星形胶质细胞的神经干细胞特性

胶质细胞是脑内数量最多的细胞,它与神经元之间的相互联系是在发育期就精确建立的。不同神经元的功能已有较深入的研究,与之相比,胶质细胞仍是非常神秘的细胞,特别是星形胶质细胞,除了对神经元提供重要的结构、代谢、营养支持外,它与神经元之间复杂的相互联系仍不清楚。本文将对星形胶质细胞作为神经干细胞／祖细胞这一最新发现作一综述。     

大鼠脊髓星形胶质细胞的分离与纯化

目的:纯化培养和鉴定新生大鼠的脊髓星形胶质细胞,建立稳定的星形胶质细胞培养体系,为研究创伤后慢性神经病理性痛的脊髓机制奠定基础。方法:根据成纤维细胞与星形胶质细胞生长倍增时间的差异,用阿糖胞苷(Ara-C)抑制成纤维细胞生长分裂的方法获取星形胶质细胞,用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光法对其鉴定。同时与差速贴壁培养法进行对比。结果:用Ara-C处理后,可获得较高纯度的星形胶质细胞,经鉴定其纯度可达90%以上,而对照组几乎全部为成纤维细胞。结论:Ara-C处理能彻底清除成纤维细胞,从而保持星形胶质细胞的正常生长繁殖,达到纯化星形胶质细胞的目的。     

星形胶质细胞谱系及星形细胞瘤起源的研究

各种神经胶质细胞中数目最多、分布最广的星形细胞担负了神经胶质细胞的大部分功能。根据对两种神经组织标志物─ＧＦＡＰ、Ａ－２Ｂ－５抗体的反应不同，将星形细胞分为１型（ＧＦＡＰ＋Ａ－２Ｂ－５－）和２型（ＧＦＡＰ＋、Ａ－２Ｂ－５＋）。研究指出两型星细胞来源于不同祖细胞，而存在两个谱系，星形细胞胶质瘤与星形细胞具有同样的谱系源。对小胶质细胞在星形细胞发生和分化中的作用亦予以阐述。     

大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及其促神经突起生长作用研究

取生后１周以内ＳＤ大鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化结合机械吹打使细胞分散，制成较大量的初细胞悬液。将初细胞悬液先行粘附处理３０ｍｉｎ以排除其中的成纤维细胞，再制成较小量的次细胞悬液。将之接种到预先涂有鼠尾胶原的培养瓶中，令其贴壁３～５ｈ，细胞密度约１×１０５个／ｃｍ２。补加培养液，继续培养。培养液为含２０％小牛血清的ＤＭＥＭ／Ｆ１２混合培养液。俟细胞铺满瓶底后传代。届时细胞悬液亦行３０ｍｉｎ的粘附处理。以０．５×１０５个／ｃｍ２的细胞密度种植于培养瓶中。传代后先培养４８ｈ；换成无血清培养液再培养４８ｈ并收集条件培养液。对部分传代细胞进行胶质原纤维酸性蛋白免疫细胞化学杂色鉴定，证明传代后的细胞中星形胶质细胞比例达９４．７１％。取条件培养液及单纯ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液各１份，分别与２份有血清培养液混合，制成实验组与对照组两种培养液，以悬滴法培养鸡胚背根节。４８ｈ后，比较两组背根节神经突起的平均长度。经统计学分析揭示，实验组背根节神经突起平均长度显著大于对照组者，说明星形胶质细胞具有明显的促神经突起生长作用。     

小胶质细胞源性因子对培养星形胶质细胞的活化作用研究

目的和方法：本实验采用胶质细胞分离纯化培养、胶质原纤维酸性蛋白（glial fibric acidic protein,GFAP）表达的免疫荧光流式细胞仪检测及[³H]-TdR掺入等方法,观察离体条件下小胶质细胞条件培养液对星形胶质细胞增殖与GFAP表达的影响。结果：小胶质细胞条件培养液能明显促进培养星形胶质细胞的增殖和GFAP的表达。结论：小胶质细胞源性因子能刺激星形胶质细胞的活化,由此推测在体条件下小胶质细胞源性因子可能是引起反应性胶质化的因素之一。     

