应用CRISPR/Cas 9 系统构建肺癌细胞系获得AMPKα1 基因敲除的稳定细胞株

目的 利用CRISPR/Cas 9 系统在人肺癌细胞系A549 和H460 中获得敲除腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1(adenosine monphosphate-activated protein kinase, AMPKα1) 的稳定表达细胞系。方法 根据CRISPR/Cas 9 靶点设计原则,设计三条引导RNA（sgRNA）,分别构建AMPKα1-CRISPR/Cas9 KO 及其HDR 质粒。将质粒转染至A549 和H460 细胞后,筛选稳定的单克隆细胞株。用Western blot 鉴定筛选获得的肺癌细胞株是否表达AMPKα1。实验被分为原始对照组和敲除组,采用MTT 法检测AMPKα1 的肺癌细胞增殖情况。结果 经过CRISPR/Cas 9 系统处理后,筛选获得的A549 和H460 敲除AMPKα1 稳定细胞株与原始细胞株A549 和H460 相比,Western blot 检测不到AMPKα1蛋白质的表达,差异具有统计学意义(t=137.7, 79.17, 均P ＜ 0.000 1)。MTT 结果显示,筛选获得的A549 和H460 敲除AMPKα1 的稳定细胞株与原始细胞株A549 和H460 相比,敲除细胞株的增殖速度明显减弱,差异具有统计学意义（t=3.956 ～ 28.16,均P ＜ 0.05）。结论 CRISPR/Cas 9 系统成功建立敲除AMPKα1 表达的稳定肺癌细胞株,为进一步研究AMPKα1 在肺癌发生发展中的作用提供细胞模型。     

利用CRISPR/Cas9技术建立SOST荧光报告基因i PSCs细胞系

目的利用CRISPR/Cas9技术构建硬骨素(SOST)基因荧光报告诱导性多能干细胞(i PSCs)细胞株。方法使用PCR检测i PSCs分化过程不同阶段成骨基因的表达。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将p2A-td TomatoNeo质粒转染至i PSCs细胞。使用PCR凝胶电泳检测转染的效果,而后分别在光镜下观察成骨不同阶段i PSCs的形态变化、茜素红染色及SOST-td Tomato荧光表达情况,并利用茜素红染色及PCR评估转染细胞的成骨效果及成骨基因表达情况。结果 PCR检测结果发现,SOST只在骨细胞中稳定表达,可作为骨细胞的标志性基因。利用CRISPR/Cas9技术将td Tomato插入到SOST终止密码子处,转染后的i PSCs细胞株不影响其成骨效果及SOST基因的表达。结论利用CRISPR/Cas9技术能够成功构建td Tomato-SOST荧光报告基因的i PSCs细胞株。     

应用CRISPR/Cas9基因编辑系统对HEK293细胞系TSC1基因稳定敲除效果的实验鉴定

目的　利用成簇规律间隔短回文重复序列/ 成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（clustered regularly interspacedshort palindromic repeat/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas9）基因编辑系统在HEK293 细胞系中对TSC1 基因稳定敲除,并对其敲除效果进行鉴定。方法　根据TSC1 基因的序列设计sgRNA,将sgRNA 克隆到载体lentilCRISPRv2 上,将连接产物转化至Stbl3 感受态细胞,对菌液进行测序鉴定。将鉴定成功的lentiCRISPRV2-sgTSC1 质粒转染至HEK293细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,挑选单细胞克隆进行PCR 鉴定,选取条带单一的细胞株用Western blot 鉴定TSC1 基因的表达。结果　成功构建lentiCRISPRV2-sgTSC1-1/2 重组质粒,并利用该质粒完成对TCS1 基因的定点切割,Westernblot 结果显示细胞中无TSC1 表达。结论　用CRISPR/Cas9 系统成功构建TSC1 基因敲除的稳定细胞株,为后续实验奠定了基础。     

