胃癌细胞系MKN中HLA-Ⅰ类分子表达降低的机制研究

目的：探讨胃癌细胞系MKN中HLA—Ⅰ类抗原表达水平异常的分子机制。方法：以胃癌细胞系BGC823、MGC803和SGC7901为对照，利用流式细胞仪检测细胞表面HLA—Ⅰ类复合物的表达情况，Western blot检测HLA—Ⅰ类分子重链及轻链表达情况，半定量RT—PCR检测HLA—Ⅰ类分子重链、轻链和抗原加工分子mRNA水平的表达情况，并利用HLA基因区域的微卫星序列检测MKN细胞HLA基因在DNA水平的完整性。结果：胃癌细胞系MKN表面HLA—Ⅰ类复合物表达降低，重链A及B／C位点蛋白无表达而轻链表达无异常。在mRNA水平，胃癌细胞系MKN存在重链A、B、C各位点和抗原加工分子TAP1、LMP2、Tapasin、PA28β的表达缺失。微卫星DNA扩增结果初步显示，MKN细胞无HLA基因区域DNA的大片段丢失。结论：胃癌细胞系MKN HLA—Ⅰ类分子复合物表达降低可能是由HLA-Ⅰ类分子重链及其加工分子在转录水平改变而引起的。     

可溶性单链MHC-肽四聚体的构建研究

目的:构建检测抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的单链MHC-肽四聚体.方法:通过在MHC重链基因中引入生物素化位点.并在轻链和重链基因中引入同一限制性酶切位点连接MHC轻链和重链构建可生物素化的单链MHC分子.结果:重组子以包涵体形式表达得到单链MHC分子.重折叠、生物素化、荧光标记后得到活性单链MHC-肽四聚体.结论:单链MHC分子操作简便,提高了四聚体构建效率.     

可溶性HLA-G1-肽复合物的体外折叠和鉴定

目的 合成可溶性HLA-G1-肽复合物。方法 利用原核高效表达的可溶性HLA-G1重链和轻链（β2m）,在人工合成的HLA-G1限制性九肽（KGPPAALTL）存在的条件下,通过稀释复性折叠成可溶性HLA-G1-肽复合物。利用特异性抗体（W6／32及兔抗人β2m抗体）进行免疫印迹及酶联免疫吸附试验,检测稀释复性的折叠产物。结果 折叠复合物含有35％可溶性HLA-G1-肽复合物、5％可溶性HLA-G1重链聚合体及60％复性的β2m3种成分。结论 通过原核表达、体外折叠能够获得大量可溶性HLA-G1-肽复合物。     

TNFR1BP/IgGFc融合蛋白载体的构建、表达及其生物学活性研究

目的 构建肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)封闭肽与IgGFc融合蛋白的真核表达载体,检测其表达和生物学活性.方法 将合成的TNFR1封闭肽(TNFR1BP)基因片段插入质粒pIG/3C,构建真核表达载体pIG/3C-TNFR1BP;脂质体法将重组载体转染COS-7细胞;ELISA和Western blot法检测转染细胞的培养上清中TNFR1BP/IgGFc融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验、细胞毒抑制实验检测融合蛋白对TNFR1的封闭作用.结果 经PCR和核苷酸序列测定证实TNFR1BP基因正确插入质粒pIG/3C.ELISA检测证实,在转染细胞培养上清中有融合蛋白的表达;间接免疫荧光抑制实验和细胞毒抑制实验证实融合蛋白能结合L929细胞表面的TNFR1,并能抑制分泌型肿瘤坏死因子α(sTNF-α)介导的细胞毒作用.结论 成功构建并实现TNFR1BP/IgGFc融合蛋白真核表达;体外实验证实此融合蛋白可通过与细胞表面TNFR1结合,从而拮抗sTNF-α介导的生物学效应.     

中国恒河猴Mamu-B*1703/EGFP在K562和B16细胞中的表达及分布

目的分析恒河猴主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子重链的亚细胞分布,建立适于体外研究恒河猴MHCⅠ类分子表达和抗原呈递功能的细胞系。方法将含Mamu-B*1703重链基因真核表达载体pEGFP-N1分别转染K562和B16细胞,细胞收集后以W6/32单克隆抗体或抗Mamu-B*1703抗血清及PE标记二抗染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞术分析Mamu-B*1703复合体在细胞内和细胞表面的表达。结果在K562和B16细胞的细胞质内均可观察到与Mamu-B*1703重链基因融合表达的绿色荧光蛋白激发后的绿色荧光,即2种细胞均可表达外源Mamu-B*1703重链分子;但通过藻红蛋白标记的抗MHCⅠ类分子复合体抗体染色显示,Mamu-B*1703复合体仅表达于K562细胞表面,而不表达于B16细胞表面。结论Mamu-B*1703重链可与人K562细胞而不能与小鼠B16细胞内的βm轻链结合组装成复合体,表达于细胞表面,提示研究恒河猴的MHCⅠ分子表达应利用人类的细胞株。     

