三种不同乳鼠原代心肌细胞消化分离方法的对比研究

【摘要】 目的 对比研究三种乳鼠原代心肌细胞消化分离方法,比较不同方法分离获取的心肌细胞在数量、纯度、活力上的差异,为相关实验研究提供选择。方法 按照不同的消化方法进行分组,A组为0.08%胰蛋白酶单纯消化组;B组为0.08%胰蛋白酶+0.08%Ⅱ型胶原酶混合消化组;C组为0.08%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型胶原酶分离消化组。记录差速贴壁后的细胞数和活细胞率,对贴壁24 h后的心肌细胞进行免疫荧光染色,计算心肌细胞纯度,通过激光共聚焦显微镜对JC-1染色的心肌细胞进行线粒体膜电位检测,比较红绿荧光密度的差异,通过能量代谢间接反映细胞活力。结果 三种方法分离获得的心肌细胞数差异无统计学意义（P >0.05）,而活细胞率C组高于A组（P <0.01）;三组分离获得的心肌细胞纯度差异无统计学意义（P >0.05）;线粒体膜电位,A组荧光比值为0.928±0.078,B组荧光比值为0.943±0.099,C组荧光比值为1.160±0.089,三组之间差异有统计学意义（P <0.01）,C组线粒体膜电位高于A组和B组（P <0.01）。结论 三种消化方法在细胞数和细胞纯度上无明显差异,0.08%胰蛋白酶和0.08%Ⅱ型胶原酶分离消化的心肌细胞在活细胞率和细胞活力方面更优,可以作为常规的乳鼠心肌细胞分离方法的选择。     

人卵巢颗粒细胞原代培养方法的比较

目的 对比5种不同方法分离人卵巢颗粒细胞的效果,并选择出高效、稳定的分离纯化、体外培养的有效方法.方法 收集不孕症患者行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)穿卵时的卵泡液,采用裂解法、裂解+胰酶法、密度梯度离心法(包括Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶)分离颗粒细胞后进行活细胞计数,卵泡生成素免疫组化染色鉴定,MTT法检测细胞增殖能力,检测颗粒细胞体外分泌雌激素含量.结果 在使用不同方法分离颗粒细胞时,Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶3种方法得到细胞数量多于裂解法及裂解+胰酶法(P<0.05).各种分离方法的细胞生长趋势并无明显差异.裂解法、裂解+胰酶法雌激素含量高于Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶(P<0.05).结论 5种方法均成功分离得到颗粒细胞,但每种方法各有优缺点,根据实验目的不同需选择不同的方法.     

改良组织块贴壁法培养小鼠气道平滑肌细胞及鉴定

目的 采用改良组织块贴壁法建立小鼠气道平滑肌细胞体外培养模型。方法 用I型胶原酶消化小鼠气道平滑肌组织块后再贴壁，培养出的小鼠原代气道平滑肌细胞经过细胞免疫荧光技术鉴定。结果 相比单纯组织块贴壁法，改良组织块贴壁法获得的原代平滑肌细胞的纯度更高[（93.0%±1.8%）vs(96.1%±1.8%),P<0.01]，酶消化法获得的平滑肌细胞的纯度（90.8%±1.9%）最低，与改良组织块贴壁法相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果还显示P5代细胞与P1代细胞相比，平滑肌细胞生长形态较前改变，呈不规则形，且α-SMA阳性表达减弱，Vimentin阳性表达增强，标志着平滑肌细胞的纯度会随传代次数增加而逐渐降低。酶消化法获得的ASMCs的增殖速度较单纯组织块贴壁法和改良组织块贴壁法获得的ASMCs的增殖速度慢（P<0.01）。结论 改良组织块贴壁法经济稳定，可在短期内培养出数量多、纯度高、活性好的小鼠气道平滑肌细胞，此法成功建立了体外培养小鼠气道平滑肌细胞的模型。     

The culture of primary cardiac cells

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.     

原代心肌细胞培养

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察。方法:取出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度。结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92%,纯度90%,2～3 d出现同步搏动。结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

目的:探讨更为简便的新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的数量、存活率和纯度.方法:用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化,分离新生大鼠心肌细胞,进行体外培养,观察心肌细胞形态学变化,并以细胞免疫荧光进行心肌细胞纯度鉴定.结果:心肌细胞分离良好,收获细胞数量及存活率高,可贴壁搏动生长,免疫荧光显示培养的心肌细胞纯度达95%以上.结论:改良的细胞培养技术可获得生长状态良好的心肌细胞.     