PLK1基因缄默在K562细胞凋亡中的作用

目的观察缄默PLK1基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对K562细胞内PLK1表达和细胞凋亡的影响,探讨PLK1在白血病发病中的作用,寻找更为有效的白血病治疗途径。方法设计合成针对PLK1基因1416~1436位点的shRNA片段,并将其克隆于绿色荧光蛋白的表达载体pEGFP-H1中,命名为pEGFP-H1/PLK1。通过电穿孔转染法将其导入K562细胞中,分为对照组、pEGFP-H1空载体转染组和pEGFP-H1/PLK1shRNA重组质粒转染组,转染后24,48h,分别通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞PLK1基因和蛋白水平的变化,以MTT方法测各组细胞的增殖活性,比色法检测各组细胞的半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白酶活性,并通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和G2/M期转变情况。结果PLK1mRNA相对水平(与内参的灰度比值)对照组为1.25±0.07,空载体转染24,48h组分别为1.21±0.08和1.23±0.09,shRNA重组质粒转染24,48h组分别为0.52±0.04和0.25±0.02,shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P<0.01)。各组细胞PLK1的蛋白水平变化趋势与PLK1mRNA表达相似。相应地,对照组、空载体转染48h组、shRNA重组质粒转染24,48h组的凋亡率分别为(8.3±0.6)%、(8.7±0.7)%、(49.7±3.8)%和(82.3±6.9)%,后两者与前两组之间差异有统计学意义(P<0.05)。此外,与对照组和空载体转染组相比,shRNA重组质粒转染组的细胞增殖能力明显下降(P<0.05),且位于G2/M期的细胞较对照组和空载体转染组显著增加。以上结果均于转染后48h时较明显(P<0.05)。结论构建的shRNA能明显抑制转染细胞PLK1的表达和增殖,并可促进转染细胞的凋亡,并使停留于G2/M期的细胞显著增加。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除ITGB6基因对人结肠癌HT-29细胞生物学行为的影响

目的 探讨整合素β6(ITGB6)基因敲除后对人结肠癌HT-29细胞生物学行为的影响。方法 通过CRISPR/Cas9技术构建ITGB6敲除的HT-29细胞（ITGB6-KO）作为敲除组,选择空白转染细胞作为对照组。通过Western blot法检测ITGB6表达,通过MTT实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验检测敲除ITGB6基因对HT-29细胞的增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力的影响。结果 Western blot和DNA测序结果显示CRISPR/Cas9技术有效敲除ITGB6基因。MTT实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭实验显示敲除ITGB6基因能够抑制HT-29细胞增殖能力、克隆形成能力和侵袭能力（P <0.01）。结论 CRISPR/Cas9技术能够有效建立敲除ITGB6基因的结肠癌HT-29细胞系,ITGB6敲除后HT-29细胞恶性生物学行为受到抑制,ITGB6基因有望成为结肠癌治疗的潜在靶点。     

基于CRISPR/Cas9技术构建人CLCN7基因编辑载体

目的为修复石骨症致病基因(CLCN7)进行前期探索,采用CRISPR/Cas9技术构建CLCN7基因编辑表达载体。方法根据sgRNA设计原则,在CLCN7外显子区设计一对sgRNA,合成四条单链DNA寡核苷酸,退火后连接于CRISPR/Cas9质粒的BspQ I酶切位点处,然后转染感受态大肠杆菌DH5α,并通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,扩大培养。结果最后经过PCR和Sanger测序鉴定获得了两个基因编辑表达载体CLCN7-sg1RNA-CRISPR-Cas9和CLCN7-sg2RNACRISPR-Cas9。结论基因编辑载体的成功构建为CLCN7突变修复提供了工作基础。     

RbAp46基因激活IGFBP-rP1基因在K562细胞中的表达

目的探讨视网膜母细胞瘤相关蛋白46(RbAp46)基因对白血病细胞的作用机制.方法将全长RbAp46基因的cDNA转染人白血病细胞系K562细胞及人脑膜胶质瘤细胞系SHG44细胞,建立稳定过度表达RbAp46基因的细胞株,观察细胞的生物学行为的同时,通过RT-PCR方法寻找表达差异的相关基因.结果过度表达RbAp46基因的K562细胞及SHG44细胞生长受抑.表现在K562/RbAp46细胞与K562/CMV细胞于生长第4天分别为(90.00±8.40)×104和(119.58±9.87)×104,SHG44/RbAp46细胞与SHG44/CMV细胞于生长第5天分别为(89.13±4.88)×104和(149.42±10.83)×104.生长第7天时,K562/RbAp46细胞和K562/CMV细胞集落数分别为131.67±15.57和250.33±26.31(P＜0.01),SHG44/RbAp46细胞和SHG44/CMV细胞集落数分别为50.78±6.77和206.67±37.18(P＜0.01).K562/RbAp46细胞与K562/CMV细胞S期细胞分别占(48.88±4.35)%和(62.78±4.78)%(P＜0.01),G0/G1期细胞分别占(29.10±4.14)%和(22.40±2.43)%(P＜0.05),而SHG44/RbAp46细胞与SHG44/CMV细胞G0/G1期细胞分别占65.6%和48.8%,S期细胞分别占22.6%和38.4%.过度表达RbAp46基因的K562细胞出现胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBP-rP1)基因的诱导性表达.结论在K562细胞中可能存在RbAp46和IGFBP-rP1基因之间的调控通路.     