自然杀伤细胞在妊娠子宫中的作用

自然杀伤(natural killer，NK)细胞起源于多能造血干细胞，是人体免疫系统的重要组成部分。大量的活化和抑制性受体，包括一些新发现的选择性识别主要组织相容性复合物-Ⅰ类分子的受体，严格调控着NK细胞的细胞毒作用及其它功能。由于无需初次免疫应答的激活就可自发地产生细胞毒作用，现普遍认为NK细胞在免疫     

肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体

0引言细胞内抗体（intrabody）技术是近几年来完善的一种新的基因治疗策略[1]。细胞内抗体具有结合、灭活肿瘤细胞癌蛋白、诱导细胞凋亡的作用[2]。未见有关在肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体的研究报道。本研究在肝癌细胞内表达抗肝癌单链抗体，观察单链抗体在肝癌细胞内表达对肝癌细胞的影响。1方法抗人肝癌单链抗体基因由本室制备。该基因长700加，由重链可变区基因和轻链可变区基因I－inker（Gly4Ser）。连结组成，重链5’端含有EcoRI酶切位点和A”l’G启始码，删除了轻链可变区分端57个碱基，轻链3’端含有一个Sail酶切位点。将含有…     

AR-3可增强内含肽介导的全长凝血因子Ⅷ的基因表达

目的 观察具有促进凝血因子Ⅷ(fⅧ)重链分泌的酸性区3(AR-3)对蛋白质剪接作用连接的全长fⅧ分泌的影响.方法 以双载体转融合内含肽的全长fⅧ重链和轻链基因,并将AR-3融合于重链基因,瞬时共转培养的293细胞,用Western印迹观察转基因细胞内的蛋白质剪接;用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Coatest法定量分析分泌至培养上清中的剪接的全长fⅧ蛋白和由其产生的生物活性.结果 共转基因细胞内可见明显的剪接fⅧ蛋白形成,培养上清中剪接的fⅧ蛋白量和活性分别为(1 12±18)ng/ml和(0.76±0.13)U/ml,明显高于共转未融合AR-3的重链与轻链基因细胞[(64±11)ng/ml和(0.37±0.05)U/ml],而且,混合培养的分别单独转AR-3融合重链和轻链基因细胞的上清中亦检测到剪接的fⅧ蛋白及活性[(27±7)ng/ml和(0.16±0.05)U/ml].结论 AR-3可通过改善内含肽剪接的全长fⅧ的分泌增强转fⅧ基因的效果.     

可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化

目的 探讨可溶性HLA-G-肽复合物的体外制备与纯化.方法 原核高效表达的HLA-G重链及轻链(β2m)在抗原肽(人工合成九肽NH2-KGPPAALTL-COOH)的存在下,通过稀释复性折叠成HLA-G-肽复合物,采用凝胶过滤层析对折叠复合物进行纯化.利用特异性抗体(mAb W6/32和兔抗人β2m抗体)进行ELISA和Western blot对纯化产物进行鉴定.结果 折叠复合物中,主要含有HLA-G重链聚合体、HLA-G-肽复合物及β2m 3种成分,纯化后主要为HLA-G-肽复合物.结论 成功地获得纯度较高的可溶性HLA-G-肽复合物单体,为进一步研究HLA-G的生物学功能奠定了基础.     

可溶性HLA-A*2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化

目的 研究可溶性HLA—A＊2402-pBRLF1复合物的体外折叠与四聚体化。方法 将原核高效表达的可溶性HLA—A＊2402-BSP融合蛋白及β2微球蛋白（β2m）与HLA—A＊2402限制性抗原肽Epstein—Barr病毒（EBV）即刻早期BRLF1蛋白中的九肽NH2-DYNFVKQLF-COOH进行稀释复性折叠，形成HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体，并在BirA酶的作用下进行生物素化，使生物素结合到HLA—A＊2402-pBRLF1复合物中H链c端的BSP序列上形成生物素化的可溶性HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体。利用特异单抗（W6／32和兔抗人β2m抗体）及链霉亲合素进行ELISA和Western blot，检测稀释复性和生物素化的折叠产物。然后用此生物素化的单体分子进一步构建成HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体来检测人工抗原提呈细胞（aAPCs）诱导的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）。结果折叠复合物中，主要含有HLA-A＊2402-pBRLF1复合物单体及β2m两种成分，其中HLA—A＊2402-pBRLF1复合物单体可生物素化和四聚体化。应用HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体对特异性CTL检测结果说明体外成功地构建了HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体。结论HLA—A＊2402-pBRLF1四聚体构建成功。为特异性CTL的检测提供了有力的工具。     

