幽门螺杆菌多表位肽在毕赤酵母中的分泌表达

构建分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE的毕赤酵母。以原核表达载体pET-22b-CTB-UE为模板,通过PCR扩增得到融合His-tag的ctb-ue基因序列,将其插入酵母表达载体pPIC9K,得到重组表达载体pPIC9K-CTB-UE。重组表达载体pPIC9K-CTB-UE经内切酶Sal I线性化后,电击转化进毕赤酵母GS115,通过组氨酸缺陷性MD平板筛选重组菌株,G418抗性筛选多拷贝转化子,阳性转化子经PCR鉴定,摇瓶发酵表达,取上清经过超滤浓缩,Ni-NTP亲和层析纯化,透析脱盐,SDS-PAGE检测,Western blot验证。结果获得了整合有ctb-ue基因的毕赤酵母,诱导后分泌表达的CTB-UE蛋白能够与His-tag抗体发生特异性反应。成功构建了分泌型毕赤酵母GS115(pPIC9K-CTB-UE),能分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE。     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。     

人骨保护素成熟肽表达载体的构建、表达及重组蛋白免疫学鉴定

目的：构建人骨保护素(OPG)成熟肽cDNA重组表达载体，实现其在毕赤酵母中的高效表达。方法：由人成骨细胞提取总RNA，经RT—PCR扩增得到人0PG成熟肽cDNA，克隆入分泌型表达载体pPIC9K，转化酵母细胞，G418筛选多拷贝整合的重组子进行甲醇诱导表达，产物行Western blottmg鉴定。结果：成功构建了人OPG成熟肽表达载体，该载体能在酵母细胞中获得分泌表达，诱导96h的表达量占上清总蛋白的30％。重组蛋白相对分子质量约55ku，可被0PG抗体识别。结论：重组人OPG成熟肽在酵母表达系统获得较高水平表达，为进一步研究开发基因工程药物准备了条件。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建Exendin-4基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础。方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4。重组质粒经SacI线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达。结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达。结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建与鉴定

目的构建人肠三叶因子(hITF)的毕赤酵母表达载体。方法从人结肠黏膜提取总RNA,经RT-PCR得到hITF cDNA,用PCR方法扩增hITF基因,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建含AOX1启动子和α分泌信号肽序列的重组表达质粒pPIC9/hITF。结果通过酶切和基因序列分析确定插入pPIC9中的片段为hITF基因片段。结论重组质粒pPIC9/hITF的成功构建,为在真核细胞中高效表达hITF。并制备其抗体的进一步研究提供基础。     

重组可溶性补体1型受体在酵母SMD1168中表达纯化及鉴定

目的在酵母细胞SMD1168中表达人可溶性补体1型受体(sCR1),并对其重组蛋白进行纯化以探讨较为接近人体天然蛋白的表达方式,从而为临床诊断及治疗提供方便。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48-72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为大于31kD的蛋白区带,在Western blot实验中可被sCR1的CD35单克隆抗体识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人C-型利钠肽-血清白蛋白融合蛋白质的构建及在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人C-型利尿钠肽(CNP)-人血清白蛋白(HSA)融合蛋白质的毕赤酵母。方法重叠PCR拼接CNP(400 bp)-HSA(1 800 bp)成融合基因,双酶切后克隆至表达载体pPIC9K中。电穿孔法转染毕赤酵母菌KM71,摇瓶培养分泌表达。结果融合基因约为2 200 bp,序列测定正确。SDS-PAGE分析相对分子质量约为80 000,Western blot和RIA鉴定显示其为CNP与HSA的杂合分子。结论实现了HSA-CNP融合蛋白质在毕赤酵母中的分泌表达。     

猪囊尾蚴cC1亚单位疫苗毕赤酵母高表达体系的优化

目的　优化猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗毕赤酵母表达系统。方法　毕赤酵母转化菌在 BMMY、BMM、MM及各加 1%酪蛋白水解物 (CA)的诱导培养基中经 0 .5 %甲醇诱导表达后 ,上清液行 SDS- PAGE。结果　高拷贝毕赤酵母转化菌 SMD116 8的表达水平高于酵母转化菌 GS115 ;Mut S型比 Mut+型表达量高 ;表达水平与拷贝数呈正相关 ,即拷贝数越高 ,表达量也越高 ;在诱导培养基 BMMY中的表达水平明显高于其它诱导培养基 ;阴性对照菌未见目的表达条带。结论　猪囊尾蚴 c C1亚单位疫苗在毕赤酵母高表达系统中得到优化 ,为大量制备生产打下了基础。     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

Cloning and functional expression of ubiquitin-like protein specific proteases genes from Candida albicans

The small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification occurred at bud necks and sites of septum formation in hyphae of the opportunistic fungal pathogen Candida albicans. Three genes encoding putative SUMO deconjugation enzymes (Ulp, ubiquitin-like protein specific proteases) of C. albicans were obtained through sequence database searching with Ulp domain of Saccharomyces cerevisiae Ulp1 (ScUlp1). These genes were designated as CaULP1, CaULP2 and CaULP3. The open reading frames of three putative ULPs were cloned and expressed in Pichia pastoris, resulting recombinant proteins. Functional analysis of recombinant CaUlp1, CaUlp2 and CaUlp3 confirms that these proteins exhibit SUMO-processing activity. CaULP1, CaULP2 and CaULP3 only expressed active form enzyme in P. pastoris but not in Escherichia coli. The molecular weights of CaUlp1, CaUlp2 and CaUlp3 proteins expressed in P. pastoris were larger than theoretical molecular weights. This observation was in good agreement with result of Western blot analysis of CaUlp1 and CaUlp3 proteins in C. albicans. It was assumed that CaUlp1, CaUlp2 and CaUlp3 proteins may need post-translational modifications to exhibit SUMO-processing activity. To our knowledge, this is the first report on cloning and expression of Ulp genes from C. albicans. Furthermore RT-PCR and Western blot analysis show that CaULP2 has no detectable expression both in yeast and in hyphal forms of C. albicans.