过表达及定点突变缝隙连接蛋白Cx43小鼠黑色素瘤细胞模型的构建

目的 构建小鼠黑色素瘤细胞（B16）过表达野生型及点突变型缝隙连接蛋白43（Connexin43,Cx43）细胞模型,为以缝隙连接（Gap Junction,GJ）为靶点的中药复方、中药单药及药物单体的研究提供可靠阳性对照和阴性对照。方法 构建野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒,用定点突变技术获得Cx43G21R和Cx43G138R突变体,对上述3种质粒进行双酶切和测序鉴定,并分别包装病毒感染B16细胞,使B16细胞过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R。Western blot检测Cx43蛋白表达水平变化,荧光示踪法观察缝隙连接通讯（Gap Junction Intercellular Communication,GJIC）功能变化。结果 ①酶切及测序证明,成功构建pLVCx43-mCherry、pLVCx43-mCherryG21R、pLVCx43- mCherryG138R重组荧光蛋白融合慢病毒表达质粒。②成功感染B16细胞并筛选稳定过表达Cx43、Cx43G21R、Cx43G138R细胞株,Western blot检测显示上述细胞株Cx43蛋白表达均高于对照组。③过表达野生型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组增强;过表达突变型Cx43后B16细胞GJIC功能较对照组减弱。结论 过表达野生型Cx43可增强B16细胞GJIC功能,过表达突变型Cx43可抑制B16细胞GJIC功能。     

牛蒡子苷元对人肝癌细胞HepG2缝隙连接蛋白表达的影响

目的：观察牛蒡子苷元在体外对人肝癌细胞HepG2缝隙连接蛋白（Cx）表达的影响。方法：采用Western blot 技术检测牛蒡子苷元对人肝癌细胞HepG2缝隙连接蛋白（Cx26/32/43）的表达。结果：Western blot 检测,用国产多克隆Cx一抗和进口单克隆Cx一抗的实验均显示：牛蒡子苷元等能明显提高人肝癌细胞HepG2Cx32的表达,且有时间、浓度依赖性,氧化剂H2O2能抑制牛蒡子苷元此作用;但牛蒡子苷元对HepG2的Cx43表达影响24h不明显,48h能明显提高Cx43表达。结论：牛蒡子苷元能提高人肝癌细胞Cx表达,增强细胞间缝隙连接功能。     

缝隙连接蛋白Cx43在大鼠经脉线上表达的实验研究

目的:研究缝隙连接蛋白Cx43在正常健康大鼠经脉线上的表达及其意义.方法:应用二步法免疫酶技术和ASIAS-2000自动扫描图像分析系统对大鼠多条经脉上的Cx43进行定位、定量分析.结果:缝隙连接蛋白Cx43广泛表达于表皮上皮细胞、真皮成纤维细胞、皮下筋膜的肥大细胞以及肌肉肌膜细胞的胞浆胞膜中,经统计学分析,肾经足底段、膀胱经背部段Cx43的表达显著高于邻近对照线,两者相比差异有极显著性意义(P＜0.01).结论:缝隙连接蛋白及缝隙连接与经络高度相关,由缝隙连接介导的细胞间通讯可能在经络活动中起重要作用.     

穴位、经脉与Cx43的相关性研究

目的：探讨穴位、经脉与Cx43的相关性。方法：运用免疫组化、免疫印迹、RT—PCR检测组成皮肤缝隙链接的主要缝隙连接蛋白之一Cx43在大鼠针刺穴位和经脉上的表达，以及针刺对足三里Cx43表达的影响。结果：与对照组相比，大鼠足三里、膀胱经和肾经上皮肤和皮下组织一些细胞中存在更为丰富的Cx43表达，针刺后穴位与非穴位点之间的差别更明显。结论：本研究表明缝隙连接蛋白、缝隙连接与穴位、经脉存在着密切联系，缝隙连接通讯可能在针刺效应中起着非常重要的作用。     

