一种简单快速的cDNA文库构建方法

目的:建立一种以LD-PCR(long-distance-PCR)为基础的cDNA文库的快速构建方法.方法:以鲨鱼再生肝组织为材料获得总RNA,用偶联有Oligo(dT)的磁珠纯化mRNA后,利用含BamH Ⅰ酶切位点的Oligo(dT)16引物在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第一链,进而利用末端转移酶在合成的cDNA第一链的3′末端引入poly-dC尾;以含BamH Ⅰ酶切位点的Oligo(dT)16和含Hind Ⅲ酶切位点的Oligo(dG)10为引物,利用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同双酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库,对文库的容量、重组率以及多样性进行分析.结果:通过本方法构建的cDNA文库容量约为5.84×105个/μg ds-cDNA,重组率为96.7%;对随机提取的30个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得25个不同的cDNA序列,且未见重复序列.结论:本法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的功能基因分析.     

人胚胎干细胞培养及其cDNA文库的构建

目的 构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础.方法 培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切消化产生粘端.用Sepharose CL2B柱分离纯化及除去小分子cDNA片段,与Uni-ZAP XR噬菌体连接,体外转化XL1-blue MRF菌,建成cDNA文库并计算重组效率.对cDNA文库进行扩增,测定扩增文库的滴度.阳性重组子用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定插入片段的大小.结果 构建成含1.2×106重组子的人胚胎干细胞cDNA文库,重组子插入外源DNA片段长度不小于1000 kb.结论 已成功构建人胚胎干细胞cDNA文库,适合用于筛选目的基因克隆.     

人原发型肝癌组织cDNA文库的构建

目的 快速构建混合人原发型肝癌组织cDNA文库.方法 从混合人原发型肝癌组织分离总RNA,以含有sfiIB酶切位点的oligo(dT)引物合成第1链cDNA,以含sfiIA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经sfiI(IA & IB)酶切,以CHROMA SPIN-400柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体cDNA文库.结果 经检测共获得3.96×106个重组子,重组率＞93%,文库经扩增后滴度为3.92×109 pfu/ml.结论 用SMART方法构建的原发型肝癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选获取原发型肝癌特异抗原基因或其他相关基因奠定了基础.     

人胃癌混合组织cDNA文库的快速构建和鉴定

目的 :构建人胃癌混合组织cDNA文库 ,筛选克隆胃癌相关基因。方法 :以纯化的 poly(A) + RNA为模板 ,含NotⅠ切点的Oligo (dT) 15为引物 ,利用改良的cDNA快速合成方法 ,反转录合成cDNA第一、二链 ,连接连接子 ,经层析柱纯化去除小片段和多余连接子后 ,重组于噬菌体载体 ,行体外包装后以大肠杆菌Y10 90行滴度测试及扩增后 ,建成cDNA文库。结果 :构建的cDNA文库 ,含 3 2× 10 6重组子 ,重组率为 96 %。扩增后文库的滴度达1 2× 10 12 pfu/L。 结论 :成功地构建了人胃癌混合组织cDNA文库 ,为进一步筛选克隆胃癌的相关癌基因或抑癌基因奠定了基础     

人胃癌组织定向cDNA文库的构建

目的快速构建成人胃癌组织cDNA文库。方法从人胃癌组织分离总RNA,以含有轴IB酶切位点的oligo（dT）引物合成第1链cDNA,以含蛳IA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经sGI（IA＆IB）酶切,以CHROMA SPIN＋TE-1000柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体λ文库。结果经检测共获得2．73×10^6个重组子,重组率约为94％,插入片段大小平均为1．2kb。结论用SMART方法构建的胃癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选胃癌相关基因奠定了基础。     

HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 :构建人骨髓瘤细胞株HMy2cDNA表达文库 .方法 :提取HMy2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5′端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的噬菌体λgt11连接 ,体外包装后建成cDNA文库 .取出一部分倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小 .结果 :构建成含 1.5× 10 6重组子的人骨髓瘤细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.4kb .结论 :所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆 .     

人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库的构建

目的为进一步获得人卵巢癌相关抗原基因,构建人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库.方法从人上皮性卵巢癌组织提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、XhoⅠ酶切、过柱分级分离,除去<400 bp片段,收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人卵巢癌组织cDNA表达文库.结果经检测该原始文库滴度为5.5×106 pfu/ml,扩增后文库滴度为3.0×1011 pfu/ml,重组率96%.插入片段平均大小1.0 kb以上.结论所构建的人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库质量合格,为以后筛选获取卵巢癌特异性相关抗原基因或其它相关基因奠定了基础.