糖尿病肾病小鼠CD4+T细胞的脂质组学研究

目的：初步探讨糖尿病肾病(DKD)小鼠CD4⁺T免疫细胞在脂质组学方面的差异,筛选出具有生物学意义的差异代谢产物。方法：先采用CD4 (L3T4) MicroBeads免疫磁珠法分离BKS.Cg-Dock7^m+/+Lepr^db/J自发性DKD小鼠脾脏CD4⁺T免疫细胞;流式细胞术鉴定CD4⁺T免疫细胞纯度,LC-MS/MS技术检测CD4⁺T免疫细胞非靶向脂质组学,对差异代谢产物进行分析。结果：LC-MS法检测出463个代谢产物;PCA和OPLS-DA分析显示代谢组分明显分离;筛选出24种差异代谢物。KEGG及富集分析可知差异代谢物涉及甘油磷脂代谢紊乱。结论：CD4⁺T细胞磷脂类代谢与DKD的发生密切相关,靶向DKD CD4⁺T细胞的磷脂类代谢可能是DKD治疗的新方向。     

肝浸润CD8~+T细胞在HFD诱导的小鼠NAFLD早期病变中的变化

目的建立高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导的小鼠非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型,动态监测其血清生化指标、肝脏病理形态学及肝脏浸润T淋巴细胞变化,从而探讨NAFLD早期肝病变动态进展特征。方法 4～6周龄C57BL/6雄性小鼠随机分成正常饮食(normal-chow diet,NCD)组和HFD组,喂养2～16周后,禁食不禁饮12 h后获取血清和肝组织样本,检测血清肝脏相关生化指标水平,肝脏HE和油红O染色观察组织病理学改变,提取肝浸润淋巴细胞,并检测CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+、CD8~+CD44~+T淋巴细胞的频率及CD8~+T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力。结果与NCD组相比,HFD组小鼠体质量和附睾脂肪质量在第4周明显增加,而肝脏指数在2～8周内降低,第10周开始持续上升;HFD喂养小鼠血清肝损伤指标于第8周开始上升,之后持续增加;HE和油红O染色显示第10周小鼠肝细胞发生明显脂肪样变,并在第16周时出现片状气球样变,可见点状坏死和炎细胞浸润等病理改变;流式染色结果显示,HFD喂养2～8周内肝浸润CD3~+CD8~+,CD8~+CD44~+T细胞的频率及CD8~+T细胞分泌IFN-γ的能力下降;在HFD持续喂养10周后,肝CD3~+CD8~+,CD8~+CD44~+T细胞的频率及CD8~+T细胞分泌IFN-γ的能力增加。结论在本实验条件下,HFD诱导的小鼠NAFLD肝损伤模型,早期病变始于HFD喂养8到10周,并动态观察到HFD喂养初期肝脏浸润CD8~+T细胞的功能受到抑制,而在肝脏出现明显病变的同时CD8~+T细胞也明显激活,频率上升及促炎反应增强。提示CD8~+T细胞激活可能与肝脏病理进展密切相关,并明确了该模型中肝浸润CD8~+T细胞激活扩增的阶段,为进一步研究其活化机制奠定实验基础。     

日本血吸虫感染小鼠的髓源抑制细胞对T 细胞的免疫抑制

目的:研究日本血吸虫感染小鼠模型中的髓源抑制细胞(MDSCs)的免疫抑制功能及对T细胞的作用机制。方法:构建日本血吸虫感染BALB/c小鼠模型,流式细胞术检测MDSCs动态比例变化,免疫磁珠分选小鼠骨髓中单核系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G-)和粒系MDSCs (CD11b~+Gr1~+Ly6G~+)亚群细胞,Write-Giemsa染色进行形态学鉴定; CFSE法检测单核系和粒系MDSCs亚群对CD4~+T、CD8+T细胞增殖的抑制作用,Real-time PCR方法检测细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β和精氨酸酶(ArgⅠ)、一氧化氮合酶2(NOS2)的表达。结果:血吸虫感染模型小鼠的MDSCs较对照组小鼠明显增多,以粒系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G+)亚群增多为主。两个亚群细胞均能降低CD4+T、CD8+T细胞的增殖活性,粒系亚群MDSCs的抑制作用更显著; Real-time PCR结果显示两个亚群细胞的细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ以及ArgⅠ、NOS2的表达水平均不同程度升高。结论:血吸虫感染模型小鼠体内的MDSCs显著增高,单核系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G-)和粒系MDSCs(CD11b+Gr1+Ly6G+)亚群均能抑制CD4~+T、CD8~+T细胞增殖,其作用机制可能与两亚群细胞均能上调相关细胞因子IL-4、IL-10、IL-13和ArgⅠ、NOS2的表达有关。     

