甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因功能的初步研究

目的 利用λRed重组系统敲除甲型副伤寒沙门氏菌ompW基因构建突变株,并且制备相应的回复株,进而初步研究该基因的功能.方法 PCR扩增得到上、下游同源臂,与卡那霉素抗性基因片段共同构建打靶片段,将其浓缩后转化含λRed重组系统的甲型副伤寒沙门氏菌(50973株),经PCR鉴定后得到突变株;将重组酶表达质粒pACU184与ompW基因的调控区和编码区序列连接后电转入突变株中,双酶切鉴定得到相应的回复株;SDS-PAGE及Western blot鉴定野生株、突变株与回复株中OmpW蛋白的表达情况;生化鉴定野生株、突变株与回复株,并观察野生株与突变株生长曲线的差异;测定野生株、突变株与回复株活菌半数致死量( LD50),以此来观察ompW基因与细菌毒力的相关性.结果 在甲型副伤寒沙门氏菌50973株中成功敲除了ompW基因,并构建了相应回复株;野生株与回复株均可表达出OmpW蛋白,突变株没有出现该蛋白的表达;野生株、突变株与回复株生化鉴定结果均为甲型副伤寒沙门氏菌,且野生株和突变株生长无明显差异;三者LD50均不存在显著差异.结论 甲型副伤寒沙门氏菌的ompW基因与该菌致病毒力无相关性,但突变株的构建为后续研究该基因具体功能提供了基础.     

痢疾菌毒力表型与抗原表达的关系

目的 分析研究本室保存或构建的各类痢疾菌毒株、减毒突变株、菌苗株的毒力及其生物表的相互关系,探讨与致病有关的成分。为改进现有菌苗和构建新型菌菌提供参考依据。方法 采用刚果红结合试验、接触性溶血试验、ＨｅＬａ细胞入侵试验及豚鼠角结合膜炎试验。对不同痢疾菌的毒力表型进行检测。并对大质粒及其侵袭相关的基因（４．１ｋｂ）进行跗背景分析。用ＢＡ－ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ法,对痢疾菌和侵袭性大肠杆菌等进行毒力相关     

一种减毒肺炎链球菌溶血素突变体的构建与表达

目的 使用重叠PCR方法构建构建△A146Ply突变体,原核可溶性表达△A146Ply蛋白,并明确其毒力变化情况;分析肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,Ply)在不同血清型肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae,SPN)中的表达情况.方法 以SPN D39型基因组DNA为模板设计合成构建突变体ply基因所需引物;利用重叠PCR方法扩增合成△A146ply突变体.通过溶血实验分析其溶血活性,利用中和试验验证△A146Ply诱导产生的特异性抗体中和野生Ply毒素溶血能力,并利用Western印迹检测5株不同血清型肺炎链球菌流行菌株中Ply蛋白表达情况.结果 突变体基因测序结果显示,Ply146位密码子GCT 3个碱基被缺失,△A146ply突变体构建成功,并实现了△A146Ply的可溶性表达,得到纯度＞90 %的重组蛋白.△A146Ply蛋白浓度为100 000 ng/ml亦未表现出溶血活性.△A146Ply蛋白诱导产生的特异性抗体能够中和野生Ply毒素的溶血活性.Western印迹结果显示,△A146Ply诱导产生的多克隆抗体可与国内临床常见4株肺炎链球菌有交叉反应.结论 △A146Ply蛋白是一种安全的肺炎链球菌疫苗候选分子,可刺激机体产生具有中和作用的特异性抗体.     

猪链球菌2型98HAH33基因0267的功能研究

目的对猪链球菌2型菌株98HAH33基因0267进行功能研究。方法比较猪链球菌2型野生株98HAH33、突变株Δ0267及回复株CΔ0267在不同生长时期的生长速率,细菌黏附、全血杀伤及巨噬细胞吞噬试验比较对宿主的黏附和抗吞噬能力,仔猪试验比较在毒力方面的差异。结果野生株、突变株及回复株生长速率一致;野生株对宿主细胞A549、Hep2、HBMEC的黏附率分别是突变株的2.59、4.87和3.08倍,回复株对宿主细胞A549、Hep2、HBMEC的黏附率分别是突变株的2.65、4.65和2.86倍;野生株、突变株和回复株1~3 h在全血中的存活率分别是36.91%、28.12%和41.61%,58.44%、44.06%和58.26%,93.02%、70.08%和95.85%;小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬试验结果显示RAW264.7吞噬野生株、突变株及回复株的菌量分别为2767、5322、2567;仔猪竞争感染试验证明基因0267与猪链球菌2型98HAH33的毒力相关。结论猪链球菌2型98HAH33基因0267与细菌黏附和抗吞噬相关,是一个新毒力因子。     