针刺对大鼠"足三里"穴缝隙连接蛋白Cx43表达的影响

目的:观察大鼠"足三里"穴与非经非穴处缝隙连接蛋白Cx43的表达及针刺对该表达的影响,探讨缝隙连接蛋白与穴位的可能关系.方法:20只健康成年SD大鼠随机分为非针刺组、针刺组,每组10只;应用荧光双重标记免疫组织化学方法和激光扫描共聚焦显微镜技术对"足三里"穴、非经非穴处皮肤组织Cx43进行定位、定量分析.结果:皮肤组织中Cx43主要在上皮细胞胞浆、胞膜上表达,包括皮肤表皮和部分毛囊等上皮角质形成细胞;非针刺组中穴位处Cx43的表达显著高于非经非穴处(P＜0.01),针刺组中穴位针刺后Cx43表达显著增加,与非针刺组中穴位比较差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论:缝隙连接蛋白及缝隙连接可能是穴位的主要组成成分,且针刺能明显增加缝隙连接蛋白在穴位处的表达.     

Connexin 43在银杏叶提取物抗大鼠脑缺血损伤中的作用

目的通过体内体外实验研究缝隙连接蛋白43(Cx43)与EGb761脑缺血神经保护作用的关系,探讨银杏叶制剂EGb761治疗脑缺血的机制。方法在大鼠原代神经细胞中转染荷载Cx43-shRNA的慢病毒,干扰Cx43蛋白表达,同时给予EGb761 200μg/mL处理观察Cx43的表达以及EGb761对Cx43蛋白表达的影响。建立大鼠脑缺血模型,腹腔给予EGb761 50、100 mg/kg,使用HE染色,TTC染色,免疫组化和westernblot方法检测大鼠脑组织细胞的形态变化和大鼠海马Caspase-3,TUNEL阳性细胞,Cx43,p-Cx43蛋白的表达变化。结果 EGb761给药可以减少脑缺血大鼠脑组织梗死面积,显著性抑制脑缺血大鼠海马Caspase-3表达和TUNEL阳性凋亡细胞数目,显著性抑制大鼠海马神经细胞p-Cx43的表达水平。体外培养的大鼠神经细胞转染Cx43-shRNA慢病毒,给予EGb761处理,处理前后神经细胞Cx43/p-Cx43蛋白表达未见明显变化。结论 EGb761可以减轻脑缺血缺氧引起的细胞损伤,其神经保护作用与抑制缺血引起的缝隙连接蛋白Cx43的表达和激活有关。     

益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞actin、Cx43表达及GJIC功能的影响

目的观察益气活血中药复方对柯萨奇病毒B组3型(Coxsackie virus B3,CVB3)病毒性心肌炎心肌细胞间缝隙连接结构及通讯功能的影响。方法以免疫组化法检测正常组、病毒组、益气活血中药复方组心肌细胞肌动蛋白(actin)及连接蛋白(connexin43,Cx43)表达;,并以激光扫描共聚焦显微镜法检测各组心肌细胞荧光漂白恢复率。结果益气活血中药复方能上调CVB3病毒性心肌炎心肌细胞actin及Cx43表达,能显著改善细胞间缝隙连接通讯(GJIC)功能。结论益气活血中药复方具有对抗CVB3致心肌细胞骨架蛋白损伤,修复CVB3病毒性心肌炎心肌细胞间缝隙连接通道结构,改善CVB3攻击后心肌细胞GJIC功能的作用。     

关于缝隙连接理论在男科的应用

阴茎勃起生理机制中,海绵体平滑肌舒张是重要因素.人类阴茎海绵体平滑肌细胞网络,之所以能同步兴奋并快速协调一致的舒缩,是因为存在缝隙连接（gapjunction,GJ）.由于它主要由连接蛋白43（connexin43,Cx43）构成,故又称Cx43型GJ（connexin43 gap junction）.GJ广泛分布于各脏器组织,在平滑肌协调性舒缩、内环境稳定、胚胎发生及细胞生长调控中发挥重要的作用,是国际研究比较热门的课题之一.Cx43型GJ是维持正常勃起功能的重要条件,其表达异常与勃起功能障碍（erectile dysfunction,ED）的发生密切相关.     

