Pre-let-7d转染卵巢癌细胞转染率的研究

目的研究Pre-let-7 d质粒在不同时间,以不同浓度转染人卵巢癌细胞的转染率。方法将构建的Pre-let-7 d质粒HmiR和连接随机序列的质粒CmiR转染人卵巢癌SKOV3、HO8910细胞,用荧光显微镜与流式细胞仪计数两种方法计算转染率。结果转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示SKOV3、HO8910细胞的转染率,以3μg质粒/孔转染SKOV3、HO8910人卵巢癌细胞比2μg、4μg质粒/孔的转染率高,24 h、48 h、72 h三个不同时间点用相同质量的质粒转染,转染率无显著差异。结论转染HmiR、CmiR后,荧光显微镜观察和流式细胞术计数结果显示以3μg质粒/孔转染SK-OV3 HO8910人卵巢癌细胞的转染率均在60%左右,符合实验要求。     

应用精原干细胞转染法建立HBV（adr型）转基因鼠

目前转基因动物的研究已在农业和医学等领域显示广阔的应用前景 ,但其研究进展缓慢 ,转基因技术仍是主要的制约因素之一。探讨新的简便而有效的转基因方法 ,提高转基因效率 ,是转基因动物研究中的重要课题之一。Brinster等 [1]( 1994 )率先进行通过精原干细胞转染建立转基因动物技术的研究。其原理是将外源基因转染到曲细精管内的精原干细胞 ,使其整合到干细胞染色体上 ,干细胞将可能长期保留有外源基因 ,因此该雄性动物所产生的精子 (精子由精原干细胞分化而成熟 )就有可能携带外源基因 ,由该精子受精而获得的子代动物就会携带外源基因。…     

人β-防御素4基因在COS-7细胞中的转染表达

目的探讨人β-防御素4（HBD4）基因在真核细胞COS-7中表达的可能性。方法用脂质体转染法将实验室已构建的重组真核表达载体pcDNA3.1＋/HBD4导入COS-7细胞,采用RT-PCR、Western-blot法检测HBD4的mRNA和蛋白表达水平,并对表达的HBD4进行抗菌活性的初步研究。结果 pcDNA3.1＋/HBD4转染的COS-7细胞中检测到HBD4mRNA表达。Western blot分析显示,在pcDNA3.1＋/HBD4转染的COS-7细胞及细胞培养液中检测到了HBD4蛋白的表达。Kirby-Bauer纸片扩散法证实表达的HBD4蛋白对大肠杆菌ATCC25922具有较强的杀伤作用。结论在COS-7细胞中成功表达具有抗菌活性的HBD4多肽。     

HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的 观察HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞株HepG2细胞内表达情况。方法 将构建的HBc与HBV多表位复合基因真核表达质粒pHBcMep以Lipofectamine介导转染HepG2细胞，通过间接免疫荧光、Western-blot检测表达产物。结果 经G418筛选的阳性转染细胞经间接免疫荧光染色后在紫外光激发时发出明显的荧光，而末转染质粒或转染pcDNA3．1的HepG2细胞则无明显荧光。Western-bot结果显示表达产物约为33kDa，并能与抗preS2多抗特异性结合。结论 HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞内获得正确表达。     

慢性肝炎中乙肝病毒复制与肝脏纤维化血清学标记物的相关性

目的探讨HBV复制及肝损伤与肝纤维化之间的关系。方法对84例慢性乙型肝炎患者采用荧光定量PCR及放射免疫方法,同时对HBV-DNA和肝纤维化血清学标志物透明质酸(HA)、层粘蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)进行定量检测,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测HBV-DNA并同时检测肝功能,应用SPSS统计软件进行分析处理。结果随慢性乙肝临床病情的加重,肝纤维化血清学标志物逐渐升高(P<0.01),肝纤维化血清学标志物与HBV复制水平及ALT水平呈正相关(P<0.05)。结论HBV复制水平与肝纤维化程度之间呈相关,HA、LN、PCⅢ升高与ALT升高有关。     