促红细胞生成素对荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的:检测促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对荷黑色素瘤小鼠免疫功能的影响.方法:将C57BL/6小鼠随机分为3组:正常对照组、盐水处理组和EPO处理组,盐水处理组和EPO处理组小鼠皮下接种黑色素瘤细胞B16.17天后,检测各组小鼠外周血中红细胞(RBC)、血红蛋白(Hb)、红细胞压积(Hct)和白细胞(WBC)数量及脾脏脏器指数;应用流式细胞术检测脾细胞CD4+、CD8+T细胞亚群的分布;ELISA检测血清中IL-2和TNF-α细胞因子的水平.结果:盐水处理组荷瘤小鼠外周血中RBC、Hb和Hct含量明显低于正常对照组小鼠(P＜0.05),应用EPO可明显提高荷瘤小鼠外周血中RBC、Hb和Hct含量及脾脏脏器指数(P＜0.05),三组小鼠外周血中WBC数量无明显差别(P＞0.05);盐水处理组及EPO处理组荷瘤小鼠脾脏CD4+T细胞百分率及CD4+/CD8+T细胞比值明显低于正常小鼠(P＜0.05).EPO处理组与盐水处理组相比,CD4+T细胞百分率无差别(P＞0.05),而CD8+T细胞百分率下降(P＜0.05),致使EPO处理组小鼠CD4 +/CD8+T细胞比值升高(P＜0.05);盐水处理组及EPO处理组荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2含量明显低于正常小鼠(P＜0.05),EPO处理组小鼠血清中IL-2水平与盐水处理组相比增高(P＜0.05),但该两组小鼠血清中TNF-α含量无明显差别(P＞0.05).结论:EPO在改善荷瘤小鼠贫血状态的同时,还可通过提高外周血CD4 +/CD8+T细胞比值和IL-2含量而增强小鼠的免疫功能.     

饮食中的铜影响小鼠脂质代谢

目的通过建立不同剂量铜摄入模型,探究饮食中的铜对脂质代谢的影响。方法持续监测食用不同铜含量鼠粮的小鼠2个月内的体质量指标,并在实验干预终点检测其肝脏和腹部脂肪组织的比重、血清血脂含量、肝脏脂肪代谢相关酶的活性及mRNA水平和葡萄糖耐量。结果高剂量的铜摄入会影响小鼠体质量的增长(P0.001),促进机体三酰甘油的水解(P0.01),降低血清中三酰甘油的含量(P0.01),并导致机体糖耐量受损(P0.05)。结论铜过载会抑制小鼠肝脏中三酰甘油的合成,促进脂质降解、脂肪酸氧化,对脂质代谢产生影响。     

藏药短管兔耳草醇提物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

研究藏药短管兔耳草醇提物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。随机将小鼠分为正常对照组、模型组、兔耳草醇提物组(2.0、4.0、8.0g/kg),均连续灌胃给药15d,模型组为环磷酰胺制备免疫抑制模型,检测胸腺脾脏指数、血清溶血素抗体生成、碳粒廓清指数、迟发型超敏反应,流式检测脾脏T细胞亚群的变化及IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的水平。与模型组相比,兔耳草醇提物各剂量组均可提高小鼠胸腺指数(P0.05),高、中剂量组可提高小鼠胸腺脾脏指数(P0.05,P0.01),同时各剂量组可增加血清溶血素含量(P0.05)、提升小鼠的廓清指数(P0.05)和DNCB所致迟发型超敏反应(P0.01)。此外,通过流式细胞仪对各组小鼠脾脏中CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的检测发现,兔耳草醇提物组可增加小鼠脾脏T细胞的活化与数量,且CD4+/CD8+T细胞比值有差异(P0.01);另外,兔耳草各剂量组可提升小鼠的IL-4、IFN-γ的水平(P0.05),但会抑制IL-2、TNF-α的分泌(P0.05)。以上结果提示藏药短管兔耳草醇提物可从多方面缓解免疫抑制小鼠的免疫功能。     

