缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑Nogo受体水平及NEP1-40的神经保护作用

目的 探讨缺氧缺血性脑损伤(HIBI)新生大鼠脑Nogo受体表达及Nogo受体拮抗剂NEP1-40的脑保护作用.方法 采用随机数字表法将80只7日龄大鼠随机分为对照组、HIBD组、GM-1组和NEP1-40组.正常对照组及HIBD模型组腹腔注射生理盐水0.25 ml/kg,NEP1-40组、GM-1组分别注射5 g/L NEP1-40、2.5μl/d,40 g/LGM-10.25 ml/(kg·d),视分组情况连用3 d或7 d.采用原位杂交法检测各组大鼠脑组织24 h、72 h及7 d NgR-mRNA表达水平,透射电镜观测其脑神经元与轴突的变化.多个样本率总体比较采用χ~2检验,组间均数多重比较采用LSD-t检验,数据均采用SPSS10.0统计软件包处理,以P<0.05有统计学意义.结果 HIBD组、GM-1组和NEP1-40组各时期脑组织NgR水平均低于对照组(t值分别为5.48、6.11、6.96、8.24、5.99和5.34,均P<0.05),三组间24 h NgR水平差异无统计学意义(t值分别为1.48、2.76和1.29,均P>0.05),而NEP1-40组72 h与7 d NgR水平低于同时期HIBD组、GM-1组;GM-1治疗后脑组织神经元得到不同程度的修复,而NEP1-40治疗后神经元修复良好,轴突再生明显.结论 缺氧缺血性脑损伤后脑NsR水平下调,NEP1-40可促进脑损伤的修复,发挥脑保护作用.     

缺氧缺血性脑损伤新生大鼠巨噬细胞移动抑制因子的表达

目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠中的作用及可能机制.方法 健康7日龄新生SD大鼠共120只.随机分为3组,分别为假手术组、HIBD组、抗MIF中和抗体干预组(anti-MIF组,缺氧缺血后即予抗MIF中和抗体5 mg·kg-1腹腔注射),每组40只.于HIBD模型制成后6 h、12 h、24 h,3 d及7 d处死,应用免疫组织化学法(SP法)观察各组脑缺血侧皮质区MIF及核因子-κB(NF-κB)蛋白的表达,双抗夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组缺血侧脑组织匀浆TNF-α水平.结果 HIBD组新生大鼠脑组织皮质区MIF、TNF-α表达均在缺氧缺血6 h明显增加,24 h达高峰(Pa<0.01),7 d时恢复正常,与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05);HIBD组NF-κB表达在缺氧缺血6 h开始增加,24 h达高峰,并维持至3 d(Pa<0.01),7 d降至正常,与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05);anti-MIF组大鼠脑组织MIF、NF-κB、TNF-α的表达与HIBD组比较,在各个实验时间点均有降低(Pa<0.01).结论 MIF可能通过调控NF-κB的途径影响其脑皮质TNF-α水平,从而介导缺氧缺血后新生大鼠脑组织的炎性损伤.     