B7转染白血病细胞K562的作用研究

目的：探讨共刺激信号分子B7转化人白血病细胞株K562后,转化细胞的生物学性状变化及介导的免疫作用。方法：构建重组真核表达质粒pcDNA3．1B7,转化人白血病细胞株K562,获得单个细胞克隆,观察K562－B7的生长周期,绘制生长曲线,检测K562－B7诱导T细胞分泌IL－2的情况。结果：pcDNA3.1B7可在K562中稳定表达,K562－B7的生长增殖速度比野生型K562慢。在体外,K562－B7可诱导PMNC分泌IL－2,24h上清液中IL－2含量比B7阴性K562高1倍左右。结论：B7基因转入白血病细胞株K562后,细胞本身增殖能力降低,且K562－B7可活化CD4^ T细胞分泌细胞因子IL－2,提高宿主抗肿瘤免疫能力。     

人B7-H4基因转染细胞株的构建及其对T细胞的作用

目的克隆人B7-H4基因,构建人B7-H4基因转染细胞株并初步研究其对T细胞的作用。方法通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的基因,将目的片段双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果从外周血活化单核细胞中扩增出目的基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并将其转染至L929细胞,构建了一株稳定表达人B7-H4分子的基因转染细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用(P<0.05)。结论成功构建了稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。     

电穿孔转染悬浮细胞条件的优化

目的以RNA依赖性腺嘌呤脱氨酶(ADAR1)为靶基因优化悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞的电穿孔转染条件。方法通过控制电压、温度、细胞状态等转染条件,采用不同条件组合将靶向ADAR1的siRNA导入悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞,用倒置显微镜观察、细胞计数、台盼蓝拒染试验来计算siRNA序列转染率和细胞存活率。结果小鼠原代淋巴细胞在400V,40μs条件下可获得最大转染率,约为30.6%;良好的细胞状态以及低温条件可获得更好的转染效果。结论电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,通过优化其转染条件,可以提高其对悬浮细胞的转染率。     

双拷贝和x基因缺失HBV DNA质粒的构建及其细胞转染

目的:构建双拷贝和x基因缺失的HBV真核细胞复制表达质粒,并研究其在Hep3B肝癌细胞株中对HBV的复制表达效果.方法:利用含HBV DNA(adrⅠ)的质粒,酶切出HBV DNA片段,克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA3,构建双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;将原始质粒通过插入人工合成DNA片段和基因重组破坏乙肝病毒x基因区,再克隆入pcDNA3,构建成pcDNA3-KN-F1F2真核表达质粒;用两质粒分别转染Hep3B肝癌细胞株,进行G418筛选的同时用荧光定量PCR法检测细胞培养上清液HBV DNA.结果:(1)成功构建了x基因缺失的HBV真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2及含双拷贝HBV DNA的真核表达质粒pcDNA3-ES-HBV2;(2)对两质粒成功进行细胞转染后,测得第3、6、14天细胞培养上清液中HBV DNA均高表达,两质粒之间差别不明显.结论:构建的质粒可在Hep3B细胞株中表达并引起HBV的复制及分泌;x基因的缺失不影响HBV在Hep3B细胞株中的表达复制.     

ANF基因转染人血管平滑肌肉瘤细胞及其表达的实验研究

通过对体外传代培养的人血管起源平滑肌肉瘤细胞进行直接和脂质体Ｔｆｘ－５０包裹的人心钠素（ＡＮＦ）基因表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ＡＮＦ转染,并以非同位素地高辛标记的ＲＮＡ分子探针对转染细胞中的ＡＮＦｍＲＮＡ水平进行ＲＮＡＤｏｔＢｌｏｔ分子杂交检测,同时利用放射免疫方法测定转染细胞培养上清中的ＡＮＦ含量。结果显示,与未经脂质体Ｔｆｘ５０包裹的ｐｏＤＮＡ３／ＡＮＦ直接进行细胞转杂及低浓度质体Ｔｆｘ－５０包裹     