荷瘤小鼠脾脏髓源抑制细胞的分选及鉴定

目的研究荷瘤小鼠脾脏中髓源抑制细胞(myeloid derived suppresser-cell,MDSCs)的分选与鉴定方法。方法常规培养小鼠肾癌细胞(Renca细胞),于Balb/c小鼠皮下建立小鼠肾癌模型;分离小鼠脾脏制成单细胞悬液,磁珠分选Gr-1+CD11b+双阳性的MDSCs;台酚蓝染色检测细胞存活率;流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测其细胞纯度;显微镜下观察细胞形态;免疫荧光测其表面Gr-1、CD11b荧光表达情况;RT-PCR检测Cox2和Arg-1的m RNA的表达情况;小鼠皮下成瘤实验观察MDSCs促肿瘤生长。结果成功建立小鼠肾癌模型,磁珠分选后经FCM检测Gr-1+CD11b+双阳性的MDSCs细胞可达92.3%,显著高于分选前(P0.01);免疫荧光鉴定结果显示:分选后的细胞形态完整,Gr-1和CD11b的荧光表达于细胞膜且2种荧光可以融合;RT-PCR检测分选后的MDSCs细胞群的Cox2和Arg-1的m RNA相对表达量显著高于分选前(P0.05);小鼠皮下成瘤观察到MDSCs组与实验对照组有显著差异(P0.05)。结论用免疫磁珠从荷瘤小鼠脾脏中成功分选得到MDSCs,具有较高纯度和良好的生物活性,为后续实验提供了理想的细胞来源。     

Erk1/2 MAP激酶对FGF21调节肝脏脂质代谢的影响

目的:研究细胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2,一种MAP激酶)失活对成纤维细胞生长因子21(FGF21)调节肝脏脂质代谢的影响。方法:选取8周龄雄性C57BL/6J野生型(WT)小鼠,经高脂饲料(HFD)喂养4周后,然后分别给予U0126(MEK抑制剂,使Erk1/2失活)和腺相关病毒携带的FGF21(AAV-FGF21)处理4周观察小鼠肝脏脂质代谢及其相关调控基因的变化状况。此外,体外原代培养肝细胞用于探索其具体分子作用机制。结果:AAV-FGF21处理4周能显著抑制WT小鼠体重增加,降低血清异常血脂水平,并减少肝脏脂质沉积。然而,这些保护性效应在给予药物U0126抑制Erk1/2活性后出现一定程度的降低。在分子信号机制方面,AAV-FGF21处理能显著抑制肝脏胆固醇合成调控基因Srebp-2的表达,增加脂肪酸氧化分解和转运等代谢调控基因(Acacb、ABCG5、Cyp7a1等)的表达,减少肝脏组织细胞炎症因子IL-1β、TNF-α和MCP-1的mRNA表达水平;然而,经U0126处理后这些效应在一定程度上被抑制。在体外实验方面, FGF21处理呈时间和剂量依赖性地抑制胆固醇调控蛋白Srebp-2的mRNA和蛋白表达;然而,给予U0126共处理后,这种效应被完全抑制。结论:FGF21具有改善机体肝脏脂质代谢的生物功能;Erk1/2部分介导了FGF21调节肝脏脂质代谢的生物学效应。     

菊粉对多囊卵巢综合征小鼠外周血、脾脏、肝脏髓源抑制性细胞及血浆炎症因子的影响

目的分析菊粉对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)小鼠髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、单核细胞样MDSCs(monocytic-MDSCs,M-MDSCs)比例的变化和意义及其与血浆炎症因子的相关关系。方法采用60%高脂饮食联合颈背部皮下注射脱氢表雄酮6 mg/100 g+0.1 ml芝麻油制备PCOS小鼠模型,选取21～27日龄的雌性C57BL/6J小鼠30只,随机分为正常对照组、模型组、菊粉干预组,每组10只。流式细胞仪检测各组小鼠外周血、脾脏、肝脏中MDSCs和M-MDSCs的比例变化以及炎症因子TNF-α、IL-17A和IL-10的水平。结果对MDSCs和M-MDSCs分析发现:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠外周血、脾脏、肝脏中MDSCs和M-MDSCs显著增加,与模型组小鼠相比,菊粉干预组小鼠外周血、脾脏和肝脏MDSCs及M-MDSCs也显著增加。对血浆炎症因子分析发现:TNF-α、IL-17A在模型组与正常对照组小鼠中相比显著增加,而在模型组与菊粉干预组中相比显著降低,IL-10在模型组与正常对照组小鼠中相比显著降低,而在模型组与菊粉干预组中相比增加,但是没有统计学意义。对MDSCs和M-MDSCs与血浆炎症因子TNF-α, IL-17A相关性分析发现:PCOS小鼠外周血、脾脏、肝脏中MDSCs和M-MDSCs与血浆炎症因子TNF-α、IL-17A均呈负相关。结论菊粉能够诱导MDSCs、M-MDSCs在外周血、脾脏和肝脏中募集,减少促炎因子TNF-α、IL-17A的生成,从而延缓疾病的进展。     