六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗黑色素瘤增效作用的缝隙连接机制初探

目的 探讨六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤小鼠黑色素细胞瘤B16细胞增效作用的缝隙连接机制。方法 制备六味地黄丸含药血清（分别为2.5%、5.0%、10.0%六味血清）及10.0%对照血清。 采用RT-PCR法检测六味地黄丸含药血清对B16细胞株的缝隙链接蛋白（Cx）26和Cx43 mRNA的影响,Western blot法和间接免疫荧光法检测其对B16细胞Cx26和Cx43蛋白表达的影响;RT-PCR检测Cx26－309、Cx26－337、Cx26－367、Cx26－2098 SiRNA对Cx26的干扰效率,选用干扰效率最高的Cx26－2098 SiRNA干扰Cx26基因后观察六味地黄丸联合HSV-tk/GCV的旁观者效应;MTT法检测细胞间缝隙连接通讯功能（gap junctional intercellular communication, GJIC）抑制剂甘草次酸（GA）对六味地黄丸联合tk/GCV系统对B16细胞杀伤作用的影响,实验设为对照血清组,2.5%、5.0%、10.0%六味血清组（简称低、中、高剂量组）及对照血清联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV组,低、中、高剂量联合GCV加GA组。GCV终浓度为20 mol/L,GA终浓度为50 mol/L。结果 六味地黄丸含药血清能提高B16细胞中Cx43 mRNA及蛋白的表达,且具有量效依赖关系;对Cx26 mRNA与蛋白的表达具有双向调节作用,低剂量时具有抑制作用而高剂量是能上调其表达;SiRNA干扰Cx26基因表达后,六味地黄丸联合自杀基因治疗的旁观者效应与没有干扰前比较无明显的变化;低、中、高剂量联合GCV组在GA阻断前细胞抑制率（48.75%、59.39%、69.28%）与阻断后细胞抑制率（29.14%、38.71%、58.13%）比较,显著降低,差异有统计学意义（P<0.01）。结论 六味地黄丸含药血清对HSV-tk/GCV自杀基因系统杀伤恶性黑色素瘤B16细胞的增效作用与缝隙连接机制有关,可能是通过提高Cx26和Cx43等缝隙连接蛋白表达而达到协同增效作用。     

红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR 缝隙连接蛋白 Cx43的影响

目的：观察红花黄色素对乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR缝隙连接蛋白Cx43的影响。方法取对数生长期的MCF－7／ADR细胞,以2×105 cells／孔接种于6孔培养板,24 h后分为4组,每组3孔,其中3组分别加入红花黄色素至终浓度25、50、100 mg／L,另一孔设为空白对照组,作用48 h。 Western blot法检测各组MCF－7／ADR细胞中Cx43表达水平。结果不同浓度红花黄色素作用于MCF－7／ADR细胞48 h后, Cx43表达水平均增高,有明显的剂量依赖关系,以50、100 mg／L浓度作用显著（ P＜0．01）。结论红花黄色素能提高乳腺癌耐药细胞MCF－7／ADR缝隙连接蛋白Cx43的表达水平。     

不同灸法对高脂血症大鼠施灸局部Cx43表达的影响及与血脂调节的相关性

目的探讨温和灸、隔姜灸、麦粒灸,不同灸法对局部效应与整体效应影响之间的相关性。方法建立急性高脂血症大鼠模型,观察温和灸、隔姜灸、麦粒灸3种灸法刺激,对大鼠施灸局部神阙穴皮肤间隙连接蛋白43(Cx43)表达的作用和血脂调节的影响。结果艾灸各治疗组与模型对照组比较差异有极显著性意义(P<0.01),温和灸组、麦粒灸组与隔姜灸组差异有极显著性意义(P<0.01),温和灸组与麦粒灸组差异无显著性意义(P>0.05)。结论 Cx43的表达与不同的灸法影响密切相关,这一结果与不同灸法对血脂调节的影响体现出较为一致的相关性。     

