肿瘤细胞不同程度表达HLA-G对NK细胞杀伤活性影响研究

目的 探讨肿瘤细胞不同程度表达HLA-G对NK细胞杀伤活性的影响.方法 基因克隆建立稳定表达HLA-G抗原的肿瘤细胞株,以及通过基于CD107a标记的流式细胞术检测肿瘤细胞表达HLA-G前后对NK细胞杀伤功能的影响.结果HLA-G抗原在细胞表面获得不同程度的表达且能显著抑制NK对肿瘤细胞的杀伤活性(P＜0.05).HLA-G特异性抗体87G阻断或其受体KIR2DL4特异性抗体#33阻断后,均能明显恢复NK细胞对转染HLA-G肿瘤细胞的杀伤功能.结论 肿瘤细胞HLA-G表达量不同,均能抑制NK细胞的杀伤活性,提示HLA-G分子表达在恶性肿瘤细胞的免疫逃逸中起重要作用.     

胎脑低分子提取物的抑瘤作用及其对NK细胞杀伤肿瘤细胞的影响

采用超滤技术分段提取1～3万、<1万、<5千、<3千分子量的胎脑提取物,检测其对K_(562)、L_(1210)肿瘤细胞株杀伤作用。发现<3千分子量的胎脑提取物其杀伤活性最强。为评估此种小分子提取物对细胞免疫作用的影响,我们测定了小分子提取物对NK细胞杀伤肿瘤细胞的作用,发现小分子抑瘤物可促进其对肿瘤细胞的杀伤作用。     

HLA-G通过促进活化性受体的表达增强NK细胞对宫颈癌细胞的杀伤作用

目的 探索宫颈癌细胞中HLA-G表达差异对NK细胞表面活化性受体的影响。方法 实时定量PCR(real-time PCR)及免疫印迹法（Western-Blot WB）检测宫颈癌细胞及正常宫颈细胞中HLA-G的表达差异。利用慢病毒载体构建HLA-G稳定下调的宫颈癌细胞株,并与NK细胞共培养,CCK8法检测共培养后宫颈癌细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测宫颈癌细胞凋亡水平。同时,流式细胞术检测共培养后NK细胞表面活化性受体NKG2D、NKP30的表达水平及颗粒素（Granzyme）、穿孔酶（Perforin）的表达差异。结果 RT-PCR及WB法检测结果显示：与H8细胞相比,C33a、SiHa细胞中HLA-G的表达显著升高（P <0.05）。CCK8法检测结果显示：HLA-G下调后,C33a及SiHa细胞与NK细胞共培养,C33a及SiHa细胞的增殖能力显著减弱（P <0.05）,同时,C33a及SiHa细胞的凋亡水平显著升高（P <0.05）。流式细胞术检测结果显示：C33a及SiHa细胞HLAG下调后,与其共培养的NK表面NKG2D表达显著升高（P <0.05...     

NK细胞、HLA-G、和HLA-DRB1等位基因在子痫前期发病机制中的作用研究

目的:研究子痫前期患者发病机制中相关的免疫学变化及基因背景。方法:SAP法检测血液中NK细胞数量。MTT珐检测NK细胞增殖能力。51Cr释放法测定NK细胞杀伤活性。免疫组化法检测胎盘蜕膜浸润的NK细胞数量及HLA-G蛋白表达水平。RT-PCR和real time PCR法检测胎盘蜕膜组织HLA-G mRNA。PCR-SSP法检测两组HLA-DRB1等位基因频率,并分析母/儿间所携带某些HLA-DRB1等位基因配伍的频率。结果:①子痫前期患者外周血及其新生儿脐血NK细胞数均显著高于正常晚孕者及其新生儿。②子痫前期患者外周血及其新生儿脐血NK细胞增殖活性及杀伤活性均明显高于正常晚孕组(P<0.05)。③轻度与重度子痫前期组胎盘蜕膜NK细胞均多于正常晚孕组,但仅重度子痫前期组蜕膜NK细胞数量增加有统计学意义(P<0.05)。④轻度子痫前期组、重度子痫前期组和正常晚孕组之间HLA-G mRNA水平两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。⑤轻度子痫前期组HLA-G蛋白表达水平与正常晚孕组无显著性差异,重度子痫前期组胎盘HLA-G蛋白表达水平较正常晚孕组显著降低(P<0.05)。⑥两组孕妇和新生儿均检出13个HLA-DRB1等位基因,各等位基因频率在两组间均无明显差异。子痫前期组母不携带HLA-DRB1*04基因/儿携带DRB1*04基因、均不携带HLA-DRB1*14基因的频率显著高于正常晚孕组(P<0.05);母/儿均不携带HLA-DRB1*10基因、均携带HLA-DRB1*14的频率显著低于正常晚孕组(P<0.05)。结论:①先兆子痫患者外周血、脐血及蜕膜的NK细胞数量增多,活性增强,在妊娠过程中影响母胎免疫耐受。②母婴所携带的某些HLA-DRB1基因配伍与子痫前期易感性或抗性相关;父源性HLA-DRB1*04基因与子痫前期易感性相关。     

