六味地黄丸含药血清减低高糖诱导的肾小管上皮细胞的氧化损伤和凋亡的研究

目的观察六味地黄丸含药血清对高糖环境下培养的肾小管上皮细胞的保护作用,以及对高糖诱导的线粒体氧化损伤和凋亡的影响。方法制备不同剂量大鼠六味地黄丸含药血清,并培养高糖诱导的肾小管上皮细胞(HK-2),采用四甲基偶氮唑盐法和乳酸脱氢酶释放实验确定药物最适作用浓度。六味地黄丸含药血清处理高糖诱导的HK-2细胞24和48h后,2,7-二氯氢化荧光素二酯染色检测细胞内ROS含量,流式细胞仪测定线粒体膜电位变化,real-time PCR方法检测线粒体DNA的拷贝数,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,以及使用分光光度法检测细裂解液中Caspase-3和Caspase-9酶的活性。结果与正常对照组比较,高糖组在培养的24、48 h内HK-2细胞的ROS含量、线粒体膜电位、mt DNA拷贝数、细胞凋亡率、Caspase-3和Caspase-9酶活性显著上调(P0.01)。与高糖组比较,10%六味地黄丸含药血清均能逆转上述变化(P0.05),且抑制作用呈一定的时间依赖关系。结论六味地黄丸可能通过调控高糖环境下肾小管上皮细胞的线粒体ROS生成、改善线粒体膜电位和mt DNA拷贝数、抑制Caspase蛋白的级联激活反应,降低肾小管上皮细胞的氧化损伤和细胞凋亡,从而有利于延缓糖尿病肾病的间质纤维化的进展。     

去甲斑蝥素诱导人皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡作用

目的探讨去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)诱导人皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡作用及其相关分子机制。方法体外培养A431细胞,分为对照组和NCTD低、高剂量组(20,40μmol·L~(-1))。采用MTT法检测对细胞增殖的抑制作用;Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡;试剂盒检测细胞活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量、线粒体膜电位(MMP)变化、Caspase-3及Caspase-9酶活性变化;Western Blot法检测对细胞Bcl-2及Bax蛋白表达水平的影响。结果采用NTCD处理A431细胞48 h,与对照组相比,NCTD低、高剂量组均能抑制细胞增殖能力(P0.05),并明显诱导细胞凋亡(P0.05),提高细胞内的ROS水平(P0.05,P0.01)和MDA含量(P0.05,P0.01),降低细胞MMP(P0.05,P0.01)。同时,NTCD可以抑制Bcl-2蛋白表达及上调Bax蛋白表达,并能够明显升高细胞的Caspase-3及Caspase-9酶活性。结论 NCTD可能通过提高细胞内ROS水平的途径诱导A431细胞发生凋亡。     

丹酚酸B对三氧化二砷诱导HepaRG人肝细胞损伤的保护作用

目的:探讨丹酚酸B对三氧化二砷(As_2O_3)诱导的Hepa RG人肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法:采用5μmol·L~(-1)As_2O_3孵育24 h建立Hepa RG人肝细胞损伤模型。实验设置空白组、模型组(As_2O_35μmol·L~(-1)),单给药组(丹酚酸B 10μmol·L~(-1)),丹酚酸B高浓度组(丹酚酸B 10μmol·L~(-1)+As_2O_35μmol·L~(-1)),丹酚酸B中浓度组(丹酚酸B5μmol·L~(-1)+As_2O_35μmol·L~(-1)),丹酚酸B低浓度组(丹酚酸B 2. 5μmol·L~(-1)+As_2O_35μmol·L~(-1))。丹酚酸B预孵育2 h,弃去含药培养基,继续用5μmol·L~(-1)As_2O_3孵育24 h;实验终止,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡,Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染色流式细胞术定量检测细胞凋亡率,JC-1荧光染色观察线粒体膜电位,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),蛋白激酶B(Akt),磷酸化Akt(p-Akt)表达对丹酚酸B的肝脏保护作用机制。结果:As_2O_3浓度依赖性的降低Hepa RG细胞的存活率(P 0. 01);丹酚酸B单独作用2 h对正常细胞活力无影响;丹酚酸B(5,10μmol·L~(-1))预孵育2 h可显著增加由As_2O_3引起的细胞存活率下降(P 0. 01)。As_2O_3导致肝细胞凋亡比例显著上升(P 0. 01),丹酚酸B(10μmol·L~(-1))预孵育可降低细胞凋亡率(P 0. 01);As_2O_3孵育24 h引起线粒体膜电位下降,丹酚酸B可维持线粒体膜电位,提示丹酚酸B的抗凋亡作用与其抑制凋亡线粒体通路有关;与As_2O_3组比较,丹酚酸B预处理升高了Bcl-2/Bax水平(P 0. 01),增加了p-Akt/Akt水平(P 0. 01)。结论:丹酚酸B对As_2O_3诱导的肝细胞损伤具有保护作用,其作用机制与维持线粒体功能、抑制肝细胞凋亡有关。     