成年小鼠心室肌细胞分离及L型钙电流记录

目的:寻找一种成年小鼠心肌细胞分离的简便、可行且稳定的方法,以获得耐钙心肌细胞并记录心室肌细胞L型钙电流(IL-Ca)。方法:采用Langerdorff逆行主动脉灌流、无钙台氏液+胶原酶Ⅱ消化法分离成年小鼠单个心室肌细胞;利用含钙细胞外液复钙法筛选耐钙心肌细胞;并采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞L型钙电流。结果:利用该方法分离心肌细胞可获得90%活细胞;复钙后细胞存活率60%-70%;并可记录到典型L型钙电流。结论:无钙台氏液+胶原酶Ⅱ消化法简单可行且稳定,可分离大量活性较佳且耐钙心肌细胞,可用于心肌细胞离子通道电流记录,从而为心脏电生理研究提供有力的技术支持。     

机械法和胰酶法分离大鼠卵巢颗粒细胞的比较

目的 探讨胰酶法分离大鼠卵巢颗粒细胞的优势。方法 取3～4周龄雌性SD大鼠的卵巢,分别采用机械法和胰酶法分离颗粒细胞并进行培养。机械法：于40倍解剖显微镜下用针头刺破卵巢成熟的卵泡,将含有卵巢剩余组织及卵泡液的培养液用200目滤网过滤;胰酶法：用无菌眼科剪将卵巢剪成小于2 mm³的小碎块,然后加入0.25%胰酶,室温消化1 h后,将含有卵巢碎块的消化液用200目滤网过滤。比较这2种分离方法获得的细胞数量、细胞活力,及雌二醇和孕酮的分泌情况。结果 机械法和胰酶法这2种方法分离的原代大鼠卵巢颗粒细胞存活率均>90%。将细胞培养1～9 d,除24 h外,其余各时间点胰酶法分离的细胞增殖率均高于机械法;胰酶法细胞增殖率峰值出现时间早于机械法24 h,并且胰酶法分离的细胞最大增殖率[72 h：（210.09±0.95）%]高于机械法[96 h：（180.50±0.74）%],差异有统计学意义（P<0.05）。胰酶法分离的细胞激素的最大分泌量、每日平均分泌量及分泌总量均高于机械法,差异均有统计学意义（P均<0.05）。结论 胰酶法分离的大鼠卵巢颗粒细胞在细胞活力和激素分泌功能方面均优于机械法,值得在卵巢早衰的研究中推广使用。     

SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进

目的:探讨SD乳鼠原代心肌细胞最佳分离、纯化及培养方法,以提供可靠的心肌细胞模型。方法:用含0.1%的胰蛋白酶及0.1%Ⅱ型胶原酶的酶混合液分离乳鼠心脏组织,并用差速贴壁分离法和5-溴脱氧尿核苷抑制法进行纯化,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化,免疫组织化学染色方法检测心肌细胞的纯度。结果:台盼蓝染色观察细胞存活率达(96.9±8.9)%以上。显微镜下心肌细胞由圆形渐变为梭形、多边形,逐渐形成细胞簇,搏动频率约120～150次/min。用抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体鉴定心肌细胞,阳性率为(90.5±1.6)%。结论:本方法所获SD乳鼠的心肌原代细胞纯度高、活力强。     

血管紧张素Ⅱ诱导的新生小鼠心肌细胞肥大模型

目的 探索新生小鼠心肌细胞的原代培养方法,建立血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的小鼠心肌细胞肥大模型。方法 使用0.03%的胰酶+0.04%的2型胶原酶多次消化分离心肌细胞,差时贴壁法纯化心肌细胞。1μmol/L AngⅡ刺激心肌细胞肥大,α-actinin染色进行心肌细胞纯度鉴定及面积检测,实时定量RT-PCR检测心肌细胞肥大标志物的表达,Western blot法检测蛋白质磷酸化水平。结果 培养得到的小鼠心肌细胞具有较高纯度及存活力;AngⅡ刺激后心肌细胞面积增大、蛋白合成增加,ANP、BNP、β-MHC等心肌细胞肥大标志物的mRNA表达水平较对照组明显升高(P<0.05),而α-MHC表达则下降(P<0.05);此外,AngⅡ刺激组ERK、JNK与p38的磷酸化水平较对照组明显上调(P<0.05)。结论 使用改良的新生小鼠心肌细胞原代培养方法,成功培养了具有较高纯度及存活力的小鼠心肌细胞,并建立了AngⅡ诱导的小鼠心肌细胞肥大模型。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。