天然植物成份抗癌抗突变作用的分子机制研究

以天然植物成份麦芽提取液为受试物，以肿瘤抑制基因Ｐ５３为靶基因，利用现代分子生物学技术手段，用已知序列Ｐ５３引物进行ＰＣＲ扩增，获得特定的ＤＮＡ片段测序，从而对麦芽提取液抗癌抗突变作用的分子机制进行了探讨。     

可溶性HLA-G1抑制人自然杀伤细胞NK92 对猪内皮细胞PED的黏附

目的 研究可溶性HLA-G1(HLA-G5)对人自然杀伤细胞(NK细胞)黏附到猪血管内皮细胞(PED)的抑制作用,从而降低人NK细胞对猪血管内皮细胞杀伤杀伤活性.方法 利用核转染技术将pcDNA3-HLA-G5转入LCL721.221细胞株.以RT-PCR、Dot-ELISA技术分别在基因水平和蛋白水平检测HLA-G5的表达;以人类NK细胞系(NK92)效应细胞,猪内皮细胞系(PED)为靶细胞,检测NK92在静止和流动状态下对PED的黏附作用;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HLA-G5抑制NK细胞的杀伤活性.结果 与未加入HLA-G5的对照组相比,NK92在静止和流动状态下对PED的黏附功能明显降低(P＜0.01),且对HLA-G5组PED的杀伤效率均有明显下降(P＜0.01).结论 HLA-G5可以通过抑制NK92对PED的黏附功能,来减轻NK92对PED的杀伤作用.     

NK细胞MHC-1类分子受体及其信号传导

近年来,NK细胞表面MHC-1类分子受体的发现,改变了人们对NK细胞杀伤作用的认识.目前已知,当组织细胞处于正常状态时,NK细胞可通过其表面MH-1类分子受体与正常组织细胞表面相应配体的结合产生杀伤抑制作用;而当细胞受病毒感染或发生突变时,其表面MHC-1类分子表达异常或缺失,NK细胞与相应配体结合则解除杀伤抑制状态,启动活化性信号传导途径,杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞.可见,NK细胞的免疫防御和监视功能与其表面受体在不同情况下传导抑制或活化信号的功能密切相关.     

米非司酮终止妊娠的分子免疫机制

1985年Bygdeman和Swahnt首次证明米非司酮(mifepristone，RU486)配伍小剂量前列素制剂可使早孕(停经≤49天)完全流产率达90％以上，从而使米非司酮作为一种抗早孕药物在临床上推广应用。米非司酮竞争性结合孕酮受体，可直接作用于绒毛、蜕膜、胎盘、子宫肌层、宫颈，其药理作用已基本阐明，但免疫学机制仍未明确。研究表明，Th1／Th2细胞因子平衡与妊娠结局有很大关系。     