白藜芦醇对高糖诱导足细胞损伤的改善作用及机制探讨

[目的]观察白藜芦醇(RSV)对高糖诱导足细胞凋亡的影响及作用机制。[方法]采用体外高糖诱导作为足细胞损伤模型,细胞分为3组:对照组为5 mmol/L低糖培养液(LG);模型组为30 mmol/L高糖培养液(HG);RSV干预组:HG+5μmol/L RSV;HG+10μmol/L RSV,培养48 h后采用流式细胞术检测足细胞的凋亡情况;DHE探针观察细胞内活性氧自由基(ROS)生成;激光共聚焦检测线粒体膜电位及线粒体内ROS合成;Western blot检测线粒体凋亡途径相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase 9的表达情况。[结果]与HG组相比,RSV可呈剂量依赖性的抑制高糖诱导的足细胞凋亡;荧光探针结果显示,RSV干预后细胞内及线粒体ROS生成明显低于HG组;JC-1染色显示,与HG组相比,RSV干预可显著提高线粒体膜电位;Western blot结果显示,随RSV干预浓度的提高,caspase 3、caspase 9表达水平明显下调,差异具有统计学意义(P0.05)。[结论]RSV呈浓度依赖性的抑制高糖诱导的足细胞凋亡,其保护作用可能与抑制氧化应激,改善线粒体功能障碍相关。     

金丝桃苷对过氧化氢诱导的A549细胞氧化损伤的保护作用

目的:研究金丝桃苷对过氧化氢(H_2O_2)诱导的A549细胞氧化损伤的保护作用,并探讨其相关的作用机制。方法:体外培养A549细胞,采用H_2O_2(400μmol·L~(-1))作用24 h,建立A549细胞氧化损伤模型,分为空白组,模型组(400μmol·L~(-1)H_2O_2),阳性药(100μmol·L~(-1)N-乙酰半胱氨酸)组和不同浓度金丝桃苷(1,10,100μmol·L~(-1))组。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测活性氧(ROS),丙二醛(MDA)含量,乳酸脱氢酶(LDH),过氧化氢酶(CAT),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。通过罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位改变。采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测沉默信息调节因子3(Sirt3),异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)和锰超氧化物岐化酶(Mn SOD)蛋白表达。结果:与模型组比较,金丝桃苷显著提高细胞存活率(P0.01),降低LDH的外漏,ROS和MDA含量(P0.05,P0.01),明显增加CAT,SOD,GSH-Px活性(P0.05,P0.01)。金丝桃苷能够显著提高线粒体膜电位,上调Sirt3,IDH2和Mn SOD蛋白表达(P0.05,P0.01)。结论:金丝桃苷能够保护H_2O_2诱导的A549细胞氧化损伤,其作用可能与提高清除ROS能力,调控Sirt3线粒体途径相关。     

