人牙周膜干细胞向神经细胞诱导分化的实验研究

目的:体外分离纯化人牙周膜干细胞,研究其体外向神经细胞分化的能力,为牙周组织工程提供可靠的种子细胞来源.方法:采用有限稀释法克隆分离纯化人牙周膜干细胞,将获得的第5代细胞用神经诱导体系连续培养,观察细胞形态变化;通过免疫组织化学染色技术检测诱导后神经胶质细胞标志物(GFAP)、神经元标志物(NSE)的表达.结果:人牙周膜细胞在体外诱导后出现了神经胶质样、神经元细胞分化的形态学改变,并有相应标志蛋白的表达,结论:人牙周膜干细胞在体外神经诱导体系作用下出现向神经细胞的分化.     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养鉴定及骨向诱导分化研究

目的：建立骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导以探讨大鼠MSCs的体外培养方法及向成骨细胞分化的条件。方法：采用全骨髓贴壁筛选培养法分离成年SD大鼠MSCs,经条件培养液诱导培养后,进行细胞形态学观察、绘制细胞生长曲线、免疫细胞化学检测及碱性磷酸酶活性、钙结节的形成测定。结果：SD大鼠MSCs在体外分离培养扩增形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论：SD大鼠MSCs体外分离培养体系能够成功建立,培养出的细胞能向成骨细胞分化,可以作为骨组织工程的种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外定向诱导成骨细胞的研究

目的 为建立一种简便有效的下颌骨缺损修复治疗的新方法——利用体外分离纯化人骨髓间充质干细胞(marrowstromal cells,MSCs),诱导向成骨细胞转化后再用于临床。方法 Ficoll密度梯度离心后贴壁培养法,分离纯化MSCs体外培养,经连续传代培养,加入10-7mol/L地塞米松,10-2mol/Lβ-甘油酸钠,500 ug/L的维生素C诱导液。结果 MSCs诱导后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、细胞糖原染色鉴定为成骨细胞。结论 hMSCs经定向诱导显示成骨细胞特性,为临床下颌骨缺损组织工程修复提供种子细胞。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞的多向分化潜能研究

目的　研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向诱导下的多向分化潜能。 方法　取6周龄GFP转基因小鼠1只,用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获得GFP转基因小鼠骨髓MSCs有 限细胞系(GFP-MSCs)。取第3代GFP-MSCs进行体外多向分化诱导:成骨诱导后进行碱性磷酸酶增殖活性检测及 茜素红钙盐染色;成脂肪诱导20 d后进行油红O染色鉴定;成神经诱导6 h后用免疫组织化学方法检测神经元烯 醇化酶(NSE)的表达。结果　GFP-MSCs经成骨诱导后ALP表达较对照组明显升高,20 d后茜素红染色可见有橘红 色钙盐沉积;经成脂诱导后油红O染色阳性;经成神经诱导后,细胞形态由梭形转变为星状细胞,NSE染色呈强阳 性表达。结论　GFP转基因小鼠骨髓MSCs在体外诱导下具有多向分化能力,对GFP稳定表达无影响,可以作为研 究MSCs多向分化潜能机制的一个有效示踪工具。     

大鼠骨髓MSCs体外分离培养及多向分化的实验研究

目的：建立骨髓MSCs体外分离培养体系，并进行多向分化诱导，以证实其多向分化潜能，为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法：用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果：用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs，细胞增殖活性强。经骨向诱导后，ALP和矿化结节染色阳性；免疫细胞化学染色提示神经向诱导神经元特异性标志蛋白NSE和NF200，成肌细胞标志蛋白Deamin和Connexin-43阳性表达。结论：采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系；并能够向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞分化。     

牙周膜干细胞向成骨细胞方向分化实验

目的:探讨人牙周膜干细胞(Periodontalligament stem cell,PDLSCs)向成骨细胞定向分化潜能,从细胞、分子和基因水平分析矿化诱导过程中细胞形态、功能变化。方法:将免疫磁珠分离的人PDLSCs矿化诱导,通过倒置显微镜观察诱导细胞形态变化,ELISA法检测诱导细胞碱性磷酸酶活性(ALPase)、RT-PCR、Western blot及免疫化学染色分析其成骨相关基因、蛋白表达变化,茜素红染色法检测其矿化结节形成情况来诱导细胞做对照。结果:矿化诱导14d,细胞形态呈成骨样短突起、多角形改变,诱导7d、14d ALPase活性显著增强。21d,诱导细胞高丰度表达骨桥素(OPN)、骨钙素(OCN)、牙骨质附着蛋白(CAP)及I型胶原(COLⅠ)mRNA,而对照组只有COLⅠmRNA弱表达。同时,Western blot及免疫化学染色均显示诱导细胞分泌骨涎蛋白(BSP)。21d,仅诱导组形成大量矿化结节。结论:人PDLSCs在矿化液诱导下可向成骨细胞分化,具有成骨细胞的形态、表型和功能特点,有望成为牙周及种植体周围骨缺损修复再生的理想的种子细胞。     