HLA-G14bp基因多态性及可溶性HLA-G表达水平与儿童特发性哮喘的关系

目的检测儿童哮喘患者人白细胞抗原(HLA)-G14bp插入/缺失多态性及血浆可溶性白细胞抗原G(sHLA-G)水平,探讨其与儿童特发性哮喘发病的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)及电泳技术对儿童特发性哮喘患者(85例)和健康体检儿童(98例)进行了HLA-G 14bp插入/缺失多态性基因的检测,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测儿童特发性哮喘患者(60例)和健康体检儿童(70例)血浆中可溶性HLA-G(sHLA-G)水平。结果发现HLA-G 14 bp插入/缺失多态性基因及基因型频率分布在儿童特发性哮喘患者和正常对照儿童中均无统计学意义(P均>0.05),儿童特发性哮喘患者中血浆sHLA-G水平(中位数,177.97U/m l)明显高于对照组(中位数,34.92U/m l,P<0.001),哮喘患者的sHLA-G的检测在ROC曲线下面积为0.975,哮喘诊断临界点为158.6U/m l。分析患者及正常对照儿童血浆sHLA-G水平在HLA-G 14bp插入/缺失多态性基因型频率分布中的差异,发现均无统计学意义(P均>0.05),患者血浆sHLA-G水平与过敏原的种类、总IgE及特异性IgE(sIgE)的含量也无相关性(P均>0.05)。结论 HLA-G 14 bp插入/缺失多态性基因和儿童特发性哮喘的易感性无关,而sHLA-G可能作为儿童特发性哮喘的一个生物标志物,在儿童哮喘的发病机制中发挥重要的作用。     

高原地区子痫前期患者胎盘及血清HLA-G表达水平及临床意义

目的 探讨青海高原地区子痫前期患者胎盘及血清中人类白细胞抗原G(HLA-G)表达水平及临床意义.方法 收集2010年9月至2011年3月在青海大学附属医院产科分娩的30名子痫前期患者和30名正常妊娠妇女的胎盘组织和血清样品,应用实时定量RT-PCR技术研究HLA-G mRNA在正常妊娠者和子痫前期患者胎盘中的表达差异,并应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中可溶性HLA-G的表达.结果 (1)青海高原地区子痫前期患者胎盘组织中HLA-GmRNA表达水平为1.42±4.92,明显低于正常妊娠组(9.00±9.94),差异有统计学意义(P＜0.01);(2)子痫前期血清可溶性人类白细胞抗原G( soluble HLA-G,sHLA-G)浓度为688.34±181.988 ng/L,明显低于正常妊娠组织(1030.2±238.568ng/L),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 青海高原地区子痫前期胎盘组织HLA-GmRNA表达水平及血清sHLA-G浓度均明显降低,可能与子痫前期的发生有关.     

人类白细胞抗原G及其受体在肾移植术后监测的临床意义

目的 探讨人类白细胞抗原G(HLA-G)作为判断肾移植预后的生物标记物的价值并分析HLA-G受体的表达与HLA-G作用机制的相关性.方法 选取2006年2月至2008年6月解放军第三○九医院全军器官移植中心施行初次肾移植受者215例,根据术后临床状况分为肾功稳定组(n=173)和急性排斥组(n=42),采集外周血用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测可溶性人类白细胞抗原G5(sHLA-G5)表达含量,流式细胞术分析HLA-G受体免疫球蛋白样受体2(ILT-2)在T、B淋巴细胞的表达及杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)2DL4在自然杀伤(NK)细胞的表达.采用受试者工作特征(ROC)曲线运算sHLA-G5阈值,预测肾移植术后排斥反应.运用回归分析验证sHLA-G5与急性排斥反应发生的相关性.结果 sHLA-G5水平预测急性排斥反应组的最适域值为139.0μg/L,其敏感度为63.6%,特异度为82.1%,曲线下面积(AUC)为0.780.二元Logistic回归分析显示sHLA-G5是肾移植术后急性排斥反应发生的独立影响因素(P=0.019,OR=0.039,95%可信区间为2.091～5.661).急性排斥组CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞表面的ILT-2表达均低于肾功稳定组(21%±7%比52%±17%,23%±6%比39%±16%,21%±7%比39%±16%,均P＜0.05).急性排斥组NK细胞表面的KIR2DLA表达也低于肾功稳定组(31%±10%比57%±21%,P＜0.05).结论 sHLA-G5表达水平对预测肾移植术后排斥反应具有较高的敏感度和特异度,HLA-G诱导免疫耐受的机制可能与淋巴细胞表面ILT-2、KIR2DLA的高表达密切相关.     

