基于12S序列的蛤蚧LAMP快速鉴定方法

蛤蚧为我国名贵动物中药材,为建立蛤蚧的LAMP可视化检测方法,实现其与混伪品的高效特异鉴别,该研究通过MEGA 6.0分析蛤蚧与其13种混伪品共65条12S rRNA序列,在线设计LAMP引物,并优化扩增条件,考察反应灵敏度,对蛤蚧及其混伪品进行鉴别验证。结果表明,基于12S rRNA序列的蛤蚧及其13种混伪品均可通过BLAST比对准确区分。蛤蚧12S rRNA序列较为保守,10批次30条序列在引物设计区仅含2条单倍型和3个变异位点,成功设计了6条LAMP特异引物。64℃反应1 h,80℃灭活5 min,即可完成蛤蚧的可视化检测,最低检测浓度为5μg·L-1,高于传统PCR 2个数量级。该方法特异性强、灵敏度高、检测方便、反应时间短,且闭管操作,避免了污染,可实现蛤蚧与混伪品的快速可视化鉴别。     

基于HRM的常见伞形科香辛料快速鉴定

目的:4种香辛料小茴香、孜然、葛缕子、莳萝子与其混伪品蛇床子、防风子因外形特征相似,易混淆使用,带来安全隐患。针对鉴别困难的问题,建立高分辨率熔解曲线(HRM)分析法,以实现简便、快速鉴别的目的。方法:收集这4种香辛料及常见混伪品蛇床子、防风子共23份样本,作为参照样本,提取总DNA,基于内转录间隔区2(ITS2)序列通过聚合酶链式反应(PCR)进一步确定物种,并应用HRM技术建立检测方法和熔解曲线模型。香辛料市场收集这4种香辛料共17份样本,作为市场样本,通过HRM技术鉴定物种是否与标签相符。结果:小茴香、孜然、葛缕子、莳萝子、蛇床子、防风子的熔解曲线均表现出良好差异性,能明显区分开;17份市场样本中,编号N1和N3样品熔解曲线与标签显示的莳萝子熔解曲线具有明显差异,进一步测序结果显示二者均为毒芹子。结论:HRM技术能实现小茴香等伞形科香辛料及其混伪品间的可视化鉴别,可作为DNA条形码技术的有力补充,在中药资源鉴定中应用前景广阔。     

Bar-HRM技术在人参和西洋参药材鉴定中的应用研究

目的：采用高分辨率熔解曲线技术（HRM）,应用ITS2序列对人参和西洋参药材进行快速鉴别,为规范市场药材管理提供一个新的分子检测手段。方法：收集人参、西洋参以及购买人参商品粉末药材,提取DNA,选择ITS2作为鉴别序列。在HRM-PCR条件下,建立人参和西洋参的标准高分辨熔解曲线、熔解曲线模型并确定Tm值;应用该方法检测市场随机收集的10份人参商品。结果：通过比较分析,人参和西洋参能够很好的区分开,10份人参商品粉末的高分辨熔解曲线、熔解曲线的峰形和Tm值均与人参相吻合,初步说明这10份人参商品都含有人参。进而将其PCR 产物测序,以验证该结果。结论：Bar-HRM方法可简单、快速、高通量化和可视化的实现人参商品粉末药材的快速检测。     

HRM技术在梅花鹿茸及其混伪品药材鉴定中的应用

目的采用高分辨率熔解曲线技术(HRM),基于SRY序列对梅花鹿茸及相关混伪品药材进行快速鉴别,为规范市场药材管理提供一个新的分子检测手段。方法购买梅花鹿茸及相关鹿茸药材进行DNA提取,选择SRY序列为鉴别序列,在退火温度为57℃,40个循环数的条件下,建立正品梅花鹿茸的熔解曲线模型,并对其DNA模板浓度、引物浓度进行筛选得到适宜范围。结果在DNA质量浓度为10～100 ng·μL~(-1)、引物浓度为10μmol·L~(-1)的条件下,正品梅花鹿茸药材的熔解曲线Tm值为(82.77±0. 03)℃。应用该方法检测市场随机收集的10份鹿茸产品,通过比较分析7份为正品梅花鹿茸,3份为驯鹿茸。进而将其PCR产物进行测序,加以验证。结论 HRM方法稳定、灵敏、重现性好,可以实现简单、快速、高通量、可视化的鹿茸药材鉴定。     

龟甲的特异性PCR及高分辨率熔解曲线技术鉴别方法研究

目的:建立高效、稳定的龟甲Testudinis Carapax et Plastrum DNA鉴别方法。方法:利用龟甲的特异性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)鉴别方法和高分辨率熔解曲线(HRM)鉴别方法,根据龟甲及其混伪品COI序列差异,寻找特异性单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点设计鉴别引物,并对PCR反应条件进行优化;并使用通用引物扩增COI区域,产物直接进行HRM分析。结果:当退火温度为60℃,循环次数为35,使用设计的龟甲特异性鉴别引物GJ-360.F/R进行PCR扩增,经扩增均获得约360 bp特异性鉴别条带,混伪品皆无条带;使用通用引物RonM-tl和Vl-tl进行PCR扩增,产物使用HRM分析,龟甲药材在模板DNA质量浓度为3.5～87.9 ng·μL~(-1)、引物浓度为0.2μmol·L~(-1)、镁离子浓度为2.0 mmol·L~(-1)的条件下,龟甲药材标准熔解曲线为双峰,其T_m均值分别为(83.15±0.76)、(87.53±0.69)℃。结论:特异性PCR和HRM均可作为一种快速准确鉴别龟甲正伪品的鉴定方法。     

