癌对FUDR耐药的候选预测指标.     

二氢叶酸还原酶在两种不同方式诱导的甲氨蝶呤耐药绒癌细胞系中的动态表达

目的:用间断和连续两种诱导方式建立对甲氨蝶呤(MTX)耐药的绒毛膜癌细胞系,并动态检测二氢叶酸还原酶(DHFR)在两种耐药细胞系建立过程中的表达。方法:采用间断和连续诱导法诱导人绒癌细胞系JeG-3,分别建立绒癌MTX耐药细胞系MTXA1(间断诱导浓度为1.1×10-3mol/L)和MTXC2(连续诱导浓度为1.1×10-5mol/L)。细胞计数法(CCK-8)观察耐药细胞的耐药指数;化学发光法和荧光定量PCR技术分别检测不同诱导方法和不同浓度MTX诱导的JeG-3细胞中β人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)的分泌量和DHFR mRNA的表达水平。结果:(1)历时1年成功建立了绒癌耐药细胞系MTXA1和MTXC2,其耐药指数分别为21.36和28.84;(2)β-HCG分泌和DHFR mRNA表达水平在间断和连续两种不同诱导方式诱导的绒癌细胞株中呈相同的动态变化趋势:经低浓度MTX诱导后,JeG-3细胞中β-HCG分泌和DHFR mRNA的表达水平上调;但当MTX诱导浓度增加到一定剂量时,两者不再继续上调而呈下降趋势。结论:成功建立了间断和连续两种方式诱导的耐药绒癌细胞系MTXA1和MTXC2。绒癌细胞β-HCG分泌和DHFR mRNA的表达与MTX作用浓度以及耐药性无明显的正相关关系。目前的研究结果表明,DHFR mRNA的表达水平不适宜作为绒癌细胞是否对MTX耐药的指标。     

活性氧介导P62蛋白激活参与甲氨蝶呤耐药绒癌发病机制研究

目的 探讨甲氨蝶呤（MTX）耐药绒癌的发生机制。方法 2012年5月至2013年1月于北京协和医院以人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞及本课题组前期构建的MTX耐药绒癌JEG-3/MTXR细胞为研究对象,采用免疫印迹、RT-PCR法检测MTX处理后细胞内P62的变化。流式细胞仪检测MTX诱导后JEG-3/MTXR细胞内活性氧(ROS)变化,采用ROS清除剂MnTmPyP检测MTX作用后JEG-3/MTXR细胞内P62蛋白水平的变化。RNA干扰法沉默P62基因免疫印迹法和流式细胞仪检测MTX诱导后JEG-3/MTXR耐药细胞内PARP蛋白的表达和凋亡率的变化。结果 MTX可诱导耐药绒癌 P62蛋白和mRNA表达水平呈时间依赖性上调。MTX可诱导耐药绒癌ROS表达水平升高,MnTmPyP降低P62蛋白的表达。P62-siRNA可促进JEG-3/MTXR细胞内MTX诱导的凋亡反应蛋白PARP的切割和激活,流式细胞仪检测RNA干扰联合药物组细胞凋亡率（14.4±1.02）%,高于单纯药物应用组（9.1±1.34）%,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 ROS介导P62蛋白激活参与MTX耐药绒癌发生机制,为耐药绒癌临床靶向治疗提供新思路。     

细胞自噬在甲氨蝶呤耐药绒癌中的保护性作用

目的：通过检测耐药绒癌细胞内自噬的变化,以及评估抑制自噬或敲除自噬相关基因后细胞凋亡情况,探讨细胞自噬在耐药绒癌中的作用。方法：以人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞及本课题组前期构建的甲氨蝶呤（MTX）耐药绒癌JEG-3／MTXR细胞为研究对象。采用透射电镜、免疫荧光法观察MTX处理后细胞内自噬的变化;Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Bec]in-1的表达变化。RNA干扰法沉默自噬相关基因LC3后,采用Westernblot法和Annexin-V／PI双染法流式细胞仪检测MTX作用后JEG-3／MTXR耐药绒癌细胞凋亡的变化。结果：透射电镜和荧光显微镜下均可观察到MTX处理后JFG-3、JEG-3／MTXR细胞内自噬小体的产生;Icm浓度MTX处理后,两种细胞内自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达水平上调。相同浓度MTX处理后,JEG-3细胞内LC3、Beclin-1表达下调。沉默自噬相关基因LC3后,沉默LC3联合MTX组的JEG-3／MTXR和JEG-3细胞内凋亡相关蛋白caspase-9表达上调,凋亡率显著增多。结论：MTX可诱导耐药绒癌产生保护性自噬。     