乙型肝炎病毒诱导HLA-G的表达及其临床意义

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）诱导人类白细胞抗原-G（HLA-G）的表达及其临床意义。方法：采用实时RT-PCR的方法检测HBV感染患者外周血中HBV的载量,并采用ELISA法检测HBV感染患者外周血可溶性HLA-G（sHLA-G）的含量。HBV不同载量及多个时间点作用单核细胞（THP-1）,采用RT-PCR和Westernblot法检测HLA-G的诱导表达情况。结果：HBV感染患者外周血sHLA-G表达水平显著高于正常献血员（P＜0.01）。体外研究发现,HBV经1d即可诱导THP-1细胞HLA-GmRNA转录增强以及诱导HLA-G蛋白表达,且在第4天达到最大值。结论：HBV增强单核细胞HLA-G基因转录,诱导单核细胞表达HLA-G蛋白,从而使HLA-G参与调节HBV病毒免疫逃逸。     

人类白细胞抗原G在肾移植受者外周血的表达探讨

目的 探讨人类白细胞抗原(HLA)G的膜型HLA-G(mHLA-G)、胞内HLA-G(iHLA-G)和可溶型HLA-G(sHLA-G)在肾移植受者外周血的表达及其与术后临床相关性.方法 研究对象为2000年2月至2006年6月解放军第三零九医院全军器官移植中心行肾移植的175例受者,根据4周内是否发生排斥反应分为急性排斥反应组(36例)、功能稳定组(139例),30例健康供者作为对照组.应用流式细胞术检测外周血mHLA-GI、iHLA-G1的表达,酶联免疫吸附法检测血浆sHLA-G5的含量.结果 T淋巴细胞CD~+ mHLA-G1~+、CD8~+ mHLA-G1~+、CD4~+ iHLA-G1~+、CD8~+ iHLA-G1~+平均表达率在对照组分别为0.43%±0.19%、1.23%±0.41%、27%±13%、36%±14%,急性排斥反应组分别为:0.57%±0.34%、1.31%±0.56%、26%±8%、37%±17%,功能稳定组分别为0.61%±0.43%、1.39%±0.47%、26%±9%、37%±17%,3组间比较差异均无统计学意义(均P>0.05).外周血浆sHLA-G5表达在对照组为(25±14)ng/ml;急性排斥组术前为(24±15)ng/ml,术后为(34±21)ng/ml;功能稳定组术前为(25±11)ng/ml,术后为(56±32)ng/ml;急性排斥组和功能稳定组术前与健康组比较,差异无统计学意义(P>0.05),术后功能稳定组明显高于急性排斥组(P<0.05).结论 肾移植受者外周血存在一群比率较低的HLA-G~+ T淋巴细胞,mHLA-G1和iHLA-G1的表达与肾移植术后的排斥反应发生无关,sHLA-G5的高表达与排斥反应发生的减少有关.     

HLA-G在异基因造血干细胞移植中诱导免疫耐受

目的 研究供者粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员前后外周血和骨髓中单个核细胞人白细胞分化抗原G(HLA-G)膜表达以及血浆和骨髓液中HLA-G水平,揭示G-CSF动员骨髓移植优于外周血干细胞移植与骨髓中HLA-G有关的机制.方法 流式细胞术检测外周血和骨髓中单个核细胞HLA-G膜表达以及酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆和骨髓液中HLA-G水平.结果 动员后膜结合型HLA-G(m HLA-G)在外周血和骨髓中均显著高于动员前(P=0.001,P=0.000),且动员后骨髓m HLA-G含量较外周血中高(P=0.001).动员后外周血中分泌型HLA-G(s HLA-G)较动员前无明显差异(P=0.279),动员后骨髓中s HLA-G较动员前明显增高(P=0.002),且动员后骨髓s HLA-G较动员后外周血中含量明显增高(P=0.004).结论 HLA-G在G-CSF动员后造血干细胞移植(HSCT)诱导免疫耐受中具有重要作用.     

