靶向增强型TK表达载体在鼻咽癌细胞中的作用研究

目的探讨hTERT启动子及CMV增强子双调控机制的增强型表达载体pGL3-bas-ic-EGFP-TK-hTERTp-CMV enhancer在鼻咽癌细胞中的靶向杀伤效应。方法构建靶向性增强型hTERT启动子及CMV增强子双调控TK表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer,并以单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp作为对照组,分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌细胞株5-8F、人乳腺癌细胞MCF-7（阳性对照）及正常人血管内皮细胞ECV（阴性对照）。荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,Stretch PCR法检测肿瘤细胞端粒酶活性,MTT法分析杀灭鼻咽癌细胞的效果等作为检验指标。结果①该增强型表达载体转染5-8F细胞及MCF-7细胞后的绿色荧光表达及TK基因的mRNA表达均强于单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp组;而ECV细胞只有极微弱的绿色荧光和极弱的TK基因的mRNA表达。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值较对照组单启动子组明显增高,是单启动子组的2～5倍。StretchPCR法检测转染前后5-8F细胞端粒酶活性明显被抑制。②加入GCV后增强载体组对鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞体外增殖均有明显抑制作用,均高于单启动子载体组、不加GCV的增强型载体组、空载体组及空白对照组。结论以hTERT启动子及CMV增强子双调控机制介导TK基因的新型靶向增强型表达载体能够高效靶向性杀灭鼻咽癌细胞,这种新型高效靶向增强型载体有可能成为一种针对包括鼻咽癌在内的具有较为广泛抗癌谱的恶性肿瘤临床靶向基因治疗的新策略。     

鼻咽癌细胞中增强型表达载体调控TK基因与端粒酶活性关系的研究

目的:探讨人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因核心启动子和原核增强子CMV联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统对TK基因的活性改变及与鼻咽癌细胞中端粒酶活性的关系。方法:将改良构建后的增强型载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer及单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp(作为对照组)分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞株及对照组细胞人乳腺癌MCF-7细胞(端粒酶阳性)及正常人血管内皮ECV细胞(端粒酶阴性),采用荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,TRAP银染法检测肿瘤细胞转染前后端粒酶活性改变并分析TK基因表达与端粒酶活性之间的关系。结果:①增强型表达载体转染鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,比单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp及ECV细胞绿色荧光要强。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值亦较对照组明显增高。②转染增强型载体(加GCV)后TRAP银染法检测鼻咽癌5-8F细胞端粒酶活...     

短发夹RNA抑制hTERT基因对鼻咽癌细胞端粒酶活性及PCNA和Caspase-3蛋白表达的影响

目的:研究靶向人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA)对鼻咽癌细胞系(CNE)端粒酶活性及PCNA、Caspase-3蛋白表达的影响.方法:构建表达靶向hTERT mRNA特异的shRNA的质粒pEGFP-shTERT.将pEGFP-shTERT转染CNE细胞,TRAP PCR-ELISA法检测端粒酶活性,MTT法测定细胞增殖活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达.结果:pEGFP-shTERT成功转染入CNE细胞后, 端粒酶活性显著下降;细胞增殖活性明显受抑制;大量细胞凋亡;处理后24及48 h,PCNA蛋白下调至64.41%、58.67%(P<0.05),Caspase-3上调到1.55、1.60倍(P<0.05).结论:shRNA靶向抑制hTERT基因在鼻咽癌CNE细胞系中的表达,能显著地抑制细胞的端粒酶活性,调节PCNA和Caspase-3蛋白表达,从而抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡.端粒酶、PCNA和Caspase-3共同参与了鼻咽癌的发生、发展过程.     

小干扰RNA对喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤增殖细胞核抗原及p53蛋白表达的影响

目的：应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制裸鼠喉癌皮下移植瘤人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨移植瘤中增殖细胞核抗原（PCNA）及p53蛋白表达的变化。方法：根据hTERT cDNA序列构建表达短发夹RNA（shRNA）的、靶向hTERT mRNA的真核表达质粒pshRNA,其载体质粒含荧光素报告基因。建立人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型,将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况。以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的表达;以免疫组织化学SP法检测PCNA及p53蛋白在肿瘤内的表达。结果：所有裸鼠均接种成功,5d后可见皮下肿瘤形成,14d左右肿瘤直径达5～7mm。pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达。病理学检查发现：pshRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂少见,可见大量癌细胞坏死。与注射生理盐水的对照组比较,转染质粒完毕后7d抑瘤率为76．50％,P〈0．01。pshRNA治疗后瘤体内PCNA蛋白表达显著下调（P〈0．05）,p53蛋白表达显著上调（P〈0．05）。结论：靶向hTERT mRNA的shRNA可显著抑制人喉癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能是诱导PCNA下调,促进p53蛋白表达所致。     