基于DNA熔解曲线分析技术的前胡及其混伪品快速分子鉴定

目的：本研究旨在建立熔解曲线分析方法以实现简便快速直观地鉴别前胡及其混伪品。方法：采用硅胶吸附柱法抽提前胡及其混伪品的总基因组DNA,筛选合适引物,对引物浓度、模板浓度、退火温度和循环次数进行优化,建立前胡及混伪品样品的DNA熔解曲线鉴别方法,并对该方法进行验证。结果：核糖体DNA第二内部转录间隔区（ITS2）为适合的鉴别引物,在引物浓度0.20～0.40μmol/L,DNA模板浓度0.62～15.58 ng/μL,退火温度为53～54℃,循环数为35～45时可获得稳定、均一、特异性的PCR扩增。随后对比熔解曲线熔解温度（Tm值）,即可实现前胡药材真伪及掺伪品鉴别,对掺伪品的检测限可低至5%。结论：本方法灵敏度高、特异性好、检测速度快、直观性强,通过进行熔解曲线Tm值比对即可区分不同前胡样品,在该药材的混伪品快速检测方面具有独特的优势。     

基于COI 条形码序列的蛤蚧及其混伪品的DNA 分子鉴定

目的：利用COI 序列对蛤蚧药材及其常见混伪品进行DNA 条形码鉴定,为蛤蚧药材鉴定提供新的方法。方法：以COI 作为条形码序列,对蛤蚧实验样品进行DNA 提取,PCR 扩增和双向测序,用MEGA6.0 对所有11 个物种的103 份样品进行序列比对和邻接（NJ）树构建。结果：所有实验样品均可以获得COI 序列,蛤蚧COI 序列种内平均K2P 距离为0.005,种内最大K2P 距离为0.013,基于COI 序列构建的NJ 树中蛤蚧单独聚在一支,与其混伪品可以相互区分。结论：运用COI 条形码序列能够准确鉴定蛤蚧及其混伪品,为保障蛤蚧药材临床用药安全和市场监管提供新的方法。     

基于DNA条形码和HRM技术对金银花及山银花药材的快速鉴别

目的探讨Bar-HRM联用技术在金银花及山银花药材鉴别中的应用。方法根据psb A-trn H和rbc L1-724序列设计引物,对8种不同产地的金银花和山银花共24份药材总DNA进行条形码片段扩增和高分辨率溶解曲线分析。结果利用psb A-trn H序列设计引物,HRM曲线能够区分不同的金银花和山银花药材品种,Bar-HRM能在金银花类药材混合物中检测出低至5%的山银花样品。结论 Bar-HRM在金银花及山银花药材品种的分类、鉴别上具有可靠的分辨能力,适用于金银花及山银药材掺混的快速鉴定,能够实现一管式闭合分析。     

炮山甲及其混伪品的DNA微型条形码鉴定研究

目的:建立基于DNA微型条形码的炮山甲及其混伪品的分子鉴定技术。方法:采用改良的DNA提取方法提取中华穿山甲与其易混物种炮制甲片的DNA,利用线粒体COⅠ、16S rRNA和12S rRNA基因的标准及微型条形码引物进行PCR。双向测序后进行BLAST和序列位点分析,再计算种内和种间K2P遗传距离,并构建NJ系统树。结果:16S rRNA(L2513/H2714)和12S rRNA(L1085/H1259)引物对在所有甲片DNA中均能扩增成功,所获序列与Genbank序列的BLAST比对相似度大于98%。中华穿山甲与其易混物种的种间遗传距离远大于其种内遗传距离,而且各物种在NJ树中表现出单系性,其中16S rRNA微型条形码能将穿山甲属聚在一起。结论:基于16S rRNA的微型条形码技术可有效鉴别炮山甲及其混伪品。     

快速PCR技术鉴别中药材蛤蚧的方法研究

目的:建立简单快速鉴别蛤蚧的特异性PCR方法。方法:对比蛤蚧及其伪品细胞色素C氧化酶I亚基基因(CO I)序列,设计蛤蚧特异性PCR鉴别引物,优化特异性PCR条件,对蛤蚧及其7种常见混淆品进行扩增及荧光检测。结果:扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和荧光检测,所有蛤蚧药材均能扩增出约400 bp的特异性条带,加入SYBR Green I染料后,在365 nm下出现强烈绿色荧光,混伪品不具特异条带和绿色荧光,鉴别操作可在30 min内完成。结论:快速PCR结合荧光染料检测可快速鉴别蛤蚧及其常见伪品,为蛤蚧的快速鉴定提供了新的思路和方法。