甲型副伤寒沙门菌减毒株的构建与鉴定

目的构建甲型副伤寒沙门菌减毒株,测试其减毒效果,为制备减毒疫苗奠定基础。方法利用同源重组技术敲除甲型副伤寒沙门菌CMCC50093株的ync D基因和aro C基因,构建出ync D单基因敲除株和ync D-aro C双基因敲除菌株;通过测定和比较野生株、ync D单基因敲除株及ync D-aro C双基因敲除株的生长曲线,评估基因敲除对细菌生长的影响;以猪胃黏蛋白增毒小鼠为模型,测定野生株和双基因敲除株对模型动物的半数致死量LD50,评价双基因敲除株的减毒效果。结果成功构建并筛选到ync D单基因及ync D-aro C双基因敲除的甲型副伤寒沙门菌突变菌株。生长曲线测定显示ync D基因和aro C基因敲除后,敲除株生长明显缓慢。野生株和双基因敲除株针对模型小鼠的LD50分别为7.90×101和3.33×106CFU,结果表明ync D-aro C双敲除菌株的毒力较野生株下降约42 202倍,具有显著的减毒效果。结论本研究所构建的甲型副伤寒沙门菌ync D-aro C双基因敲除突变株毒力明显降低,安全性好,为研制甲型副伤寒减毒活疫苗奠定了坚实基础。     

快速检测副溶血弧菌及其毒力株方法的建立

目的利用实时PCR技术，建立检测副溶血弧菌及其毒力株的方法。方法根据副溶血弧菌的跨膜转录激活蛋白toxR基因序列设计引物和改良分子信标（ROX标记），建立检测所有副溶血弧菌菌株的方法。通过与文献报道的检测直接耐热溶血素（TDH）基因的实时PCR体系合并，建立了同时检测副溶血弧菌及其毒力株的双重实时PCR方法。结果通过对9个属的101株菌株进行试验，所有的52株副溶血弧菌均产生ROX阳性信号（toxR’），其余菌株均检测为阴性，其中46．2％（24／52）的副溶血弧菌产生HEX阳性信号（tdh^＋）。检测toxR基因的实时PCR体系DNA灵敏度为10～100fg／PCR体系，菌液灵敏度为59．2～592CFU/ml或2．96～29．6CFU／PCR体系。另外成功构建了双重实时PCR体系，能同时对副溶血弧菌的toxR和tdh基因进行检测。结论建立的双重实时PCR体系能同时检测副溶血弧菌及其毒力株，从而为食品的安全检疫提供有效手段。     

Tn-seq法筛选高毒力肺炎克雷伯菌新毒力基因

目的:建立转座子突变文库,筛选高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKp)的新毒力基因。 方法:构建转座子突变文库,血清处理,通过转座子测序(transposon sequencing, Tn-seq)比较分析血清处理前后各基因突变株在...     

肺炎链球菌ply基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究

目的 构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)溶血素基因(pneumolysin,ply)缺陷菌株,并对其毒力作初步研究,为进一步探索宿主对溶血素的防御应答奠定基础.方法 采用长臂同源多聚酶链反应(LFH-PCR)技术将ply基因替换为红霉素耐药基因(erm)后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出ply缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株,观察体外缺陷菌株生长情况,并在小鼠体内感染模型研究其毒力侵袭变化.结果 PCR结果显示ply基因完全被erm基因所替代,构建ply缺陷菌成功;单个菌落培养基生长情况表明ply基因缺陷并未对细菌的体外生长造成影响;但在小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株入血时间(6 h)明显晚于野生菌株(2 h),且各时间点的菌量均显著低于野生菌株,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01);小鼠腹膜感染模型显示野生菌株半数致死时间为3 d,而缺陷菌株半数致死时间为18d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代ply基因,方法简便快捷;ply的缺陷不影响细菌在体外的生长,但可显著降低细菌在宿主体内的毒力和侵袭.     