绒毛膜癌耐药细胞系的建立及人白细胞介素2基因转染后对其多药耐药性的逆转作用

目的 建立绒毛膜癌（绒癌）的耐药细胞系,应用基因工程技术将人白细胞介素2（hIL-1) 基因导入绒癌耐药细胞系,观察hIL-2基因转染后对绒癌耐药细胞耐药性的逆转作用。方法 采用间歇诱导的方法,用鬼臼乙叉甙（VP－16）诱导绒癌细胞系JEG－3,建立耐药细胞系,四甲基偶氮唑蓝比色法检测该耐药细胞系对多种化学治疗药物的耐药指数,及多种耐药基因包括肺耐药蛋白、多药耐药相关蛋白、谷胱甘肽转移酶、二氢叶酸还原酶和多药耐药基因（MDR1）的mRNA表达情况。用逆转录聚合酶链反应技术,克隆hIL-2基因,将hIL-2基因插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,提取质粒,通过阳离子脂质体将hIL-2基因转染绒癌耐药细胞系,用新霉素筛选含hIL-2 DNA片段的单个细胞克隆,检测转染hIL-2基因后该细胞耐药指数的变化,测定转染后细胞hIL-2和多种耐药基因mRNA的表达。结果 用VP－16采用间歇诱导法,成功建立绒癌的VP－16耐药细胞系JEG－3／VP－16,并检测出MDR1 mRNA表达。转染hIL-2基因后,绒癌细胞中检测出hIL-2 mRNA表达,转染hIL-2基因的细胞的耐药指数降低,JEG－3／VP－16细胞转染pcDNA3.1( )-hIL-2后,对VP－16的耐药指数由38．7降至6．0－6．1,对甲氨蝶呤的耐药指数由14．5降至2．6－2．5,对更生霉素的耐药指数由13．0降至2．0;MDR1 mRNA表达转阴。结论 hIL-2基因转染后可通过调节MDR1的表达,从而逆转绒癌耐药细胞系的耐药性。     

内质网应激激活与依托泊甙和放线菌素D耐药绒癌相关性研究

目的探讨内质网应激激活与拓扑异构酶Ⅱα介导的依托泊甙(etoposide,VP16)和放线菌素D(actinomy-cin-D,Act-D)耐药绒癌的关系。方法采用间断诱导法诱导人绒癌细胞系JEG-3,分别建立绒癌ActD耐药细胞系JEG-3/ActDB1和VP16耐药细胞系JEG-3/VPC1。细胞计数法(cell counting kit-8,CCK-8)观察敏感细胞和耐药细胞的生长增殖规律和耐药指数;流式细胞仪检测细胞周期比例和染色体倍性变化;荧光定量PCR技术分别检测两种不同药物诱导的JEG-3耐药株中拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)和内质网应激(ERS)各个通路相关的基因mR-NA的表达水平。结果 (1)成功建立了绒癌耐药细胞系JEG-3/ActDB1和JEG-3/VPC1。其耐药指数分别为50.64±10.68和65.87±3.19。耐药株生长速度均较亲本细胞减慢,三者的染色体倍性差异无统计学意义。(2)在两种不同的耐药株中,TopoⅡα的表达水平均明显低于亲本细胞,而与ERS各个通路相关基因均有不同程度的激活。结论成功建立了针对ActD和VP16耐药的绒癌细胞系JEG-3/ActDB1和JEG-3...     