重组人可溶性突变体BAFF蛋白的制备及生物学活性的鉴定

目的制备高纯度的B细胞活化因子(BAFF)可溶性突变体(smBAFF)蛋白,鉴定其生物学活性。方法重组原核表达载体pET41a/smBAFF在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达smBAFF蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,超声碎菌,提取包涵体,Ni2+-NTA亲和层析纯化,复性,鉴定其生物学活性。结果经鉴定表达出相对分子质量为1.7×104的外源蛋白smBAFF,经Ni2+-NTA亲和层析纯化出该重组蛋白,复性后的smBAFF与B细胞具有较高的亲和力,但失去共刺激B细胞增殖的能力,且能竞争性抑制天然sBAFF的作用。结论成功制备具有B细胞结合活性而失去刺激B细胞增殖活性的smBAFF,为以smBAFF为靶向载体在B细胞恶性增殖性和异常活化性疾病治疗研究奠定基础。     

HLA-G expression in the peripheral blood of live kidney transplant recipients

Background The human leukocyte antigen-G (HLA-G) has been considered to be an important tolerogeneic molecule playing an essential role in maternal-fetal tolerance, upregulated in the context of transplantation, malignancy, and inflammation, and has been correlated with various clinical outcomes. The aim of this study was to investigate the clinical relevance of the expression of membrane HLA-G (mHLA-G), intracellular HLA-G (iHLA-G), and soluble HLA-G (sHLA-G) in the peripheral blood of live kidney transplant recipients.

Methods We compared the expression of the three HLA-G isoforms in three groups, healthy donors (n=20), recipients with acute rejection (n=19), and functioning transplants (n=30). Flow cytometry was used to detect the expression of mHLA-G and iHLA-G in the T lymphocytes of peripheral blood from subjects in the three groups. Enzyme-linked immunosorbent assays were used to detect sHLA-G in the plasma from the three groups.

Results There were no significant differences in mHLA-G and intracellular HLA-G among the three groups, but the sHLA-G plasma level was higher in the functioning group than in the acute rejection or healthy group. We found a subset of CD4+HLA-G+ and CD8+HLA-G+ T lymphocytes with low rates of mHLA-G expression in the peripheral blood of kidney transplantation recipients. Intracellular expression of HLA-G was detected in T lymphocytes. However, there was no correlation between acute rejection and the mHLA-G or intracellular HLA-G expression.

Conclusion sHLA-G was the major isoform in the peripheral blood of live kidney transplant recipients and high sHLA-G levels were associated with allograft acceptance.

     

可溶性人类白细胞抗原G与子痫前期的关系

目的：通过检测子痫前期（ PE）孕妇血清中可溶性人类白细胞抗原G（ sHLA-G）水平的变化,探讨其与PE的关系。方法采用ELISA法检测轻度、重度PE及健康孕妇血清中的可溶性HLA-G（ sHLA-G）水平。结果各组孕妇外周血sHLA-G水平：轻、重度PE组孕妇分别为（44．32±10．72） U/ml,（30．08±9．12） U/ml,对照组为（90．52±11．32）U/ml,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0．01）;重度PE组与轻度PE组比较,差异亦有统计学意义（P＜0．01）。结论与健康孕妇相比,sHLA-G在PE孕妇外周血中呈明显低表达,sHLA-G表达水平的异常可能与PE的发病有关。     

HCMV感染患儿血浆可溶性HLA-G及IL-10检测的意义

目的探讨血浆可溶性人类白细胞抗原-G(soluble human leukocyte antigen-G,sHLA-G)及白细胞介素-10(in-terleukin-10,IL-10)在儿童巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染中的意义。方法分别收集75例HCMV活动性感染患儿的外周血及尿液标本,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆sHLA-G和IL-10水平;采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测尿液HCMV DNA载量。结果 HCMV活动性感染患儿血浆sHLA-G水平[54.91(6.75～282.72)U/ml]明显高于对照组[21.32(1.07～260.35)U/ml],差异有统计学意义(P<0.001);血浆IL-10的水平[9.24(1.61～41.77)pg/ml]明显高于对照组[1.82(1.03～3.98)pg/ml],差异有统计学意义(P<0.001);血浆sHLA-G和IL-10水平与尿液HCMV DNA载量之间无明显相关性(P>0.05)。结论 HCMV活动性感染患儿血浆sHLA-G和IL-10水平显著升高,可作为HCMV活动性感染诊断的指标。