血清中sHLA-G水平与自然流产的关系

目的:通过定量测定正常妊娠妇女与自然流产患者血清中sHLA-G,探讨sHLA-G的水平与自然流产的关系。方法:采用ELISA法定量检测16例正常妊娠妇女和16例自然流产患者血清中的sHLA-G水平。结果:正常妊娠组血清中sHLA-G的浓度为(1.37±1.44)IU/ml;自然流产组为(0.57±0.27)IU/ml。自然流产组sHLA-G水平明显低于正常妊娠组,差异有统计学意义,P<0.05。结论:血清中sHLA-G水平在维持妊娠的过程中有重要作用,低水平的sHLA-G与自然流产具有一定的关联性。     

从妊娠人胎盘绒毛组织克隆HLA-G1 cDNA

为系统研究HLA-G1分子的生物学功能,采用RT-PCR技术,从人流的胎盘绒毛组织中提取总RNA,经过逆转录合成HLA-G1的全长cDNA,插入到真核表达载体pcDNA3中,构建重组表达质粒pcDNA3-HLA-G1;转化大肠杆菌DH5α,筛选其阳性克隆株,经酶切、PCR及测序鉴定,证实HLA-G1分子的重组真核表达载体已构建成功。     

可溶性HLA-G1-肽复合物的体外折叠和鉴定

目的 合成可溶性HLA-G1-肽复合物。方法 利用原核高效表达的可溶性HLA-G1重链和轻链（β2m）,在人工合成的HLA-G1限制性九肽（KGPPAALTL）存在的条件下,通过稀释复性折叠成可溶性HLA-G1-肽复合物。利用特异性抗体（W6／32及兔抗人β2m抗体）进行免疫印迹及酶联免疫吸附试验,检测稀释复性的折叠产物。结果 折叠复合物含有35％可溶性HLA-G1-肽复合物、5％可溶性HLA-G1重链聚合体及60％复性的β2m3种成分。结论 通过原核表达、体外折叠能够获得大量可溶性HLA-G1-肽复合物。     

四种不同组织来源LAK细胞的体外扩增及抗肿瘤作用的比较

目的：比较四种不同组织来源LAK细胞的体外扩增及抗肿瘤作用。方法：选用脐带血制备LAK细胞，并与临床常用的外周血、胎脾及胸腺LAK细胞在体外扩增及抗肿瘤作用方面比较。结果：脐带血的扩增能力显著高于其余3种LAK细胞（P＜0．01），每份脐带血LAK细胞总数可增殖至2．5×1010；抗肿瘤活性以脐带血LAK对SMMC-7221肝癌细胞出现最早（第3d）、活性最强（85％±3％），明显强于其余三者（P＜o．01）；对K562的杀伤作用仍属脐带血LAK最强；而胸腺LAK的活性最弱。结论：脐带血LAK细胞体外增殖快，杀伤活性强，可用于肿瘤的过继性免疫治疗。     

Determination of IL-2 and cytotoxicity of killer cells in MTT colorimetry

Summary The activity of interleukine 2 (IL-2) in culture supernatants of lymphokine-activated killer (LAK) cells and tumor infiltrating lymphocytes (TIL) as well as cytotoxicity of LAK cells on cultured leukemic cells were determined by MTT colorimetry. The results showed that higher activity of IL-2 in culture supernatant of LAK and TIL cells was found it could be used to support the culture of IL-2 dependent cell lines. The significant cytotoxicity of LAK cells on leukemic cell lines could be found in vitro, and it was consistent with the ratio of effector cells to target cells. The number of living leukemic cells is consistently related with the concentration of formazan metabolite of MTT. It suggested that the numbers of living cells and cytotoxicity of LAK cells could be estimated by determination of formazan metabolite OD value.     