血根碱通过调控PI3K/Akt信号通路诱导胰腺癌细胞凋亡的机制

目的:探讨血根碱对胰腺癌细胞凋亡的影响及其信号通路调控机制。方法:不同浓度血根碱(2,4,6μmol·L~(-1))处理小鼠胰腺癌Panc02细胞不同时间(24,48,72 h)后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测血根碱对细胞生长抑制作用的影响;采用磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染色试剂盒通过流式细胞仪检测血根碱对Panc02细胞凋亡影响;采用花青染料(JC-1)探针试剂盒荧光染料分析检测线粒体膜电位的变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),总蛋白激酶B(Akt),磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),总磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)的表达情况。结果:与空白组比较,不同浓度的血根碱作用同一时间后,随着药物浓度的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P0.05),与空白组比较,同一浓度作用不同时间后,随着时间的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P0.05);与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组的细胞凋亡率无明显升高,与空白组比较,血根碱4,6μmol·L~(-1)组的细胞凋亡率均明显升高(P0.05);与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组时红绿荧光无变化,血根碱4,6μmol·L~(-1)组红色荧光减弱,绿色荧光增强,Panc02细胞线粒体膜电位降低;与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组处理的Bax,Bcl-2,p-PI3K,p-Akt,Akt和PI3K蛋白表达均无变化,血根碱6μmol·L~(-1)组Bax蛋白表达增高,Bcl-2及PI3K/Akt信号通路中关键蛋白p-PI3K,p-Akt表达降低(P0.05)。结论:血根碱通过抑制PI3K/Akt信号通路有效地诱导小鼠胰腺癌Panc02细胞经线粒体凋亡途径发生凋亡。     

香叶木素通过线粒体凋亡途径对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨香叶木素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法将MCF-7细胞分为对照组(0μmol·L^-1)和香叶木素5、10、20、30、40、50、60、70μmol·L^-1浓度组。采用CCK-8法及2,4二硝基苯肼法检测MCF-7细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)泄露量;采用罗丹明123(Rh123)荧光染色法、流式细胞术及荧光显微镜检测MCF-7细胞线粒体膜电位(MMP);DCFH-DA法检测细胞内活性氧(ROS)含量;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western Blot法检测p53、Bax、Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达。结果与对照组比较,香叶木素在5~70μmol·L^-1范围内能够浓度依赖性地抑制MCF-7的细胞活力及促进LDH的泄露(P<0.01,P<0.001),选取浓度10、30、50μmol·L^-1进行后续实验;香叶木素10、30、50μmol·L^-1浓度组能显著降低MCF-7细胞线粒体膜电位(P<0.05,P<0.01,P<0.001),促进细胞内ROS的积累(P<0.01,P<0.001),提高细胞凋亡率(P<0.001),显著上调p53(30、50μmol·L^-1)、Bax及Caspase 3蛋白的表达(P<0.001),下调Bcl-2蛋白的表达(P<0.01,P<0.001)。结论香叶木素可能通过ROS及p53介导的线粒体凋亡途径抑制MCF-7细胞的增殖及促进其凋亡。     

川芎嗪对t-BHP致PC12细胞损伤的保护及机制

目的:研究川芎嗪(TMP)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的PC12细胞损伤的保护作用及对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路的影响。方法:培养PC12细胞,孵育不同浓度的川芎嗪(10,25,50,100,200μmol·L~(-1)),12 h后采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)确定川芎嗪的保护浓度。随后将PC12细胞分为空白组,t-BHP组,TMP组。空白组加入培养基,t-BHP组加入t-BHP(200μmol·L~(-1)),TMP组加入TMP(25,50,100μmol·L~(-1))预处理12 h后加入t-BHP(200μmol·L~(-1))。共作用6 h后采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、活性氧(ROS)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),Akt,磷酸化Akt(p-Akt)及m TOR,p-mTOR的表达情况。结果:与空白组比较,t-BHP组细胞生存率降低(P0.01),与t-BHP组比较,25,50,100μmol·L~(-1)的川芎嗪促进细胞增殖(P0.05,P0.01),其中50μmol·L~(-1)组的细胞增殖率最高(P0.01);与空白组比较,t-BHP组LDH的释放量,ROS和MDA含量显著增加(P0.01),SOD和GSH-Px的活性显著降低(P0.01),与t-BHP组比较,TMP组LDH的释放量,ROS和MDA含量显著降低(P0.05,P0.01),SOD和GSH-Px的活性显著升高(P0.05,P0.01);Western blot表明与空白组比较,t-BHP组中p-Akt,p-mTOR蛋白表达水平明显下降(P0.01),Bcl-2/Bax值明显降低(P0.01),与t-BHP组比较,TMP(50μmol·L~(-1))组中p-Akt,p-mTOR蛋白表达水平明显上升(P0.05),Bcl-2/Bax值明显上升(P0.05)。另外LY294002(PI3K蛋白抑制剂)处理减弱了这些变化。结论:川芎嗪通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路保护t-BHP诱导的PC12细胞损伤。     