SMIM1在Vel血型、肿瘤和疟原虫感染中的研究进展

小整合膜蛋白1(small integral membrane protein 1,SMIM1)基因编码Vel血型抗原,其外显子3中17个碱基对纯合缺失导致Vel抗原阴性。Vel阴性是稀有表型,对其准确鉴定对预防输血反应尤为重要。SMIM1蛋白除作为Vel血型抗原外,近年来生物信息学分析提示SMIM1可能是1种新的肿瘤标志物,参与众多肿瘤的发生发展。由于SMIM1蛋白与糖蛋白有类似结构,且在感染恶性疟原虫的红细胞中被磷酸化,推测SMIM1蛋白可能参与了疟疾的发展。因此,本文就近年来SMIM1和其编码蛋白在Vel血型、肿瘤和疟原虫感染方面的相关研究做一综述。     

K562和K562/DNR细胞中mdr1基因启动子甲基化状态的分析

目的　分析K5 6 2和K5 6 2 /DNR细胞中mdr1基因启动子甲基化模式及其与P gp表达的关系。方法　用流式细胞术和RT PCR方法检测两个细胞系中mdr1基因的表达 ,用亚硫酸氢钠脱氨基 DNA测序的方法分析mdr1基因启动子甲基化模式。结果　K5 6 2细胞不表达P gp ,mdr1基因启动子甲基化 ;K5 6 2 /DNR细胞P gp表达阳性 ,mdr1基因启动子非甲基化。 结论　K5 6 2和K5 6 2 /DNR细胞mdr1基因启动子甲基化模式不同 ,前者有甲基化修饰 ,后者无甲基化修饰 ,mdr1基因沉默与其启动子甲基化有关     

SCL/TAL-1基因沉默对EPO诱导的K562细胞红系分化的影响

目的 通过RNA干扰技术降低SCL/TAL-1 mRNA的表达,探讨SCL/TAL-1在K562细胞红系分化中的作用.方法 以EPO诱导白血病细胞系K562细胞向红系分化为模型,将靶向SCL/TAL-1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)慢病毒质粒pTRIP-dU3- RNAiTALh-EF1a-GFP转染K562细胞,RT-PCR检测其SCL/TAL-1和红系相关基因RhD、血型糖蛋白A(GPA,即CD253a)、CD47 mRNA表达水平变化,流式细胞术分析红系分化抗原CD71、CD253a的表达,并以空载体质粒pTRIP-dU3- RNAiluc-EF1-GFP转染的K652细胞为对照.结果 ①通过慢病毒转染系统将含SCL/TAL-1 shRNA的质粒及空载体质粒转染K562细胞48 h,绿色荧光蛋白(GFP)+细胞占总细胞的95%以上,表明感染率达到95%以上.②RT-PCR结果显示转染特异性shRNA的K562细胞SCL/TAL-1 mRNA表达水平比空载体对照明显下调(P<0.05),红系抗原CD47和RhD mRNA水平也比对照组明显下调(P<0.05),GPA有所下降,但没有CD47和RhD下降程度大.③流式细胞术检测到SCL/TAL-1低表达组红系分化抗原CD71、CD235a表达降低,表达率分别是10.4%、76.5%,而在对照组的表达率分别为94.3%、83.6%.结论 研究结果提示转录因子SCL/ TAL-1参与了红系定向分化.     

CIAPIN1基因对K562细胞增殖能力的影响

本研究旨在探讨CIAPIN1基因对慢性髓系白血病（CML）细胞系I（562细胞增殖能力的影响。针对C1APIN1基因构建shRNA真核表达载体并稳定转染K562细胞,用real—timePCR和Westernblot技术验证干扰效率,采用MTT法检测K562细胞的增殖活性的改变,利用甲基纤维素集落形成实验观察K562细胞集落形成大小和数量的变化,通过体内实验观察K562细胞在小鼠体内的成瘤能力。结果表明,与对照组相比,K562细胞的CIAPIN1基因表达被有效抑制;干扰CIAPIN1基因后K562细胞的增殖活性明显下降,集落形成数量减少和集落大小显著减小,小鼠体内成瘤能力明显降低。结论：干扰CIAP删基因表达能抑制K562细胞在体内及体外的增殖能力。     