多基因共沉默对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤影响的研究

目的 应用基因克隆技术构建一个载体同时编码四个不同基因的真核表达质粒,并与单基因质粒作对比,通过裸鼠成瘤实验研究其对体内鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶(hTERT)并含荧光素标记的短发夹RNA质粒(命名为P-1),并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin 和hTERT的质粒(分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5),建立人鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞株裸鼠皮下接种模型,分别将其转染于荷瘤裸鼠瘤体内,以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的转染及表达情况.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果.脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测各组移植瘤细胞凋亡率.结果 所有裸鼠均接种成功,l周左右可见皮下肿瘤形成,并随时间延长不断增大.各质粒组载体转入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达,而空白对照组未见绿色表达荧光.肿瘤体积生长曲线表明,单基因组和多基因组肿瘤生长明显受到抑制,以多基因组肿瘤体积抑制最为明显.肿瘤抑制率在Pl～5组分别为82.4%、46.2%、48.5%、51.9%和46.8%.RT-PCR和免疫印迹法在体内实验证实单基因质粒组主要引起单个基因mRNA和蛋白的表达下降,而多基因质粒组可以同时下调四个不同基因mRNA和蛋白的表达,TUNEL实验表明多基因质粒能更有效地促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤的生长.结论 多基因共沉默对鼻咽癌基因治疗有着潜在的应用前景,同时阻断多个基因可能是恶性肿瘤基因治疗的一个希望所在.     

microRNA抑制鼻咽癌VEGF基因表达的实验研究

目的:观察人工构建的microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞VEGF基因表达的调控效应,探讨microR-NA在鼻咽癌基因治疗中的应用前景.方法:构建靶向VEGF基因的microRNA表达质粒,脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,RT-PCR检测转染细胞中VEGF基冈的mRNA水平,Western Blotting法观察microRNA对VEGF蛋白表达水平的调控效应,CCK-8比色法检测靶向VEGF的人工构建microRNA对鼻咽癌细胞生长的抑制作用,皮下注射稳定转染microRNA质粒的CNE-2细胞,构建裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤牛长情况.结果:在mi-croRNA表达质粒转染CNE-2细胞后,VEGF的mRNA表达水平下调,蛋白表达水平降低,但是光镜和荧光显微镜下的初步观察显示CNE-2细胞牛长未发生变化,以CCK-8比色法检测的细胞增殖抑制率也无明显改变,而在初步的裸鼠移植瘤实验中,发现调控VEGF表达的microRNA重组质粒能有效抑制肿瘤生长.结论:人工构建表达microRNA的质粒,可在鼻咽癌CNE-2细胞中有效F调VEGF基因的表达水平,抑制裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础.     

肿瘤靶向性人可溶性TRAIL载体的构建及其在鼻咽癌细胞株CNE-2的表达

目的克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为鼻咽癌基因治疗的靶向性奠定实验基础。方法提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。用Western blot鉴定鼻咽癌细胞株CNE-2中表达产物。结果RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片断。经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。Western blot结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在鼻咽癌CNE-2肿瘤细胞中能有效表达。结论重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为鼻咽癌基因治疗的靶向性提供了可能性。     

靶向性重组TRAIL基因诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡的效应

目的研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。 方法刺激人外周血淋巴细胞增殖,提取总DNA。采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL功能区的融合基因,克隆入pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人黑色素瘤细胞株A375中,以台盼蓝拒染法和电镜下细胞形态变化,观察转染的A375细胞的凋亡。结果构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,其表达产物能诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡。结论成功地构建了重组真核表达载体pGL3-181hTERT /TRAIL,为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。     

RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的实验研究

目的 应用RNA干扰技术构建一个载体同时编码四个基因,即血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶的短发夹重组质粒,并与单基因质粒做对比,通过体内外实验,研究其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶并含荧光素标记的短发夹RNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶的质粒,分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞及瘤体内的转染及表达情况.四甲基偶氮噻唑蓝法检测细胞增殖活性,实时PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果,Trans well侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变,流式细胞仪观察各组凋亡率,体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果.结果 多基因干扰质粒转染鼻咽癌细胞后,CNE-2Z细胞增殖受到明显抑制,体外侵袭能力显著下降(P值均＜0.05).实时PCR证实多基因组4个不同基因mRNA表达均降低,免疫印迹技术验证目的基因蛋白同时表达下调.流式细胞仪结果证明多基因凋亡率明显高于单基因组(P值均＜0.05).体内抑瘤实验表明,与阴性组和空白组相比,P-1组移植瘤生长明显受到抑制(P＜0.05),并且多基因质粒抑制肿瘤细胞增长的作用要强于单基因干扰质粒(户值均＜0.05).结论 同时干扰多个基因能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌基因治疗奠定了良好的实验基础.     