不同脂肪含量的高脂纯化配方饲料对大、小鼠代谢综合征发生的影响

 摘要： 目的 探讨不同脂肪含量的高脂纯化配方饲料对大、小鼠体重、血糖、血胰岛素、血脂、脂肪肝及白蛋白尿的影响。 方法 雄性SD大鼠及C57BL/6小鼠随机分为MS10%、MS45%和MS60%脂肪含量饲料组,喂养3个月,检测动物体重、血糖、血胰岛素水平、血脂和蛋白尿水平,以及主要脏器重量及肝脏脂质含量。 结果 与正常组（MS10%脂肪含量）相比,高脂组（MS45%和MS60%脂肪含量）动物体重显著增加,出现明显的糖耐量异常、胰岛素抵抗和血脂水平升高,同时伴有肝脏脂质含量和蛋白尿水平的增加,并且以MS45%高脂组体重增加及胰岛素抵抗更加显著。 结论 MS45%和MS60%高脂配方饲料均可在大、小鼠较好地诱导代谢综合征的发生,而且前者优于后者。 关键词： 高脂饲料;胰岛素抵抗;肥胖;代谢综合征     

富含亚麻酸的膳食亚麻籽油对2 型糖尿病大鼠外周血和脾脏髓源抑制 细胞及炎症因子的影响

目的:探讨富含亚麻酸的膳食亚麻籽油(FO)对2型糖尿病(T2DM)大鼠髓源抑制细胞(MDSCs)比例变化及其与血浆炎症因子的相关关系。方法:SD大鼠随机分为正常组(NC)、糖尿病组(T2DM)、亚麻籽油干预对照组(NC+FO)和亚麻籽油干预组(T2DM+FO)。NC+FO组和T2DM+FO组每天摄取亚麻籽油饮食(10%w/w),NC组和T2DM组给予10%玉米油饲料喂养。干预5周后,流式细胞术检测外周血和脾脏MDSCs含量;ELISA检测各组血浆中IL-1β、TNF-α和IL-10水平,Pearson分析两者相关性。结果:与T2DM组相比,T2DM+FO组大鼠外周血和脾脏中MDSCs含量显著增加(P均0.05),血浆IL-1β和TNF-α表达水平降低(P均0.05),IL-10升高但差异无统计学意义(P0.05)。分析外周血和脾脏细胞中MDSCs含量与炎症因子相关性,发现MDSCs与IL-1β和TNF-α呈负相关。结论:FO可募集血浆和脾脏中MDSCs,降低血浆中IL-1β、TNF-α含量,进而发挥抗炎作用,延缓T2DM的进展。     

小陷胸汤对高血脂小鼠血脂及免疫功能的影响

为探讨小陷胸汤对高脂血症(hyperlipidemia, HLP)小鼠血脂及免疫功能的影响及其作用机制,准备36只C57BL/6小鼠,通过高脂饲料喂养8周建立HLP模型,随机分为对照组,模型组,小陷胸汤低(0.03 g/mL)、中(0.06 g/mL)、高(0.12 g/mL)剂量组和阳性对照组(2.5 mg/kg洛伐他汀),每组6只。处死小鼠后,称量肝脏、脾脏,计算肝脏指数和脾脏指数;全自动生化分析仪测定小鼠血清总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平;FACS检测CD40~+/CD40L~+细胞和Th1、Th2百分比;ELISA检测各组小鼠血清CRP表达量。结果显示:与对照组相比,模型组小鼠肝脏指数和脾脏指数升高(均P0.05);CRP、TC、TG和LDL-C水平上升,HDL-C水平下降(均P0.05);CD40~+/CD40L~+细胞、Th1百分比增加,Th2百分比减少(均P0.05)。与模型组比较,中剂量组和高剂量组小鼠肝脏指数和脾脏指数降低;CRP、TC、TG和LDL-C水平下降,HDL-C水平上升;CD40~+/CD40L~+细胞、Th1百分比减少,Th2百分比增加(均P0.05)。由此,小陷胸汤可降低HLP小鼠血脂水平,减轻机体炎症反应水平并提高免疫功能。     