HBV血清标志物与Pre-S1抗原及HBV DNA联合检测研究

目的 探讨各种不同乙型肝炎病毒感染模式与血清HBV Pre-S1抗原(Pre-S1)及HBV DNA载量之间的相互关系,为临床乙型肝炎的诊断和治疗提供参考依据. 方法 对1037例临床血清标本同时检测乙肝标志物、Pre-S1及HBV DNA载量. 结果 HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性模式组("大三阳")的Pre-S1阳性率显著高于其余各血清模式组(P<0.05);"大三阳"模式组的HBV DNA阳性率高于其余各血清模式组(P<0.05)."大三阳"组的HBV DNA载量显著高于"小三阳"组(P<0.05);"小三阳"模式组与HBsAg、HBcAb阳性模式组相比,HBV DNA水平无显著性差异(P>0.05). 结论 HBV DNA定量检测在预防HBV的感染方面具有重要意义;HBV血清标志物、Pre-S1和HBV DNA载量三者联合检测有利于全面监测乙肝病情和提高乙肝疗效.     

乙肝DNA聚合酶在187例乙型肝炎病毒感染的各类肝病中的检测

采用免疫沉淀法对187例乙肝病毒感染患者作了DNA聚合酶(DNA--P)的测定。在各类肝炎中DNA—P的阳性检出率以慢活肝最高为66.6％,依次为急性肝炎45％,携带者33.5％,慢迁肝31.5％。本文分析了乙肝的抗原抗体系统与DNA—P检出率的关系。经统计学处理,DNA—P检出率与HBsAg滴度增高呈正相关γs=0.99,P<0.01。HBeAg阳性组DNA—P检出率为62.4％,抗—HBe阳性组DNA—P检出率为29.5％,抗—HBs阳性8例、DNA—P均为阴性。抗—HBc—IgM强阳性组DNA—P检出率为86.4％。作者认为1/3无症状携带者DNA—P活力增高表明病毒在复制,因此携带者在流行病学上的意义不可忽视。又鉴于18例抗—HBe阳性血清DNA—P活力增高,因此在判断HBeAg~-/抗—HBe~+患者病毒复制情况时,应予慎重。     

HBV M和HBV DNA的关系探讨

目的:研究乙肝病毒血清学标志物(HBV M)与乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)之间的关系。方法:对497例患者同时检测HBV M和HBV DNA,HBV M检测用ELISA法,HBV DAN检测用PCR法。结果:HBV M的检测结果分为6组,每组HBV M组合都有一定的HBV DNA检出率。结论:说明HBV M只能作为乙肝病毒有无感染的一般性检测,而HBV DNA能检出复制病毒,但难以表达非复制状态的感染,所以两者关系值得进一步探讨。     

乙肝病毒携带者羊水穿刺后羊水中HBV-DNA拷贝数分析

目的 研究乙肝病毒携带者外周血HBV-DNA阳性与羊水HBV-DNA阳性的关系,以及是否经过胎盘穿刺对羊水HBV-DNA拷贝数的影响.方法 2011年10月~2012年10月有产前诊断指征需要进行羊水穿刺的乙肝病毒携带者孕妇,在离心取细胞沉淀培养后的羊水上清,测量羊水上清的HBV-DNA拷贝数;并与其外周血乙肝DNA拷贝数做统计学对比.以及比较是否经过胎盘对羊水乙肝DNA拷贝数的影响.结果 外周血HBV-DNA阳性的孕妇,其羊水HBV-DNA阳性率明显高于外周血HBV-DNA阴性的孕妇.结论 经过胎盘穿刺对羊水HBV-DNA阳性率的影响无统计学意义.     