粪肠球菌类毒力基因sprE功能的动物实验研究

目的构建粪肠球菌丝氨酸蛋白酶基因(sprE)突变株,通过动物实验来研究sprE基因的功能。方法通过小鼠腹膜炎模型和兔心内膜炎模型来评价粪肠球菌sprE基因的突变株(sprE mutant)的毒力下降情况。结果突变株在小鼠腹膜炎模型中的半数致死量(LD50)提高了7倍,小鼠的存活率明显高于野生株感染组,引起的兔心内膜炎的病理改变也较野生株轻微。结论sprE基因在粪肠球菌致病中起着重要的作用,可能是粪肠球菌的毒力因子之一。     

眼源性蜡样芽孢杆菌溶血素BL及其体外生物活性检测

目的 对经API细菌鉴定条所证实的眼源性蜡样芽孢杆菌进行溶血素BL(HBL)基因鉴定并进行体外毒理性试验.方法 根据溶血素结合亚基B、2个溶血亚基L1、L2三种组分的基因核苷酸序列,设计合成3对特异性引物,通过体系和条件优化,建立PCR检测方法,并对5株临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌进行检测分析;随机选取其中1株菌,利用盐析法提取溶血素,并以不同浓度剂量作用于绵羊红细胞、Vero细胞和Hela细胞,监测其对细胞的毒性;通过腹腔注射观察HBL对小鼠的致死作用,评估其毒力的强弱.结果 5株临床分离菌中,共检出3个基因;蜡样芽孢杆菌溶血素BL蛋白具有较强溶血活性,其溶血活性呈明显的时间-剂量依赖性;BL溶血素对Vero细胞和Hela细胞的作用所致的形态变化虽有不同,但结果均导致细胞死亡,其内容物释出;对小鼠的致死率同样存在时间-剂量依赖性,且2.0 HU/ml浓度以上的BL溶血素可使小鼠48 h的致死率达100％.结论 HBL具有较强的溶血活性,对临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌BL基因进行检测,3个基因均表达,为该菌感染后病情发展迅速、预后较差的临床表现提供了理论依据,同时为该病的快速诊断和分子流行病学调查提供了新的方法.     

痢疾菌的毒力相关抗原及其表型的分析

目的：分析研究该室保存或构建的各类痢疾菌毒株、减毒突变株、菌苗株的毒力及其生物表型的相互关系，探讨与致病有关的成分，为改进现有菌苗和构建新型菌苗提供参考依据。方法：采用刚果红结合试验、接触性溶血试验、HeLa细胞入侵试验及豚鼠角结合膜炎试验，对不同痢疾菌的毒力表型进行检测，并对大质粒及其侵袭相关的基因（4.1kb）进行遗传背景分析。用BA-immunoblot法，对痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌等进行毒力相关抗原的分析。结果：有侵袭毒力的痢疾菌株均与刚果红染料结合、有接触性溶血活性，可侵入HeLa细胞，豚鼠角结合膜试验阳性，并都含有大质粒（120～140MD），与4.1kb侵袭探针杂交也均呈阳性反应；而无毒力的痢疾菌株上述生物表型均为阴性。有毒痢疾菌和侵袭性大肠杆菌均表达4种主要毒力相关抗原Ipa(A,B,C,D），而无毒株不表达这些抗原。痢疾菌的毒力不仅与Ipa有关，而且还与LPS抗原有关。结论：细菌的毒力与生物表型密切有关。并且Ipa与LPS这两类抗原均表达时细菌才有毒力。     

猪溶血素突变体的构建及活性评价

目的:构建无溶血活性的猪溶血素突变体,并对制备蛋白进行功能评价。方法:根据猪溶素的晶体结构,采用定点突变分别将其353位脯氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。重组表达的突变体蛋白采用镍柱亲和层析进行柱上复性后,评价纯化蛋白的溶血活性和免疫原性。结果:获得三种猪溶素突变体,SLY(P353A),SLY(P353L)和SLY(P353V)。溶血试证明SLY(P353V)无溶血活性,蛋白质免疫印迹和动物实验显示SLY(P353V)具有免疫原性。结论:猪溶素突变体SLY(P353V)无溶血活性,有免疫原性。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株侵袭性蛋白B缺失株的构建及生物学特性