宿主的遗传背景对呼吸道感染沙眼衣原体后Treg产生的影响

目的 探讨宿主的遗传背景对呼吸道感染沙眼衣原体后调节性T细胞(Treg)产生的影响.方法 对衣原体感染具有明显易感性差异的C57 BL/6(C57)和C3H/HeN(C3H)小鼠鼻腔吸入1×103 IFU沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum,Cm),于感染后不同天数处死小鼠.利用细胞内细胞因子染色技术检测小鼠脾脏单个核细胞CD4+ CD25+T细胞、Foxp3+ CD4+ CD25+T细胞百分率,利用RT-PCR技术检测小鼠肺组织Treg细胞分泌的相关细胞因子IL-10和IL-2的mRNA表达水平,并比较Cm呼吸道感染不同时期C57和C3H小鼠Treg免疫应答水平的差异.结果 Cm感染在两组小鼠均诱导较高水平的CD4+ CD25+T细胞、Foxp3+ CD4+ CD25+T细胞产生及IL-10、IL-2mRNA表达.感染后第3天和第7天,高易感性的C3H小鼠脾脏CD4+ CD25+T细胞、Foxp3+ CD4+CD25+T细胞扩增水平,以及肺组织细胞因子IL-2 mRNA的表达水平均高于C57小鼠,感染后第14天,C3H小鼠IL-10 mRNA表达水平明显高于C57小鼠.结论 衣原体呼吸道感染在高易感性的C3H小鼠诱导高水平的Treg的增殖及Treg相关细胞因子IL-10、IL-2的表达,从而对衣原体特异的Th1免疫应答抑制作用增强,在小鼠衣原体呼吸道感染易感性差异中发挥重要作用.     

HDAC抑制剂丙戊酸通过减少MDSCs蓄积抑制肝癌的生长

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(VPA)抑制肝癌发生发展的机制。方法将16只Balb/c小鼠注射小鼠肝癌细胞H22建立肝癌原位模型,随机分成2组:对照组和VPA组。术后第2天VPA组小鼠每天腹腔注射VPA(200 mg/kg),对照组每天腹腔注射等量的生理盐水。10 d后将小鼠处死,观察肿瘤大小及小鼠肝脏质量,利用流式分析小鼠脾脏部位CD4、CD8、NK细胞、MDSCs水平及肿瘤部位MDSCs的比例。建立小鼠肝癌原位模型,利用小动物活体成像分析MDSCs经1 mmol/L VPA处理后在体内迁移情况。结果 VPA抑制肝癌原位模型中肝癌生长,上调脾脏CD4、CD8水平,抑制肿瘤和脾脏部位MDSCs蓄积。MDSCs经VPA处理后向肿瘤和脾脏迁移的能力减弱,而MDSCs向骨髓的迁移的能力没有受影响。结论在肝癌微环境中,VPA能够抑制MDSCs向肿瘤和脾脏部位迁移、改善肝癌微环境,从而抑制肝癌生长。本研究为肝癌的治疗提供了一定的实验基础。     

IL-2抑制小鼠CD4~+ CD62L~+ T细胞分化为Th17细胞

目的研究IL-2对小鼠脾脏CD4+CD62L+T细胞在体外向Th17细胞分化的作用。方法免疫磁珠法分选C57BL/6小鼠脾脏CD4+CD62L+T细胞,于抗体包被的培养板中培养3 d,实验分为对照组和IL-2处理组。对照组为经典Th17诱导分化培养基,IL-2处理组在对照组基础上于培养体系中添加IL-2。CFSE染色检测细胞增殖,Annexin V-PI法检测细胞凋亡,ELISA检测培养上清中IL-17A的浓度,荧光定量PCR检测Rorγt mRNA的表达,流式细胞术检测CD4~+IL-17~+Th17的生成比例以及Rorγt的表达。结果磁珠分选的小鼠脾脏CD4+CD62L+nave T细胞纯度高于95%。与对照组相比,IL-2处理组细胞数目明显增多,增殖能力明显增强(P0.05),细胞凋亡比例降低(P0.05);IL-2处理组培养上清中IL-17A的浓度明显降低(P0.05),且CD4+IL-17+细胞比例下降,其特异性转录因子Rorγt的表达水平也显著降低(P0.05)。结论 IL-2在CD4+CD62L+T细胞分化为Th17的过程中,能够促进T细胞的增殖并且抑制Th17的分化。     