芍药甙对体外培养大鼠星形胶质细胞活性的作用

目的　观察中药芍药有效成分芍药甙 (paeoniflorin ,PF)对培养的大脑皮层星形胶质细胞活性的影响。方法　采用体外星形胶质细胞培养的方法 ,对新生SD大鼠 (P2 )大脑星形胶质细胞进行培养 ,7d后纯化 ,再分别进行有血清和无血清培养。以MTT法观察PF对星形胶质细胞活性的影响 ,运用免疫组织化学的方法进行形态学观察。　结果　PF对星形胶质细胞活性有明显的抑制作用 ,不同浓度PF组星形胶质细胞活性均低于对照组 (P <0 0 1) ,并呈现出一定的量效关系 ,这种对星形胶质细胞活性的抑制作用与血清的存在与否无关。　结论　本实验表明芍药甙能抑制星形胶质细胞的活性 ,从而提示PF促进神经细胞活性的作用是一种直接的作用 ,而不是通过胶质细胞间接影响神经细胞     

新生大鼠大脑皮层少突胶质细胞/Ⅱ型星形胶质祖细胞原代培养及形态

目的:研究不同诱导条件对大鼠大脑皮层O2A祖细胞生长活性的影响。方法:采用两次恒温摇床振荡培养法,倒置显微镜结合免疫荧光染色法鉴定细胞种类并判断纯度,透射电镜观察细胞超微结构。结果:O2A祖细胞胞体呈圆形,常有单极或双极突起.形成克隆球,A285标记阳性,免疫荧光鉴定细胞纯度可达90%以上。O2A祖细胞具有双向分化的能力,在不同诱导条件下可分化为星形胶质细胞或少突胶质细胞。电镜观察O2A祖细胞呈圆形或椭圆形,核仁可见,胞质内细胞器少,核周见成束胞质丝。结论:选择合适的培养基对O2A祖细胞纯化培养及诱导分化极其重要。     

成年小鼠室管膜下区神经干细胞分离及培养方法改良

目的:改良成鼠神经干细胞(NSCs)分离培养方法,优化培养条件,为系统研究成体干细胞增殖与分化特性以及利用成体干细胞进行细胞治疗奠定基础。方法:视交叉前1.5 mm处离段脑组织,分离前脑室管膜下区(SVZ),通过机械性消化与化学性消化相结合的操作方法制备细胞悬液,应用改良无血清培养基悬浮培养NSCs。nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,1%胎牛血清诱导分化后免疫荧光染色鉴定NSCs多向分化潜能。系列稀释实验和5-溴脱氧尿核苷(BrdU)掺入实验比较改良培养与常规培养NSCs自我更新能力和增殖潜能。结果:改良培养条件,NSCs 7～9 d可形成nestin阳性神经球。应用1%FBS诱导后,NSCs分化为形态各异的细胞,包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,分化比例分别是(18.6±3.5)%、(73.2±5.2)%和(3.6±0.4)%。系列稀释实验结果显示当细胞接种数量为500、1000和2000个,改良培养NSCs形成次代神经球数量较常规培养对照组明显增多(P<0.05),并且8 h BrdU掺入率也显著增高达(42.4±6.2)%(P<0.05),表明改良培养条件下NSCs自我更新能力和增殖活力良好。结论:本研究建立了一种简便、操作性强、重复性高的成鼠NSCs分离培养方法。     

Survival of neural progenitor cells from the subventricular zone of the adult rat after transplantation into the host spinal cord of the same strain of adult rat

The subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle of the mammalian forebrain is the major site in which neural progenitor cells (NPC) persist in the adult brain. The NPC are located beneath ventricular ependymal cells and have the capacity to self-renew and continuously produce neurons and glial cells. We have shown previously that neurospheres can be obtained from the brain of deceased adult rats and that neurosphere cells survive after transplantation into the spinal cord. In the present study, we investigated whether fresh NPC from living adult rats can survive and be integrated into host tissues after transplantation into the adult rat spinal cord of the same strain. We used rats expressing transgenic green fluorescent protein (GFP) as a donor to identify the transplanted NPCs. The SVZ tissues were obtained from the striatal wall of the lateral ventricle of adult GFP-rats and were grafted into lesions of the spinal cord at the cervical level. Two to 3 weeks after grafting, NPC migrated through the host tissue 0.5-1 mm away from the implantation site, and were integrated into the white matter of the host spinal cord. Surviving NPC exhibited immunohistochemical phenotypes of astrocytes (glial fibrillary acidic protein), but not for neurons (alpha-tubulin III) or oligodendrocytes (Rip; Hybridoma Bank, Iowa City, IA, USA). Thus, NPC from the SVZ of adult rats can survive and differentiate into at least astrocytes, which can then be integrated into host tissue after transplantation into spinal cord lesions in the adult rat.     

胶质细胞源性神经营养因子对培养的胚鼠脑室下区神经干细胞表达Pitx3及酪氨酸羟化酶的影响

目的:观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对培养的胚鼠脑室下区(SVZ)神经干细胞(NSCs)表达Pitx3、酪氨酸羟化酶(TH)的影响。方法:取胚鼠SVZ组织,进行细胞培养。分为GDNF NSCs共培养组和NSCs单独培养对照组。用Pitx3、TH、Pitx3/TH免疫荧光单标和双标及Nestin免疫组化法进行检测。结果:共培养组5 d时形成神经球,10 d时球体积不断增大,12 d后开始贴壁生长,并向四周伸出突起并开始分化。对照组神经球明显少于共培养组。14 d共培养组Pitx3、TH、Pitx3/TH阳性细胞明显高于对照组。结论:GDNF能上调SVZ区NSCs表达Pitx3和TH,诱导NSCs向多巴胺(DA)能神经元分化。     

用组织块法培养成年和老年鼠神经干细胞

目的　探索体外培养扩增成年及老年动物室管膜下区 (SVZ)神经干细胞的实用方法。方法　取 8、14及 2 4三个月龄SD大鼠SVZ组织块置含bFGF的DMEM/F12 +B2 7培养液培养 ,Nestin免疫组化法鉴定细胞表型。结果　各月龄的SVZ组织块均能长出Nestin阳性的神经小球及神经干细胞 ,培养 7～ 10天产生的神经球最多 ,神经干细胞状态最佳。结论　用含bFGF的培养基培养成年和老年大鼠SVZ组织块能产生较多的神经干细胞 ;此法是一种具有实用价值的培养、扩增神经干细胞的手段。     

成年和老年大鼠局灶性脑缺血后脑室下区细胞的增殖分化

目的：比较老年和成年大鼠局灶性脑缺血后脑室下区（SVZ）神经干细胞的增殖与分化。方法：制作大脑中动脉梗死模型,用免疫组化法检测SVZ的5-溴脱氧尿核苷（BrdU）、神经元核抗原（NeuN）及胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性细胞数的变化。结果：SVZ的BrdU阳性细胞在正常组和假手术组成年大鼠明显多于老年大鼠。实验组成年和老年大鼠均在缺血后增加,28d时仍高于正常水平,但成年大鼠各时间点均明显高于老年大鼠。在新生细胞中部分细胞是Brdu／NeuN或BrdU／GFAP双标细胞,但老年大鼠Brdu／NeuN双标细胞明显少于成年大鼠。结论：大鼠脑缺血激活SVZ神经干细胞增殖能力,成年大鼠明显强于老年大鼠,且新生细胞分化为神经元的比例也明显高于老年大鼠。     

Neural-specific inactivation of ShcA functions results in anatomical disorganization of subventricular zone neural stem cell niche in the adult brain