雌二醇及他莫昔芬对LAK细胞杀伤卵巢癌细胞作用的影响

目的：探讨雌二醇（Ｅ２）和他莫昔芬（ＴＡＭ）对淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ细胞）杀伤卵巢癌细胞３ＡＯ作用的影响。方法：分别用Ｅ２,ＴＡＭ,Ｅ２＋ＴＡＭ预处理ＬＡＫ细胞及３ＡＯ细胞１２ｈ,然后以５：１效靶比将效、靶细胞混合作用４ｈ,用流式细胞术检测ＬＡＫ细胞杀伤活性,比较用药前后杀伤活性的变化。结果：Ｅ２预处理ＬＡＫ细胞及３ＡＯ细胞后,其杀伤活性提高了５６．６％～１９９．２％;ＴＡＭ处理后提高了４     

重组人可溶性补体受体1型SCR15-18片段表达纯化及生物活性鉴定

目的 获得高表达、高纯度和高活性的可溶性补体受体1型SCR15-18 (sCR1-SCR15-18)蛋白.方法 重组原核表达载体pET32a-sCR1-SCR15-18 在大肠杆菌BL21中经不同IPTG浓度、诱导时间和温度诱导表达,超声破菌,提取包含体,经Ni2 -NTA 亲和层析后,选择不同氧化还原条件进行复性,进而检测其生物学活性.结果 得到了有较高表达量、较高纯度和较好生物学活性的sCR1-SCR-15-18蛋白.结论 优化了sCR1-SCR15-18蛋白的表达、纯化和复性的参数,所获结果为进一步动物体内保护实验研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌MycP1蛋白的原核表达及其对巨噬细胞的毒性作用

目的:构建结核分枝杆菌MycP1蛋白原核表达系统。方法:构建pGEX-4T-1-Rv3883c重组质粒,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Westernblot法检测目标蛋白的表达情况。目标蛋白经亲和层析纯化后,以不同质量浓度MycP1作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,48h后XTT法检测活细胞数,同时测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力,以评价其细胞毒性。结果:成功构建pGEX-4T-1-Rv3883c质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,经鉴定,表达的融合蛋白为目标蛋白MycP1。该融合蛋白作用后可使ANA-1活细胞数下降(F=34.327,P<0.001),培养上清液中LDH活力升高(F=336.720,P<0.001)。结论:成功构建了MycP1原核表达系统,目标蛋白对巨噬细胞有一定的毒性效应。     

Ly49C基因SiRNA对小鼠NK细胞抗白血病活性的影响

目的:观察SiRNA转染小鼠KIR(Ly49C)基因对NK细胞抗白血病活性的影响。方法:应用免疫磁珠分选法纯化C57BL/6小鼠脾细胞中的NK细胞,体外化学合成以Ly49C基因为靶标的SiRNA,联合用脂质体转染小鼠NK细胞,以未处理组为对照,流式细胞仪检测在SiRNA转染后淋巴细胞表面Ly49C分子的表达率。以空转染和未转染的NK细胞作对照,LDH法检测转染后NK细胞对红白血病细胞FBL-3的的杀伤活性。结果:免疫磁珠分选后NK细胞纯度可达90%以上。Ly49C基因SiRNA转染小鼠NK细胞48 h后Ly49C分子表达率为(30.28±1.41)%,未转染对照组为(58.45±3.32)%。相同效靶比时,转染组NK细胞杀伤活性较未转染组显著提高,二者之间差异有显著统计学意义(P<0.05)。结论:转染Ly49C SiRNA的C57 BL/6小鼠NK细胞对FBL-3细胞的杀伤活性明显增强,为提高异基因骨髓移植后移植物抗白血病作用提供了实验依据。     

红景天甙对小鼠免疫功能的影响及杀瘤效应

目的 探讨高山红景天甙对正常小鼠免疫功能的影响。方法 用高山红景天甙腹腔注射免疫小鼠，剂量为800μg/d，采用四唑蓝比色法检测体内外的脾淋巴细胞转化反应和巨噬细胞的细胞毒效应。结果 高山红景天甙在体外显示显著的丝裂原样效应且该效应存在明显的剂量依赖性（P＜0．01）；刺激高山红景天甙免疫组小鼠的脾淋巴细胞时，脾淋巴细胞的转化反应未见进一步增强；巨噬细胞能明显杀伤HCa-F小鼠肝癌细胞，杀瘤率达2．3％（P＜0．01）。结论 高山红景天甙具有丝裂原效应；能通过非特异性免疫功能的调节促进PEMψ的杀瘤效应。高山红景天甙可能是介导双向免疫调节作用的有效成分之一。