白藜芦醇对MGC803细胞凋亡因子Bad,p-Bad,Caspase-3的影响

目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对人胃癌细胞MGC803细胞凋亡因子及其磷酸化的影响,研究白藜芦醇抗胃癌的作用机制。方法:采用0,50,100,200μmol·L~(-1)Res处理MGC803细胞后,采用台盼蓝法测定MGC803细胞生长抑制率;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率;免疫组化法检测促凋亡蛋白(Bad),含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)蛋白表达;蛋白质印迹法(Western blot)检测Bad,磷酸化Bcl-x1/Bcl-2相关死亡启动子(p-Bad),Caspase-3蛋白的表达。结果:随着浓度增加Res抑制胃癌MGC803细胞生长作用明显增强(P0.01);Res(100μmol·L~(-1))能明显下调MGC803细胞中Bad,p-Bad蛋白表达,同时可上调Caspase-3蛋白表达。结论:Res可以诱导MGC803细胞凋亡,其凋亡与浓度、时间有一定的依赖性;Res诱导MGC803细胞凋亡可能与其下调Bad,p-Bad蛋白和上调Caspase-3蛋白表达有关。     

丹酚酸B对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响及其机制研究

观察丹参的主要成分丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)对高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响,探讨其防治糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)的可能机制。采用体外培养大鼠近端肾小管上皮NRK-52E细胞,随机分为对照组(NG)、高糖组(HG)、高糖+10μmol·L~(-1) Sal B组(Sal B),上述3组分别设6,12,24,48 h 4个时间点进行动态观察;高糖+Sal B不同浓度(1,5,10μmol·L~(-1))组、高糖+5.0μmol·L~(-1)吡格列酮对照组(pioglitazone,PIO)、高糖+10μmol·L~(-1) Sal B+5.0μmol·L~(-1) GW9662对照组(Sal B+GW9662)。采用Western blot法检测PPARγ,PTEN,α-SMA,E-cadherin的表达变化以及PI3K/Akt通路的变化;Real-time PCR法检测PPARγ,PTEN mRNA的表达水平。结果显示,与NG组相比,HG组PPARγ,PTEN mRNA和蛋白表达水平均逐渐降低,α-SMA,p-Akt~((Thr308))蛋白表达水平逐渐增高,E-cadherin蛋白表达水平逐渐降低,呈时间依赖性;与HG组相比,高糖+Sal B不同浓度组随Sal B剂量增加,PPARγ,PTEN mRNA和蛋白表达水平逐渐增高,α-SMA,p-Akt~((Thr308))蛋白表达水平逐渐降低,E-cadherin蛋白表达水平逐渐增高,呈剂量依赖性(P0.05),但1μmol·L~(-1)浓度的Sal B对PPARγ mRNA和蛋白、PTEN mRNA表达的影响没有显著性差异;与HG组相比,Sal B动态观察组PPARγ mRNA(除6 h)和蛋白(除6 h),PTEN mRNA(除6 h)和蛋白(除6,12 h)表达水平明显增高,α-SMA,p-Akt~((Thr308))(除6 h)蛋白表达水平明显降低,E-cadherin蛋白表达水平明显增高(P0.05);与HG组相比,Sal B和PIO显著增强PPARγ,PTEN mRNA和蛋白表达水平,增高E-cadherin蛋白表达水平,降低α-SMA,p-Akt~((Thr308))蛋白表达水平(P0.05),各用药组之间差异无统计学意义;而Sal B+GW9662对照组PPARγ和PTEN的mRNA和蛋白,E-cadherin、α-SMA和p-Akt~((Thr308))蛋白表达水平与高糖组比较没有统计学意义,Sal B的作用效应被PPARγ拮抗剂GW9662阻断。结果表明,丹酚酸B可抑制高糖诱导的NRK-52E细胞发生EMT,其机制可能为Sal B通过激活PPARγ的活性,上调PTEN表达,进而抑制PI3K/Akt信号通路的致纤维化效应有关。