miR-7敲减CD4~+ T细胞过继转输对小鼠急性肝损伤模型的影响

目的:观察过继转输微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)敲减(knockdown,KD)CD4~+ T细胞对小鼠急性肝损伤模型的影响,并探讨其意义。方法:利用磁珠分选技术分别获得正常野生型(WT)小鼠和miR-7KD小鼠脾脏中CD4~+ CD62L~+ T细胞;CFSE染色标记后,按每只小鼠2×10~6个细胞,经尾部静脉注射给同系WT小鼠,并利用伴刀豆球蛋白A建立急性肝损伤模型;观察过继转输后2组小鼠肝脏的形态、重量及其重量指数的变化;HE染色观察小鼠肝脏组织的病理学变化;real-time PCR检测小鼠肝脏组织中凋亡相关分子Bax和P53的表达;流式细胞术检测小鼠肝脏组织中CFSE标记的CD4~+ T细胞活化相关膜分子CD62L表达水平以及细胞因子白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的表达变化。结果:与对照组相比,过继转输miR-7KD小鼠CD4~+ CD62L~+ T细胞组(miR-7KD转输组)小鼠的肝脏重量明显减轻(P0.01),但重量指数显著增加(P0.05);HE染色显示miR-7KD转输组的肝脏细胞损伤增加;real-time PCR结果显示miR-7KD转输组肝脏组织中凋亡相关细胞分子Bax和P53的相对表达水平均明显升高(P0.05);流式细胞术检测结果进一步显示肝脏组织中的CFSE~+细胞活化相关分子CD62L的表达水平明显降低(P0.01),细胞因子IFN-γ的表达水平明显增加(P0.05),而IL-4的表达水平显著降低(P0.01)。结论:过继转输miR-7敲减CD4~+ T细胞可显著加重急性肝损伤模型小鼠的肝组织损伤。这为后续深入探讨急性肝损伤的发生机制提供了重要的实验基础。     

微小RNA-7敲减对小鼠脾脏中T淋巴细胞体外功能的影响

观察微小RNA-7(microRNA-7,miR-7)敲减(Knock down,KD)对小鼠脾脏T淋巴细胞体外功能的影响并探讨其意义。常规分离野生型(wild type,WT)小鼠脾脏T淋巴细胞,经CD3和CD28抗体刺激后,Real-time PCR检测不同时间点(0h;24h;48h)细胞中miR-7的表达变化;进一步用Con A、CD3和CD28抗体刺激miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞,CCK8检测细胞增殖率;Real-time PCR检测miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞IL-12、IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-10表达的变化;FACS检测CD4+T和CD8+T细胞的数量变化及CD4+T细胞膜分子CD44、CD62L和IL-4、IFN-γ的表达变化。结果显示,WT小鼠脾脏T淋巴细胞活化后,miR-7的表达水平显著上调(P0.05);与WT小鼠相比,在Con A、CD3和CD28抗体作用下miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞增殖明显增加(P0.05);miR-7KD小鼠脾脏T淋巴细胞IL-12、IL-4、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均明显上调(P0.05),而IL-10表达显著下调(P0.05);FACS检测结果显示CD4+T细胞比例明显上调(P0.05),而CD8+T细胞的比例变化不显著(P0.05);CD4+T细胞膜分子CD62L水平显著下降,CD69及IL-4、IFN-γ的表达水平均显著上调(P0.05)。结果表明,miR-7敲减以后可显著影响小鼠脾脏T淋巴细胞的功能,本实验为后续深入探讨其在T淋巴细胞功能调控中的作用提供实验依据。     