目的:为了研制更加安全的鼠伤寒沙门菌弱毒株,本研究构建了鼠伤寒沙门菌SL1344Δsip B基因缺失突变株。方法:首先构建含缺失585 bp sipB基因的重组自杀性质粒PREΔsipB,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344的sip B缺失株。结果:PCR及测序结果表明SL1344ΔsipB构建成功。进一步生物学特性研究表明,缺失株SL1344ΔsipB保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12:i:1,2,且能够稳定遗传缺失585 bp的sipB基因,生长速度没有发生明显改变;但是,与亲本株SL1344相比,其毒力发生明显改变,缺失株SL1344ΔsipB口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为1.70×108CFU,毒力较亲本株SL1344降低至1.4%,免疫保护效力实验显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。在给小鼠免疫后第14天血清抗体IgG达到最高。结论:结果表明,SL1344ΔsipB基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌sipB基因与其致病力之间的关系提供了方法,并为研制安全有效的沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。     

军团菌逃逸巨噬细胞杀伤效应的分子机制研究

目的：通过体外构建军团菌感染的细胞模型，探索caspase 3激活与军团菌逃逸巨噬细胞杀伤作用的相互关系。 方法： 军团菌感染巨噬细胞后，用激光共聚焦显微镜和荧光阅读机测定胞内caspase 3的活性。并在caspase 3抑制剂应用前后对军团菌在发生凋亡的巨噬细胞内的生长复制状况进行检测。 结果： 激光共聚焦显微术以及caspase 3荧光底物的分析结果显示，嗜肺性军团菌毒力株感染巨噬细胞后能够大幅度激活caspase 3，而去除毒力的突变菌株不具备这种能力。军团菌在感染巨噬细胞后不同的时间内，军团菌在胞内不断地复制繁殖，而毒力去除的突变株却没有复制能力。当胞内caspase 3的活性被抑制后，军团菌毒力株的复制繁殖能力也有了显著性的抑制。 结论： 军团菌感染巨噬细胞后能够在极短的时间内激活 caspase 3,并通过诱导巨噬细胞的凋亡来逃逸巨噬细胞的杀菌作用和发挥致病效应。     

saeRS对金黄色葡萄球菌临床分离株的hla和lukS-PV表达的影响

目的 研究双组分信号调控系统saeRS对金黄色葡萄球菌临床分离株α溶血素基因(hla)和Panton-Valentine杀白细胞素基因(lukS/F-PV)表达的影响.方法 利用同源重组技术敲除saeRS基因,获得金黄色葡萄球菌saeRS基因敲除株,并构建saeRS回复突变株.应用SDS-PAGE检测金黄色葡萄球菌saeR/S野生株、敲除株及回复突变株分泌蛋白的变化,采用RT-PCR检测金黄色葡萄球菌saeR/S野生株、敲除株及回复突变株hla mRNA和lukS-PV mRNA.结果 成功构建了金黄色葡萄球菌saeRS基因敲除株SA75△saeRS.与野生株SA75相比,SA75△saeRS的生长无明显差异,但分泌蛋白种类和数量有明显减少且溶血能力明显减弱.saeRS基因回复突变株SA75△saeRS-C可以基本恢复敲除株的溶血能力.在3、6和10h3个时间点与野生株相比,SA75△saeRS的hla mRNA均有明显下降,分别是野生株的7.6％、0％和0.1％.lukS-PV mRNA也均有明显下降,分别是野生株lukS-PV表达量的37.2％、19.2％和20.4％.结论 saeRS基因是调节金黄色葡萄球菌分泌蛋白的关键因子.saeRS基因对金黄色葡萄球菌的hla和lukS-PV的表达具有正调控作用.     

赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建

目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株。方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA，扩增出外膜蛋白新基因ompL17，与打靶载体p2NIL重组，并插入氨苄抗生素抗性基因伽”使外膜蛋白新基因ompL17失活，构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A。电穿孔转化入钩体017株中构建突变株，通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化。结果PCR、Dot blot和酶切分析，证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体，并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株。结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除，并构建钩体017株突变株，为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础。     