基因治疗联合六味地黄丸对肝癌荷瘤小鼠缝隙连接蛋白表达的影响

目的:探讨六味地黄丸联合基因治疗对小鼠移植性肝癌缝隙连接蛋白(connexin,Cx)表达的影响,初步阐明六味地黄丸对肝癌HSV-tk/GCV自杀基因治疗的增效作用机制是否与缝隙连接相关。方法:昆明种小鼠90只,随机分为模型对照组、六味地黄丸治疗组(ig六味地黄丸10 g·kg-1·d-1)、自杀基因治疗组(ip丙氧鸟苷100 mg·kg-1·d-1)、联合治疗组(ig六味地黄丸10 g·kg-1.d-1+ip丙氧鸟苷100 mg·kg-1.d-1);选用H22与H22/tk细胞株皮下接种建立小鼠肝癌模型,取荷瘤小鼠肿瘤组织进行常规病理制片,采用SABC免疫组化法检测各组肿瘤组织Cx26,Cx32,Cx43蛋白表达。结果:阳性表达定位于细胞浆和细胞膜,Cx43在癌旁组织,特别是有纤维组织浸润部位表达呈强阳性,而在癌结节中肿瘤细胞表达相对较弱;Cx26,Cx32在肿瘤细胞特别是脂肪组织浸润附近的癌组织中呈现强阳性表达。与肿瘤模型组相比,联合治疗组则能增强Cx26,Cx43,Cx32蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05);与单独六味地黄丸和自杀基因治疗组相比,联合治疗组能明显提高Cx32蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:六味地黄丸联合自杀基因治疗能增强Cx26,Cx43,Cx32蛋白表达,尤其是促进Cx32的表达,提示六味地黄丸增强自杀基因旁观者效应的机制与缝隙连接相关。     

Effects of Gingko biloba extract on gap junction changes induced by reperfusion/reoxygenation after ischemia/hypoxia in rat brain

Gap junction communication between astrocytes plays an important role in the brain. The purpose of this study was to investigate the effects of Gingko biloba extract (GBE) on the changes of connexin 43 (Cx43) mRNA and protein expression levels of rat cortex and hippocampus induced by ischemia-reperfusion and astrocyte gap junction intercellular communication (GJIC) induced by hypoxia-reoxygenation. After 2 hours of middle cerebral artery occlusion (MCAO) followed by 24 hours of reperfusion, there was obvious neurological deficit in rats. Cx43 mRNA and protein expression levels of rat cortex and hippocampus in the ischemia hemisphere were decreased significantly. When GBE at doses of 50 and 100 mg/kg body weight was administrated by p.o. daily for 7 days, the neurological deficit was improved, and lower Cx43 mRNA and protein expression levels induced by ischemia-reperfusion were recovered to normal. The i.p. injection of nimodipine (0.7 mg/kg weight body) also showed improvement on neurological deficit and Cx43 expression levels. Astrocyte GJIC was measured by the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Hypoxia-reoxygenation induced a significant decrease in GJIC. Pretreatment with GBE (100 mg/l) and nimodipine (1.6 mg/l) significantly prevented the hypoxia-reoxygenation inhibition of GJIC. These results suggest that GBE could exert its neuroprotective effects by improvement of Cx43 expression and GJIC induced by hypoxia/ischemia-reoxygenation/ reperfusion injury.     

荧光双重标记Cx43在大鼠“足三里”表达的实验研究

目的:研究缝隙连接蛋白Cx43在大鼠“足三里”穴的表达及其与穴位、经络的可能关系。方法:20只健康成年SD大鼠随机分为非针刺组、针刺组,每组10只。应用荧光双重标记免疫组织化学方法和激光扫描共聚焦显微镜技术对成年大鼠皮肤肌肉组织的Cx43进行定位、定量分析。结果:皮肤肌肉组织中Cx43主要在表皮上皮细胞、皮下筋膜的肥大细胞中表达;非针刺组中穴位处Cx43的表达显著高于非经非穴处,两者相比有极显著性差异(P<0.01);穴位针刺后Cx43表达显著增加,与非针刺组中穴位比较有极显著性差异(P<0.01)。结论:电针可使“足三里”穴区皮肤及肌肉组织中的Cx43表达明显增加,缝隙连接蛋白及缝隙连接可能在经络活动中起重要作用。     

间隙连接蛋白家族新成员Cx36

Cx36是哺乳动物间隙连接蛋白(connexin,Cx)家族γ亚类的第一个成员,它参与形成间隙连接,介导相邻细胞间的物质和信息的直接交换。间隙连接是神经系统构成电突触的结构基础,参与调控神经冲动信息的传递和复杂神经网络的整合,而Cx36是唯一一个在神经系统中优先表达的Cx,因此成为电生理研究领域的热点。就Cx36的发现过程、结构和定位进行了总结,并着重介绍它在神经系统中的功能和调节机制。     