CRISPR/Cas9 gene editing for curing sickle cell disease

Sickle cell disease (SCD) is the most common monogenic blood disorder marked by severe pain, end-organ damage, and early mortality. Treatment options for SCD remain very limited. There are only four FDA approved drugs to reduce acute complications. The only curative therapy for SCD is hematopoietic stem cell transplantation, typically from a matched, related donor. Ex vivo engineering of autologous hematopoietic stem and progenitor cells followed by transplantation of genetically modified cells potentially provides a permanent cure applicable to all patients regardless of the availability of suitable donors and graft-vs-host disease. In this review, we focus on the use of CRISPR/Cas9 gene-editing for curing SCD, including the curative correction of SCD mutation in β-globin (HBB) and the induction of fetal hemoglobin to reverse sickling. We summarize the major achievements and challenges, aiming to provide a clearer perspective on the potential of gene-editing based approaches in curing SCD.     

RHD基因的克隆及其在K562细胞中的表达

本研究目的在于克隆人类红细胞RHD基因，构建RhD表达载体，观察其在K562细胞中的表达。从脐血网织红细胞中提取总RNA，采用逆转录聚合酶链反应扩增RHD／CE基因，扩增产物通过TA连接克隆到pGEM-T质粒，采用测序方法筛选多个克隆获得RHD基因。将获得的RHD基因进一步亚克隆构建pcDNA3．1(-)表达载体。重组表达载体通过superfect试剂盒转染K562细胞，最后观察K562细胞中RHD基因的转录和表达。结果表明：成功分离克隆到RHD基因，构建的pcDNA3.1(-)重组表达载体经酶切和测序证实RHD cDNA序列及插入方向正确。转染后的K562细胞内有相应的mRNA转录，细胞表面有RhD抗原表达。结论：RHD cDNA转染的K562细胞能表达RhD抗原，该表达体系有助于进一步研究各种RhD变异型的分子基础。     

特异性抑制Aqp1基因对K562细胞生长的抑制作用

本研究探讨靶向aqp1(aquaporin 1)基因的siRNA对K562细胞生长的抑制作用。设计siRNA,转染K562细胞,在相差显微镜观察细胞形态变化;用MTT法观察aqp1-siRNA对K562细胞活力的影响;使用流式细胞仪、DNA片段化分析K562细胞凋亡;用RT-PCR半定量检测转染前后aqp1基因表达。结果表明:苏木素-伊红染色后,细胞呈现明显的凋亡形态;转染24小时后aqp1-siRNAs对K562细胞的活性有显著抑制作用;aqp1-siRNA转染K562细胞后可见明显的凋亡峰,24、48和72小时的细胞凋亡率持续上升,分别为24.2%、36.1%和42.9%;48小时后aqp1-siRNA组出现明显的DNA凋亡"梯形电泳带";aqp1基因的表达水平在aqp1-siRNA转染后24、48和72小时,分别减少了33%、46%和57%。结论:aqp1-siRNA能够抑制K562细胞的增殖,诱导其凋亡,可作为治疗恶性肿瘤的新靶点。     

DLL4/Notch1配体过表达抑制K562细胞生长机制研究

本研究旨在探讨Notch1信号通路的配体delta-like ligand4（DLL4）基因过表达对K562细胞增殖的影响及其可能的作用机制.采用脂质体介导将含配体DLL4基因的质粒pBudCE4.1-DLL4转染K562细胞,通过RT-PCR和Western blot检测转染48 h后DLL4基因的mRNA及蛋白表达,同样检测转染后Notch1受体胞内区（NICD）、下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达;通过Western blot检测与Notch信号通路相关的细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达水平;用CCK-8法检测转染后细胞的增殖情况;用流式细胞术检测转染质粒48 h后各组细胞的凋亡情况.结果表明,DLL4基因转染后的K562细胞中DLL4、NICD及下游靶基因Hesl的mRNA及蛋白表达量比对照组明显增多（P＜0.05）,说明DLL4的过表达激活了Notch1信号通路;Western blot方法检测显示,DLL4的转染增加了细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达,从而抑制了K562细胞的生长,诱导细胞周期停滞于G1期及细胞凋亡的增加.结论：外源性DLL4基因过表达可有效活化K562细胞内Notch1信号通路,可能通过YY1、C-MYC及Rb等Notch信号通路相关基因的高表达诱导K562细胞的生长减慢及细胞凋亡.