TLR4 基因敲除对小鼠内脏脂肪组织免疫细胞及脂肪因子的影响

目的:探讨TLR4 基因敲除对小鼠免疫细胞及脂肪因子的影响。方法:取20 周龄的雄性野生型C57BL/6 小鼠和TLR4-/ -小鼠的脾脏和附睾脂肪组织,分离细胞,用流式检测F4/80、CD11b、CD11c、CD3、CD4、CD8 分子的表达;qPCR 检测附睾脂肪组织内IL-6、HMGB1、TNF-α、脂联素和抵抗素的表达。结果:与野生型C57BL/6 小鼠相比,TLR4-/ - 小鼠脾脏和附睾脂肪组织中M1 型(F4/80+ CD11b+ CD11c+ )巨噬细胞比例上升(P<0.05),M2 型(F4/80+ CD11b+ CD11c- )巨噬细胞比例下降(P<0.05),这种趋势在附睾脂肪组织中表现更为显著。同时发现附睾脂肪组织中CD4+ T 细胞比例下降(P<0.05),CD8+ T细胞比例上升(P<0.05);IL-6、HMGB1、抵抗素表达升高(P<0.05);TNF-α和脂联素表达降低(P<0.05)。结论:TLR4 基因敲除可导致内脏脂肪组织脂肪因子和免疫细胞的紊乱。     

肝脏cDCs亚群研究

目的探究肝脏不同c DCs亚群的特性和抗原递呈能力。方法分离肝脏非实质细胞和脾脏混合细胞,流式分选得到肝脏CD103~+ cDC(脾脏内CD8α~+ cDC)和CD11b~+ cDC,Q-PCR检测不同cDCs亚群特征性分子的表达。分离OT-Ⅰ/OT-Ⅱ转基因小鼠na?ve T细胞,并将得到的T细胞进行CFSE标记。将DCs和CFSE标记的T细胞加入特异的OVA肽段,体外共培养3 d,收集细胞检测T细胞增殖。结果稳态下小鼠肝脏内的CD103~+ cDC和CD11b~+ cDC类似脾脏CD8α~+ cDC和CD11b~+ cDC,分别负责活化CD8~+T细胞和CD4~+T细胞。结论发现了肝脏DCs的分群特性,以及证明了肝脏内cDC不同亚群对不同T细胞的活化作用,为进一步研究肝脏DCs的功能奠定基础。     

哮喘小鼠脾脏来源CD4~+ T细胞促进体外培养巨噬细胞的M2极化

目的探讨哮喘小鼠脾脏来源CD4~+ T细胞体外对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)极化的影响及其机制。方法建立粉尘螨变应原诱导的过敏性哮喘小鼠动物模型。于末次激发24 h后,取小鼠肺中叶、 HE染色观察炎症改变,运用实时荧光定量PCR检测肺、脾脏组织中miR-155-5p水平;免疫磁珠分选哮喘小鼠脾脏CD4~+ T细胞,实时荧光定量PCR检测哮喘小鼠脾脏CD4~+ T细胞miR-155-5p水平,同时用流式细胞术检测哮喘小鼠脾脏中CD4~+IFN-γ~+ Th1细胞和CD4~+IL-4~+ Th2细胞比例的变化;实时荧光定量PCR检测正常组和哮喘组小鼠肺组织中M2相关标志基因精氨酸酶1(Arg1)、类几丁质酶3样分子3(YM1/Chi3l3)、类抵抗素α(retnlα/FIZZ1)的mRNA水平;哮喘小鼠脾脏来源CD4~+ T细胞与BMDM进行共培养,实时荧光定量PCR检测BMDM的M2相关标志基因Arg1、 YM1、 FIZZ1的mRNA水平;通过瞬时转染的方法,将miR-155-5p抑制剂(miR-155-5p-inhibitor)和阴性对照分别转染入哮喘小鼠脾脏CD4~+ T细胞后,再与BMDM进行共培养48 h后,实时定量PCR测定BMDM中的Arg1、 YM1、 FIZZ1的mRNA水平。结果与对照组相比,哮喘组小鼠肺、脾脏组织中miR-155-5p水平增加,脾脏CD4~+ T细胞miR-155-5p水平升高,且Th2细胞比例上升,肺组织中Arg1、 YM1、 FIZZ1表达上调;哮喘组小鼠脾脏CD4~+ T细胞与BMDM体外共培养后, BMDM的Arg1、 YM1、 FIZZ1的mRNA水平上调,而转染miR-155-5p-inhibitor后的脾脏CD4~+ T细胞并未明显影响体外共培养的BMDM的M2标志基因表达。结论哮喘小鼠脾脏来源的CD4~+ T细胞能够促进体外共培养的巨噬细胞向M2极化。