干扰hTERT基因慢病毒载体对人鼻咽癌细胞的生长抑制作用

目的:本课题利用RNA干扰(RNAi)技术,研究短发夹RNA (siRNA)抑制人端粒酶逆转录酶( hTERT)基因表达对鼻咽癌细胞生长的抑制作用.方法:根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA的特异的、含荧光素基因的真核表达载体,包装成慢病毒.实时定量PCR及Western blot分析染细胞hTER...     

端粒酶抑制因子PinX1基因在鼻咽癌细胞中的表达及作用效应分析

目的 探讨PinX 1基因在鼻咽癌细胞中的表达及其作用效应分析.方法 构建包含全长人PinX 1基因序列的质粒载体pEGFP-C 3-PinX 1及Pinx 1的小干扰RNA,PinX1-FAMsiRNA.脂质体法转染人鼻咽癌5～8F细胞,采用RT-PCR检测PinX 1基因和端粒酶催化亚单位( hTERT) mRNA...     

Avastin联合重组腺病毒胸苷激酶自杀基因抗鼻咽癌的体内外实验

目的通过体内外实验初步探讨重组人血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体Avastin和重组腺病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷（adenovirus—thynidine kinase／Ganciclovir，Ad-TK／GCV）自杀基因系统在鼻咽癌治疗中的价值。方法采用人VEGF ELISA试剂盒检测鼻咽癌CNE1细胞分泌的VEGF水平，四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl terazolium，MTT）法检测Avastin和Ad—TK／GCV对CNE1细胞的抑制作用，流式细胞仪和Hoechst 33342染色法探讨其作用机制。建立CNE1细胞荷瘤裸鼠移植瘤模型，分组在裸鼠肿瘤局部注射磷酸盐缓冲液、Avastin、Ad—TK／GCV、对照Ad—Lac—Z／GCV和Ad—TK／GCV＋Avastin。观察治疗后移植瘤生长情况、抑瘤率和肿瘤组织病理学改变。结果CNE1细胞分泌VEGF；Avastin对CNE1细胞无直接作用。随着Ad—TK感染复数和前体药物浓度的增加，Ad—TK／GCV对CNE1细胞的杀伤作用逐渐增强，旁观者效应的存在增强了这种杀伤作用。流式细胞仪分析显示Ad—TK组与对照组相比，死亡细胞的比率差异有统计学意义（t值分别为30．812和41．006，P值均为0．000）。Hoechst33342染色法显示Ad—TK组与对照组相比，凋亡细胞的比率差异有统计学意义（t=47．351，P=0．000）。CNE1细胞裸鼠体内实验显示Avastin组、Ad—TK／GCV组和Ad—TK／GCV＋Avastin组肿瘤增长缓慢，肿瘤体积在不同时间点小于对照组（P〈0．05或P=0．000）；平均瘤重均明显低于对照组（P值均为0．000）。病理检查示Ad—TK／GCV组、Ad—TK／GCV＋Avastin组肿瘤呈片状坏死，经Avastin治疗的鼻咽癌移植瘤边缘血管生成明显减少。结论体外实验观察到Avastin对鼻咽癌CNE1细胞无直接作用；Ad—TK／GCV系统通过引起细胞坏死和细胞凋亡杀伤CNE1细胞，旁观者效应的存在增强了自杀基因的杀伤作用。Avastin及Ad—TK／GCV自杀基因系统对鼻咽癌CNE1细胞荷瘤裸鼠移植瘤的生长有一定抑制作用，两种治疗联合产生协同作用。     

亚砷酸联合顺铂对人鼻咽癌裸鼠移植瘤及增殖细胞核抗原和Ki-67的影响

目的　研究亚砷酸（As2O3）对人鼻咽癌CNE-2Z裸鼠移植瘤与增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclearantigen,PCNA）、Ki-67的作用,探讨该药物的抗肿瘤机制。方法　建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组（NaCl）组、As2O3组、顺铂（Cisplatin,DDP）组和As2O3+DDP组,观察裸鼠移植瘤生长情况;采用HE染色,于光镜下观察各组移植瘤组织细胞病理形态学变化,同时观察心、肝、肺、肾组织有无病理学改变及瘤细胞转移。进行血常规检测,采用免疫组织化学方法检测PCNA、Ki-67的表达。结果　As2O3、DDP及两药联用均明显抑制人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长,裸鼠的心、肝、肺和肾未见病理学改变和瘤转移,联合用药未增加造血系统的毒性,并能下调PCNA和Ki-67的表达。结论　亚砷酸可抑制人鼻咽癌CNE-2Z裸鼠移植瘤的生长,此作用可能与下调PCNA、Ki-67的表达相关。