内质网应激介导的凋亡耐受在甲氨蝶呤耐药绒癌发生机制中的作用

目的:初步探讨内质网应激介导的凋亡耐受在甲氨蝶呤耐药绒癌发生机制中的作用。方法:以人绒毛膜上皮癌JEG-3细胞及本课题组前期构建的甲氨蝶呤耐药绒癌细胞(JEG-3/MTXR)为研究对象。采用WST法评估甲氨蝶呤处理后JEG-3/MTXR和JEG-3亲本细胞的细胞活力,Western blot法测定两种细胞中caspase-9激活、GRP78和GADD153蛋白的表达。RNA干扰法沉默JEG/MTXR细胞中GADD153基因,Western blot法测定caspase-9蛋白激活的情况。结果:不同浓度梯度的甲氨蝶呤诱导后,JEG-3亲本细胞系的细胞生存率显著降低。相同浓度甲氨蝶呤作用后,JEG-3/MTXR细胞内切割caspase-9无增加,JEG-3亲本细胞内caspase-9激活并切割。JEG-3/MTXR和JEG-3细胞中GRP78表达水平呈时间依赖性上调;JEG-3/MTXR细胞中GADD153蛋白水平无显著上调,而JEG-3亲本细胞内出现显著上调。沉默GADD153基因可抑制MTX引起的切割caspase-9蛋白水平上调。结论:内质网应激介导的凋亡耐受可能参与甲氨蝶呤耐药绒癌发生机制。     

人卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞系3AO/cDDP模型的建立及耐药机理的实验研究

目的：模拟临床卵巢上皮性癌化疗的用药特点建立顺铂耐药细胞系3AO／CDDP,检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopeⅡ表达。方法：以临床卵巢上皮性癌化疗用药的最低剂量换算终浓度,采用大剂量顺铂（10μg／ml）反复间歇24h暴露法建立顺铂耐药细胞系;用FCM法检测LRP、MRP、P－gp、GSTπ和TopoⅡ表达。结果：历时4．5个月建成顺铂耐药株3AO／cDDP,耐药性稳定,耐药指数1．62,与临床耐药倍数相近。3AO／cDDP细胞MRP、P－gp表达与3AO相比无明显变化（P＞0．05）,LPR、GSTπ表达明显升高（P＜0．005及P＜0．05）,Tope-Ⅱ含量明显降低（P＜0．05）。结论：3A0／cDDP是模拟临床用药特点建立的、研究顺铂耐药的理想模型;顺铂耐药与LRP、GSTπ表达升高及TopoⅡ含量降低有关,与MRP、P-gp无关。     

人脐血间充质干细胞携带人肿瘤坏死因子α基因逆转绒癌耐药体外研究

目的观察人脐血间充质干细胞携带人肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因对绒癌耐药细胞株耐药指数的影响。方法应用AdMax系统构建携带TNF-α基因的腺病毒载体。鉴定、分离、培养、扩增、纯化人脐血间充质干细胞(hUCB-MSCs)。携带TNF-α基因的重组腺病毒感染hUCB-MSCs后,与绒癌耐药细胞株JEG3/VP16共培养,空载腺病毒(Ad-EGFP)感染的hUBC-MSCs做为对照,MTT法测定共培养48h后JEG-3/VP16对依托泊苷(VP16)、氟尿嘧啶(5-FU)、甲氨蝶呤(MTX)耐药情况。结果(1)酶切、聚合酶链式反应(PCR)鉴定构建的重组腺病毒携带TNF-α基因。(2)重组腺病毒可高效感染hUCB-MSCs。(3)JEG-3/VP16和转染TNFa基因的hUCB-MSCs共培养,JEG-3/VP16对VP16、5-FU、MTX的IC50分别下降至未共培养前IC50的1/12.8,1/6.75和1/10.1。结论携带hTNFα基因的hUCB-MSCs与绒癌耐药细胞株JEG-3/VP16共培养后,逆转了JEG-3/VP16的耐药性。     

Therapeutic drug monitoring--the appropriate use of drug level measurement in the care of the neonate

Neonates and young infants are in a unique and dynamic pharmacokinetic state, in which they undergo relatively rapid maturational changes in drug absorption, distribution, metabolism, and excretion. In addition to these maturational changes, most drug pharmacokinetic studies in neonates show wide interindividual variability despite similar gestational and postnatal ages. Therapeutic drug monitoring is a necessary tool in the neonatal intensive care unit, despite the relative lack of outcome data. This article discusses therapeutic drug monitoring for several frequently used drugs in neonates.     

浅析门诊药房用药交代

发药交待是调剂工作的一个重要组成部分,它关系到能否准确执行医嘱、合理用药、减少药品不良反应。     

Antithromboxane drug in the treatment of preeclampsia.

In this study, we present our initial trials in the treatment of 6 cases of severe preeclampsia with thromboxane synthetase inhibitor (OKY-046). Following the treatment with OKY-046, maternal systolic blood pressure decreased significantly and umbilical artery waveforms were normalized. These data suggest that thromboxane synthetase inhibition might have a beneficial effect on preeclampsia.