Shc(s) family of adaptor molecules has been implicated in several physiological functions. In particular, our previous studies have shown major roles in the mechanisms that control the transition from proliferating neural stem cells (NSCs) to postmitotic neurons in the mammalian brain. In the adult brain, ShcA expression is mainly restricted to a subpopulation of cells in the subventricular zone (SVZ) neurogenic area, enlightening a potential role for this molecule in the establishment/maintenance of this adult NSC niche. In order to investigate this matter, here we took advantage of Cre/lox technology with the purpose of interfering with (or delete) ShcA function in nestin-expressing neural progenitors in vivo. Our analyses revealed signs of anatomical disorganization in the adult brain at the boundary between the striatum and the corpus callosum and reduced thickness both at the ventricular level and through the rostral migratory stream. Analysis of cell proliferation and cell death unveiled a prominent reduction of the former and no substantial alterations of the latter. Ultrastructural studies showed SVZ anatomical disarray and manifest variation in the SVZ cell type composition. In conclusion, these results provide evidence for a role of ShcA in the assembly and/or maintenance of the SVZ NSC niche in the adult brain.     

妊娠20～24周人脑室管膜下区神经细胞组成

目的:研究妊娠20～24周人胎脑室管膜下区(SVZ)神经细胞分化。方法:收集胎龄为20～24周的正常胚胎6例。快速解离SVZ并行即刻培养,4 h后应用特异免疫标记识别各类型神经细胞。结果:大约50%左右SVZ细胞为神经元[MAP2]细胞为(50.9±4.6)%,β-Ⅲ-tubulin细胞为(51.7±3.8)%],其中皮质神经元亚型calretinin中间神经元占(3.5±0.3)%;约1/3 SVZ细胞具有早形胶质细胞特性[vimentin]细胞为(32.7±1.5)%,GFAP细胞占(31.9 3.0)%];少突神经胶质前体细胞(PDGFR_α细胞)为(6.7±0.6)%,小胶质细胞(lectin细胞)占(1.1±0.1)%,神经干佯细胞(nestin细胞)为(14.6±0.9)%。大约有1/10 SVZ细胞正处于细胞分裂期[BrdU细胞占(11.0±0.02)%]。结论:妊娠20～24周,人类SVZ增殖活跃,包含有神经元、星形胶质细胞、少突神经胶质前体细胞、多潜能干细胞在内的各种细胞亚群。     

The nuclear receptor tailless is required for neurogenesis in the adult subventricular zone

The tailless (Tlx) gene encodes an orphan nuclear receptor that is expressed by neural stem/progenitor cells in the adult brain of the subventricular zone (SVZ) and the dentate gyrus (DG). The function of Tlx in neural stem cells of the adult SVZ remains largely unknown. We show here that in the SVZ of the adult brain Tlx is exclusively expressed in astrocyte-like B cells. An inducible mutation of the Tlx gene in the adult brain leads to complete loss of SVZ neurogenesis. Furthermore, analysis indicates that Tlx is required for the transition from radial glial cells to astrocyte-like neural stem cells. These findings demonstrate the crucial role of Tlx in the generation and maintenance of NSCs in the adult SVZ in vivo.     

去大脑皮质血管对成年大鼠侧脑室室管膜下层神经干细胞增殖的影响

目的:研究去大脑皮质血管对成年大鼠侧脑室室管膜下区(subependymal ventricular zone,SVZ)干细胞增殖的影响。方法:成年大鼠随机分为正常组和模型组,通过免疫组织化学的方法检测去大脑皮质血管后成年大鼠侧脑室前角、中央部、下角室管膜下BrdU标记细胞。结果:去皮质血管后大鼠侧脑室各部SVZ的BrdU阳性细胞的数目明显增多,去大脑皮质血管15d、30d大鼠侧脑室各部外侧壁和前角上壁SVZ的BrdU阳性细胞核计数均明显多于正常组。结论:去大脑皮质血管损伤可诱导大鼠脑内侧脑室室管膜下细胞的增殖。