孕妇乙肝大小三阳与血清HBVDNA浓度关系

目的探讨乙肝大小三阳传染性。以指导孕妇孕期保健。方法选择经孕期乙肝血清学五项检测诊断为乙肝大小三阳孕妇41例,其中大三阳组18例,小三阳组23例。采用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术对两组孕妇血清HBVDNA进行检测,以HBVDNA≥500copies／ml作为传染性标准。记录并分析各组孕妇血清HBVDNA浓度与大小三阳的关系。结果血清HBVDNA〈500copies／ml时,大三阳组1例,小三阳组17例,P〈0．01;血清HBVDNA浓度为500～1e％opies／ml时,大三阳组3例,小三阳组5例,P〉0．05;血清HBVDNA浓度为≥le6copies／ml时,大三阳组14例,小三阳组2例,P〈0．01。大三阳组17例传染性,占94．4％,小三阳组7例有传染性,占30．4％,P〈0．01。结论大三阳孕妇94．4％有传染性,且传染性强;小三阳孕妇30．4％有传染性,且传染性弱。     

胸腺肽对HBV转基因小鼠表达HBV DNA的影响

应用胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠进行腹腔内注射（３ｍｇ／只）连续３个月，同时设促肝细胞生长素及生理盐水对照组，定期取血检测ＨＢＶＤＮＡ，结果发现胸腺肽组ＨＢＶＤＮＡ阴转率为２２％～５５％，停药２２ｄ后阴转率为２２％，而对照组小鼠ＨＢＶＤＮＡ无阴转，结果提示胸腺肽对ＨＢＶ转基因小鼠表达ＨＢＶＤＮＡ有抑制作用。     

IL-24 cDNA转染人喉癌细胞系的建立及其表达的研究

目的 建立转染人白细胞介素-24(hIL-24)基因的喉癌细胞株,并研究hIL-24的表达情况.方法 将携带人白细胞介素-24的质粒peDNA3.1( )-hIL-24转导入人喉表皮样癌细胞Hep-2中,G418筛选阳性克隆,RT-PCR、Western blot和ELISA法对hIL-24的表达进行检测.结果 IL-24基因成功地转导入Hep-2细胞中并能高效表达.RT-PCR电泳结果显示hIL-24基因在mRNA水平有表达;ELISA法测得106个转染阳性细胞24h内培养上清液中hIL-24的含量为162.8±15.4 pg/mL,空载体转染及未转染的细胞未检测到hIL-24.结论 hIL-24基因成功转染人喉癌细胞系Hep-2细胞且能持续大量表达.     

Estabishment of A Human Liver Cancer Cell Line Transfected with IL-2 cDNA and Its Biologic Activity

Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｄｕｃｅａｎｔｉ ｔｕｍｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ ,ｓｃｉ ｅｎｔｉｓｔｓｓｉｎｃｅｌｏｎｇａｇｏｈａｖｅａｔｔｅｍｐｔｅｄｔｏｉｎｔｅ ｇｒａｔｅｃｅｌｌｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｉｎｔｏｔｕｍｏｒｃｅｌｌｖｉａｇｅ ｎｏｍｉｃｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｏｍａｋｅｉｔｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｅｘ ｐｒｅｓｓｌｏｃａｌｌｙ .ＩｎｔｈｉｓｓｕｒｖｅｙｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｃｅｌｌＳＭＭＣ 772 1ｗａｓｃｏｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒＬＮＣ ＩＬ2 .Ｔｈｅ…     

腺病毒DNA对肝细胞系的转化活性的研究

用含有腺病毒EIA和EIB基因的DNA片段对一株由猴病毒40(SV_(40))转化的大鼠肝细胞系——CWSV-1细胞进行了转化实验,以了解腺病毒基因和SV_(40)DNA之间的关系。我们的结论是:(1)腺病毒DNA能转化CWSV-1细胞;(2)建立的NP细胞呈重叠生长趋势,当细胞复盖培养基达60％左右时,大部份细胞自行脱落,但细胞形态没有明显改变;(3)形成的NP细胞系大部份不再分泌可检测的白蛋白,少量细胞分泌白蛋白的能力也随着传代而消失。