大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为成骨细胞的研究

目的：研究脂肪组织来源干细胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）在体外分离培养、诱导分化为成骨细胞的能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法：从SD大鼠腹股沟脂肪垫分离出脂肪组织，通过Ⅰ型胶原酶消化法获取原代ADSCs，适时传代。逐日倒置显微镜下观察细胞形态及增殖特征。第3代细胞用成骨诱导培养基向成骨细胞诱导分化，并进行碱性磷酸酶染色、VonKossa染色及免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞特性。结果：从大鼠脂肪组织中分离培养出ADSCs，体外形态类似成纤维细胞，增殖迅速。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠及1，25-（OH）2 VitD，诱导下，ADSCs表现出成骨细胞特性：ALP活性显著增高，Von Kossa染色出现钙化结节，OC、Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性。结论：ADSCs易于分离培养，体外扩增迅速，经矿化诱导后可分化为成骨细胞，可作为骨组织工程的种子细胞。     

人牙周膜干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外定向诱导人牙周膜干细胞分化为神经元样细胞,探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养,筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC）,用含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的预诱导培养液诱导培养24 h,然后换用含5 mmol/L β-巯基乙醇（β-ME）的诱导培养液诱导培养6 h,光镜下观察诱导细胞形态学的改变,免疫荧光、RT-PCR等方法检测鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。同时以未诱导细胞为对照。结果体外诱导培养6 h细胞即发生形态学改变,可看到典型的神经元样细胞;免疫荧光、RT-PCR检测诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE、NF,未诱导细胞无表达。结论人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为神经元样细胞,具有多向分化的潜能。     

MMP-2在猪骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞过程中的表达

目的:探讨基质金属蛋白酶2(MMP-2)在体外诱导猪骨髓间充质干细胞(猪MSCs)分化为血管内皮细胞过程中的表达特征.方法:抽取小型香猪的骨髓,经密度梯度离心分离纯化猪MSCs,体外培养扩增后,用含血管内皮生长因子(VEGF)等的介质诱导,观察细胞形态的变化,免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定血管内皮细胞第八因子(FⅧ)的表达,不同时间点Western印迹检测MMP-2蛋白的表达.结果:免疫组织化学染色显示,VEGF诱导3d后,猪MSCs表达较弱,7d后表达增强.流式细胞仪检测发现,VEGF诱导3d后表达的猪MSCs较少(3%),7d后表达的细胞数量明显增加(13%).诱导组MMP-2表达上调,1h达到高峰.结论:猪MSCs在体外经VEGF等因子诱导后,可迁移聚集并分化为血管内皮细胞,MMP-2参与这一过程.     

犬骨髓基质干细胞诱导为成骨细胞的实验研究

目的：研究骨髓基质干细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs)在体外培养，诱导后的成骨活性，探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：抽取成年犬骨髓，用梯度离心法获取单核细胞，经条件培养液体外诱导培养后，进行组织化学、免疫组化、原位杂交检测，并在透射电镜下观察其成骨活性。结果：第1代细胞Alkaline phosphatase(AKP)染色、Core-binding factor alpha subunit 1(Osf2/Cbfal)、Osteopotin(OPN),I型胶原的免疫细胞化学检测和I型胶原的原位杂交结果开始呈现阳性，第3代细胞Bone Sailoplain(BSP),Osteocalcin(OCN)免疫细胞化学染色开始呈现阳性，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：BMSCs不仅能大量扩增，且在一定条件下可向成骨细胞分化，是骨组织工程理想的种子细胞。     

牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响

目的：研究牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响,并初步探讨其机制。方法：从人牙髓中提取,培养牙髓干细胞,与皮肤成纤维细胞分组共培养,分为3组：对照组（单纯皮肤成纤维细胞培养）、条件培养基组（利用牙髓干细胞条件培养基培养成纤维细胞）、直接共培养组（采用Transwell共培养小室）。共培养后,进行 β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色,检测成纤维细胞的衰老情况;利用 CCK-8 法检测各组成纤维细胞的活性;流式细胞仪分析成纤维细胞的细胞周期变化;采用RT-PCR和 Western免疫印迹检测各组成纤维细胞衰老相关蛋白 p21、p53以及pRb 的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：与空白组相比,后2组的皮肤成纤维细胞表达β半乳糖苷酶降低、增殖能力增强、G1期细胞减少而S期和G2期增多, p53、p21 mRNA和蛋白表达水平降低而PRb表达升高。结论：牙髓干细胞及其条件培养基具有抗皮肤成纤维细胞衰老的作用,为牙髓干细胞在抗皮肤衰老方面的临床应用提供了依据。     

骨髓间充质干细胞与支架材料nHA/PA66复合培养的生物活性研究

目的：研究骨髓间充质干细胞与支架材料-纳米羟基磷灰石/聚酰胺66（nHA/PA66）复合培养时生物学特性。方法：体外培养兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,并分为A、B、C、D四组。A组为对照;B组和D组进行骨向诱导;同时,C组和D组细胞与nHA/PA66复合培养。应用MTT实验、碱性磷酸酶（ALP）染色和生物化学分析、扫描电镜,分别对各组细胞的增殖速度、ALP活性及细胞在支架上的黏附情况进行检测。结果：MTT结果显示,A组细胞增殖曲线与C组相似,而B组和D组相似;A组和C组细胞增殖略高于B组和D组。结果表明,骨向诱导可使细胞增殖轻微下降,而与支架材料复合培养对MSCs增殖无影响。ALP染色及ALP活性生化分析进一步表明,MSCs与支架材料复合培养对其骨向分化能力无影响。SEM观察则表明,C组细胞和D组细胞与支架材料均粘附良好。结论：nHA/PA66适于MSCs的黏附、增殖及骨向分化,是一种极具价值的骨组织工程支架材料。     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

Runt相关基因2修饰的骨髓间充质干细胞促进兔下颌骨牵张成骨的研究

目的探讨Runt相关基因2（Runx2）修饰的自体骨髓间充质干细胞（MSCs）促进兔下颌牵张成骨新骨形成的可行性。方法 将48只成年雄性新西兰大白兔随机分为3组：A组为Runx2重组质粒组,B组为不含Runx2重组质粒组,C组为生理盐水对照组。建立兔下颌牵张成骨模型;于牵张的第5天,A组兔牵张间隙内注射转染重组质粒adv-hRunx2-gfp的自体骨髓MSCs;B组注射转染adv-gfp质粒的自体骨髓MSCs;C组注射同体积生理盐水。在牵张结束后第8周处死所有动物,进行大体、影像学、组织学观察和三点弯曲测试。结果 CT平扫及组织学结果表明,A组牵张间隙内新骨形成和骨痂密度均明显高于B、C组;双能X线及三点弯曲测试表明,A组牵张间隙内新生骨组织密度、新生骨矿物质含量及最大载荷均高于B、C组（P<0.01）。结论 基于MSCs的Runx2体外基因治疗可有效地促进牵张成骨新骨形成,从而缩短固定期,为临床颅颌面骨缺损的重建提供一个极具价值的修复策略。     

骨髓间充质干细胞结合珊瑚人工骨移植修复牙周缺损的实验研究

目的评估自体骨髓间充质干细胞（MSCs）种植珊瑚人工骨（NC）后形成的复合物结合牙周引导组织再生术治疗狗牙周缺损的效果。方法（1）体外分离获得狗的MSCs，矿化培养液进行成骨诱导，检测细胞的成骨活性；（2）将NC和PLGA—NC复合膜分别吸附MSCs共培养，观察复合物的形态：（3）将MSCs与NC共培养10d后的复合物移植到狗的牙周实验性骨缺损处。8周后行组织学染色牙周再生检测。结果（1）诱导后的MSCs成骨活性明显，矿化结节茜素红染色和Ⅰ型胶原免疫组化染色阳性；（2）MSCs与NC和PLGA—NC复合膜均有较好的生物相容性；（3）MSCs—NC复合物移植后可修复牙周缺损。结论MSCs有望成为牙周前体细胞的体外来源，骨组织工程学方法修复牙周缺损是可行的。     