LuxS基因缺失的变形链球菌突变株的构建及鉴定

目的 通过同源重组法构建LuxS基因缺失的变形链球菌(Streptococcus mutans)突变株.方法 运用基因同源重组方法将红霉素抗性基因(Eymr)连接到PCR扩增LuxS基因两端区域产生的2个基因片段之间,并共同插入到pUCl9载体的多克隆位点中,构建出带红霉素抗性标志的缺失突变载体pUCluxKO.将突变载体转化到含完整LuxS基因的突变受体变形链球菌标准株中,红霉素筛选出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株,并经PCR、生物荧光检测及DNA测序鉴定.结果 构建的突变载体经限制性内切核酸酶酶切分析显示,产生的条带与设计结果完全一致.PCR方法扩增突变株LuxS和Eymr基因显示,LuxS基因已被完整敲除掉,经生物荧光检测,突变株不能诱导哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BBl70的生物发光,说明不能产生信号分子AI-2(autoinducer-2).DNA测序证实筛选得到了LuxS基因缺失的变形链球菌突变株.连续传代培养后证实,变形链球菌LuxS基因突变株具有良好的稳定性.结论 成功构建出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株,为研究LuxS基因对变形链球菌致龋毒力的影响奠定了基础.     

MAPREC与MNVT评价Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒神经毒力的比较

目的用PCR扩增及限制性酶切分析突变技术(MAPREC)和猴体神经毒力试验(MNVT)评价同一批Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力的结果差异。方法采用MAPREC技术,检测Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力关键位点472位点突变率;采用MNVT病理切片分析,评价Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力。结果 MAPREC检测待测样品核酸472位点突变率均值为0.324%,低于高突变参考品的0.621%。MNVT切片结果分析表明,xtest–xref=0.169,小于C_1。对同一批样品,MAPREC与MNVT分析结果一致。结论在Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力检测方面,操作简单,试验周期短的MAPREC技术可作为金标准MNVT的有益补充。     

HPI毒力岛缺失的EAggEC17-2突变菌株的构建及其功能研究

目的 构建HPI毒力岛缺失的EAggEC17-2突变株，初步研究EAggEC菌株携带的耶尔森菌HPI毒力岛合成铁载体Ybt的功能。方法以EAggEC17-2为出发菌株，irp8基因部分序列作为同源重组的一侧序列，irp5基因序列作为同源重组的另一侧序列，中间插入有氯霉素（Can）抗性基因（cat基因）标记。通过接合转移和同源重组，构建了缺失约24kb的HPI毒力岛功能核心区区域EAggEC17-2的仝岛缺失株EA85。应用流式细胞技术（FACS）检测指示菌株WA-CS irp1：：KN（pC3G3．3N）荧光强度的变化情况，对EA85缺失株和出发菌株进行了合成Ybt的功能比较研究。结果成功构建了EAggEC17-2HPI全岛缺失株EA85。EAggEC17-2菌株具有表达Ybt的功能，而缺失株EA85丧失了合成Ybt的能力。结论EAggEC17-2HPI毒力岛的缺失，使Ybt的合成彻底阻断。EAggEC17-2具有的合成Ybt的功能是由其染色体携带的HPI毒力岛所决定的。     

副溶血性弧菌食物中毒分离株毒力基因检测及耐药性的调查

目的了解近年引起食物中毒的26株副溶性弧菌分离株的携带主要毒力基因的分子流行病学特征和耐药性状况,为制定相应的防控措施提供参考。方法根据副溶血性弧菌耐热直接溶血素（TDH）和耐热相关溶血素（TRH）基因序列设计PCR引物,建立PCR反应体系,检测26株从2005年11月至2008年8月发生的8起散发性食物中毒事件中分离的副溶血性弧菌菌株的毒力基因TDH和TRH,K—B法测定其药物敏感性。结果26株副溶血性弧菌有23株携带有TDH基因,阳性率为88％,所有菌株均未带有TRH基因;26株菌对亚胺培南、阿米卡星、头孢吡肟、头孢噻肟、庆大霉素、环丙沙星、哌拉西林、头孢哌酮、头孢他啶、头孢西丁等13种药物未见有耐药菌株;但对磺胺异恶唑、替卡西林、氨苄西林等有较高的耐药率,分别达76．9％、69．2％、80．8％。而对复方新诺明、四环素、头孢呋辛酯、头孢噻吩、头孢唑啉等也有耐药菌株的存在。结论带有TDH基因是近年引起食物中毒的副溶性弧菌分离株的主要分子流行病学特征,所分离菌株对多种常用药物敏感性高。研究结果为评价引起食物中毒的副溶性弧菌的分子流行病学特征和制定可行的防控措施提供了科学依据。