电针对帕金森病大鼠纹状体缝隙连接蛋白43的表达及谷氨酸含量的影响

目的:观察电针对帕金森病(PD)大鼠纹状体缝隙连接蛋白(Cx)43及谷氨酸(Glu)的影响,探讨电针治疗PD的作用机制。方法:雄性SD大鼠,随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组,每组10只。用立体定向微量注射法向大鼠右侧纹状体注射6-羟基多巴胺制备偏侧PD大鼠旋转模型。电针组电针"风府""太冲"穴,每次30min,每日1次,7d为1个疗程,共治疗2个疗程。行为学测试观察PD大鼠旋转行为的改变,运用HPLC荧光法检测纹状体Glu含量,采用Western blot法检测纹状体Cx 43蛋白活性表达的变化。结果:电针组大鼠治疗后旋转行为较治疗前及模型组改善明显(P0.01,P0.05)。模型组大鼠Cx43表达较正常组和假手术组显著升高(P0.01),Glu含量显著升高(P0.01)。电针组大鼠Cx 43表达较模型组显著降低(P0.01),Glu含量降低(P0.05)。结论:电针防治帕金森病的机制可能与针刺能够抑制纹状体Cx 43的表达,减少星形胶质细胞释放Glu有关。     

阻断缝隙连接对膀胱经腧穴组织氧分压的影响

[摘要 ]目的：探讨缝隙连接与经络现象之间的联系。方法：分别采用1-庚醇阻断山羊腧穴缝隙连接及小鼠Cx43基因敲除方法,采用新型组织氧分压传感针检测山羊及小鼠膀胱经经穴及旁开非经穴处的氧分压。结果：①山羊膀胱经经穴的组织氧分压高于旁开对照点,两者有显著性差异（P﹤0.01）;②注射1-庚醇后,山羊膀胱经经穴的氧分压较未注射前及注射生理盐水均明显升高,两者有显著性差异（P﹤0.01）;③缝隙连接蛋白Cx43野生型（WT）小鼠膀胱经经穴的组织氧分压明显高于其旁开非经穴点,差异有显著性意义（P<0.01）;缝隙连接蛋白Cx43杂合型（HT）小鼠上述各穴位点的组织氧分压也高于其旁开对照点,但差异无统计学意义（P>0.05）;④WT小鼠各穴位点的组织氧分压均明显高于HT小鼠（P<0.05）,而各非经穴点的氧分压两组间比较无显著性差异（P>0.05）。结论：缝隙连接在针刺信号转导过程中具有重要作用。     

双参通冠方对急性心肌缺血再灌注模型核因子-κB信号途径及细胞间隙连接通讯的影响

目的观察双参通冠方(SSTG)对急性心肌缺血再灌注损伤动物模型心肌梗死面积及重量,心肌核因子-κB(nuclear factor—kappa B,NF—κB)信号途径及心肌细胞间隙连接蛋白Cx43的影响．方法用冠状动脉结扎／放松法复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,N—BT染色法测量心肌梗死范围;免疫组织化学法检测心肌组织NF—κB p65表达;双抗体夹心ABC—ELISA法测定各组血清肿瘤坏死因子(TNF—α)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)含量;免疫组织化学法测定心肌细胞通讯间隙连接蛋白Cx43表达。结果模型组大鼠心肌梗死面积及梗死区重量、NF-κB p65表达、血清中TNF-α及ICAM—1含量明显升高(P<0．05);心肌连接蛋白Cx43大量降解。SSTG理后心肌梗死面积及重量减轻;血清中TNF—α、ICAM-1水平下调(P<0．05);NF—κB p65表达及Cx43降解抑制．结论缺血再灌注时,心肌梗死严重,NF—κB信号途径可被激活,Cx43降解严重。SSTG能抑制NF-κB的活化,抑制血清中TNF-α、ICAM—1的过量分泌和抑制Cx43的降解,减小心肌梗死面积及重量。