成骨诱导的犬骨髓间充质干细胞复合Bio-Oss构建组织工程化骨的体外研究

目的以骨髓间充质干细胞(MSCs)为种子细胞,以Bio-Oss小牛无机骨颗粒为支架材料,构建MSCs-Bio-Oss组织工程化骨。探讨犬MSCs成骨活性及与Bio-Oss复合构建组织工程化骨的可行性。方法杂种犬MSCs体外分离、培养及成骨诱导分化;取成骨诱导后的MSCs,以106个细胞/ml种植于Bio-Oss无机骨颗粒,轻度负压静置孵育培养。应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察其形态学变化,进行细胞表面因子CD44的免疫荧光标记、钙结节染色、ALP定性和定量检测,结果以SPSS12.0统计软件包进行统计学分析。结果MSCs形态较均一,排列紧密,呈纺锤形,CD44表面抗原阳性;诱导分化后,表现出明显的成骨细胞活性,钙结节的茜素红S染色阳性,ALP的Gomori法染色阳性,ALP活性定量检测实验组在诱导分化3、7、14d时,ALP含量分别为(3.307±0.217)U/g、(5.929±0.781)U/g和(9.739±0.547)U/g,与对照组的(0.442±0.087)U/g、(0.581±0.027)U/g和(0.768±0.126)U/g比较有显著差异(P<0.01);MSCs在Bio-Oss表面贴附紧密,生长良好,构建形成组织工程化骨。结论以成骨诱导的犬MSCs作为种子细胞,复合支架材料Bio-Oss构建组织工程化骨是可行的。     

MSCs移植促进输送盘骨牵张术修复颅骨缺损的实验研究

目的 :研究自体骨髓间充质干细胞 (MSCs)对采用输送盘骨牵张术修复山羊颅骨缺损效果的影响。方法 :将成年雄性山羊 8只 ,随机分为A、B两组 ,每组 4只。在动物颅顶区制造全层颅骨缺损和输送盘 ,用自行研制的牵张器行输送盘骨牵张术修复颅骨缺损。牵张结束后 ,在A组动物牵张区注入体外培养的自体骨髓间充质干细胞 ;B组同期注入生理盐水作对照。在牵张结束后的第 4周处死A、B两组动物 ,取牵张区新生组织标本行组织学和扫描电镜分析。结果 :移植MSCs的A组动物牵张区新骨生成速度和钙化程度显著高于B组动物。结论 :局部移植MSCs可能有促进牵张成骨的作用。     

小鼠胚胎干细胞向成牙本质样细胞的诱导分化

目的探讨胚胎干细胞(ES细胞)向成牙本质样细胞诱导分化的方法。方法首先通过悬浮培养的方式,将ES细胞诱导分化形成拟胚体,然后将拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞通过Transwell培养系统共培养,研究拟胚体细胞向成牙本质样细胞的分化情况。结果RT-PCR结果显示,拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞共培养10d后,可检测到成牙本质细胞的特征性分子——牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达;共培养15d后,表达有所增强。而单独培养的拟胚体细胞,则始终未检测到DSPP的表达。结论通过与牙髓成纤维细胞共培养,可以促进胚胎干细胞向成牙本质样细胞分化。     

共培养诱导人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)向牙周膜细胞(hPDLs)分化的体外实验研究

目的:研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)向人牙周膜细胞(hPDLs)分化的可能性。方法:原代培养获得hUCMSCs和hPDLs;应用Transwell小室将两种细胞进行非接触式共培养;使用流式细胞仪检测共培养过程中hUCMSCs干细胞标记物CD146、SOX2、SSEA和Stro-1的变化情况;通过免疫荧光技术和Western Blot技术检测共培养过程中波形蛋白(Vimentin)在hUCMSCs中的变化情况。结果:共培养过程中hUCMSCs中的CD146、SOX2、SSEA和Stro-1持续降低;而Vimentin持续增高。结论:通过与hPDLs共培养,可以成功地将hUCMSCs诱导分化成为牙周膜样细胞,进一步证明了hUCMSCs可用于牙周损伤修复的可能。     

骨髓间充质干细胞成肌诱导分化的实验研究

目的:观察骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-Aza)诱导的成肌向分化潜能。方法:分离纯化4周龄SD大鼠的MSCs,以5-Aza诱导,通过细胞形态、免疫组织化学染色观察诱导后不同时相点的细胞。结果:经5-Aza诱导后14d,细胞表达结蛋白(desmin)。细胞形态和排列方式发生明显变化,可见有肌管样细胞出现。结论:MSCs经5-Aza诱导后可以向骨骼肌成肌细胞定向分化。