枸橼酸咖啡因对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后神经细胞增生与凋亡及长期学习能力的影响

目的研究枸橼酸咖啡因(CC)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后神经细胞增生与凋亡及长期学习记忆能力的影响。方法 7日龄SD新生大鼠随机分为假手术组、HIBD组、CC组,每组16只;HIBD组及CC组经左颈总动脉结扎并缺氧制作HIBD模型,CC组在HI前、HI后0 min、24 h、48 h、72 h给予CC 20 mg/kg腹腔注射,假手术组和HIBD组分别在同一时间点给予等量生理盐水腹腔注射;同时从生后10日龄起腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)标记新生细胞,剂量50 mg/kg,每12 h 1次,共5次。12日龄时每组随机选取8只大鼠处死,免疫组织化学染色检测海马齿状回颗粒下层5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)和海马CA1区活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(活化Caspase-3)的表达情况,TUNEL法测定海马CA1区神经细胞凋亡情况,其余各组大鼠28日龄时行Y迷宫学习和记忆能力测试。结果三组新生大鼠脑组织中均可见Brd U阳性细胞,差异有统计学意义(F=101.38,P0.01);HIBD组、CC组Brd U阳性细胞数均较假手术组增多,差异有统计学意义(P0.05)。三组新生大鼠海马CA1区均可见活化Caspase-3阳性细胞,差异有统计学意义(F=379.77,P0.01);CC组活化Caspase-3阳性细胞较HIBD组显著减少,但仍多于假手术组,差异有统计学意义(P0.05)。三组新生大鼠海马CA1区中均可见TUNEL阳性细胞,差异有统计学意义(F=505.92,P0.01),以HIBD组最多,假手术组最少,两两比较差异均有统计学意义(P0.05)。Y迷宫实验结果,各组大鼠达标所需训练总次数的差异有统计学意义(F=32.05,P0.01),以HIBD组所需训练次数最多。24 h后正确反应率在三组间的差异也有统计学意义(F=24.99,P0.01),以HIBD组大鼠正确反应率最低。结论枸橼酸咖啡因可以改善HIBD大鼠长期学习记忆力,其机制可能与通过减少缺氧缺血后神经细胞的凋亡有关。     

脑室注射Nogo-A抗体对HIBD新生大鼠脑组织神经细胞再生的影响

目的：Nogo-A对中枢神经轴突的生长具有很强的抑制作用,而Nogo-A特异性抗体IN-1能中和这种抑制性蛋白,从而促进损伤轴突的再生。该文旨在探讨脑室注射Nogo-A抗体（IN-1）对缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠脑组织神经细胞再生的影响。方法: 建立新生大鼠HIBD模型,随机分为IN-1组和人工脑脊液组,每组20只,前者脑室注射IN-1 10 μL,后者脑室注射人工脑脊液10 μL,另外选择20只新生大鼠为假手术组,只施行颈部手术分离颈总动脉,但不结扎,不做缺氧缺血处理。应用免疫组织化学ABC法结合图像分析研究其脑组织Nogo-A及GAP-43蛋白表达水平。结果:IN-1组新生鼠脑组织Nogo-A蛋白表达弱于人工脑脊液组,前者Nogo-A免疫组化阳性细胞数（28.61±1.70）也较后者（39.52±1.40）明显减少,两者比较差异具有显著性（P<0.01）;IN-1组Nogo-A免疫组化阳性细胞数明显少于假手术组（32.78±1.87）,两者比较差异具有显著性（P<0.01）;而人工脑脊液组（39.52±1.40）明显多于假手术组（P<0.01）。IN-1组GAP-43蛋白的表达（31.14±1.88）强于人工脑脊液组（27.73±1.43）,两组GAP-43免疫组化阳性细胞数比较差异具有显著性（P<0.01）;IN-1组及人工脑脊液组GAP-43免疫组化阳性细胞数明显少于假手术组（33.64±1.24）,差异均有显著性（P<0.01）。结论: Nogo-A抗体可导致HIBD新生大鼠脑组织Nogo-A蛋白表达明显减少,对神经细胞再生的抑制作用减弱。而脑组织神经细胞GAP-43表达增强,提示神经细胞再生作用增强。［中国当代儿科杂志,2007,9（4）：301-304］     

褪黑素对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的保护作用

目的 探讨褪黑素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的保护作用及其机制.方法 7日龄Wistar大鼠54只结扎左侧颈总动脉,吸入氧氮混合气体55 min制作HIBD模型,随机分成正常对照组、HIBD组和褪黑素治疗组,每组18只.正常对照组既不结扎亦不缺氧,褪黑素治疗组在缺氧缺血前30 min予褪黑素15 mg·kg-1 腹腔注射.在缺氧缺血24 h,取每组6只脑组织匀浆用于半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3活性测定,其余每组6只在缺氧缺血72 h取其脑进行石蜡包埋,并进行半胱天冬酶-3、凋亡诱导因子(AIF)及微管相关蛋白-2(MAP-2)的免疫组织化学染色,上述指标用于计算脑梗死体积和海马CA1神经元的丢失,HE染色用于计算脑损伤积分.结果 缺氧缺血24 h,HIBD组新生大鼠脑组织半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3活性均明显高于正常对照组(Pa<0.05),给予褪黑素治疗后,半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3活性均明显下降(Pa<0.05);72 h时褪黑素治疗组半胱天冬酶-3和AIF的阳性细胞计数均明显下降(Pa<0.05);褪黑素治疗组脑损伤积分、脑梗死体积、CA1神经元丢失均显著下降(Pa<0.05).结论 褪黑素对HIBD有保护作用,其机制与抑制神经细胞凋亡有关.     

缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织MMP-9和TIMP-1表达的动态变化研究

目的 探讨新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的发生机制.方法 建立新生大鼠HIBD模型,随机分为假手术组及HIBD 6 h、12 h、24 h、48 h、72 h组,每组6只.观察脑组织大体病理学改变.采用Real-time Q-PCR方法测定大鼠脑组织MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表达.结果 (1)新生大鼠HIBD后12～48 h脑水肿明显,可见点状软化坏死灶.(2)假手术组大鼠MMP-9 mRNA表达水平极低,HIBD组大鼠在缺氧缺血6 h表达开始增高,24 h达高峰,此后渐渐下降,但72 h仍维持较高的水平,与假手术组相比差异有非常显著性(P＜0.01).(3)假手术组大鼠TIMP-1 mRNA表达水平极低,HIBD组大鼠在经历缺氧缺血6、12、24h,TIMP-1 mRNA表达水平有微弱升高,与假手术组相比差异有显著性(P＜0.05),但48 h后TIMP-1 mRNA表达下降到假手术组水平(P＞0.05).(4)MMP-9 mRNA/TIMP-1 mRNA比值在假手术组接近1:1,HIBD组缺氧缺血12 h后比值升高,在48 h达到高峰,72 h有所下降,但仍高于假手术组(P＜0.01).结论 新生大鼠HIBD后可诱导MMP-9 mRNA表达,而MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表达的失衡可能参与了HIBD的发病过程.     

缺氧缺血性脑损伤新生大鼠心肌细胞凋亡及凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达的变化

目的 了解缺氧缺血性脑损伤新生大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的变化.方法 通过结扎7 日龄新生大鼠一侧颈总动脉,吸入低浓度氧复制缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的动物模型,并没假手术对照(NC)组,两组分别于HIBD后1 h、4 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d取心脏组织,应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡,SP法检测心肌细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达.结果 NC组偶见心肌阳性凋亡细胞1～4个/mm~2,各时间点阳性细胞数差异无统计学意义(F=0.5,P>0.05).HIBD组12 h心肌阳性凋亡细胞开始增多,为(14.40±3.21)个/mm~2;72h达高峰,为(26.80 ±2.28)个/mm~2,12～72 h各时间点阳性凋亡细胞明显高于NC组(P<0.05);7 d阳性细胞数减少,但仍高于NC组.NC组大鼠心肌组织Bax呈阳性表达,Bcl-2呈弱阳性表达.HIBD组Bax于24 h开始增高.72 h表达最明显,7 d时表达有所降低,24 h～7 d表达高于NC组(P<0.05);Bel-2于24 h表达开始增高,以后缓慢增高,72 h达高峰,24 h～7 d较NC组表达增高,差异有统计学意义(P<0.05).HIBD组Bcl-2/Bax比值逐渐降低.Bax、Bcl-2的表达与凋亡细胞数之间均星直线正相关(r=0.921、0.980,P均<0.01).Bcl-2/Bax的比值与凋亡细胞数无相关性(r=0.702,P>0.05).结论 HIBD新生大鼠心肌细胞存在凋亡,心肌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达增加,且与心肌细胞凋亡有关.     

心肌营养素-1在窒息新生大鼠心肌和外周血血浆中的表达及神经调节蛋白-1的干预作用

目的 探讨心肌营养素-1(CT-1)在窒息新生大鼠心肌和外周血血浆中的表达,以及神经调节蛋白-1(NRG-1)的干预作用.方法 新生7日龄大鼠90只,随机分成窒息组(n=40)、正常对照组(n=10)和NRG-1预处理组(n=40).采用颈动脉结扎联合缺氧法制备新生大鼠窒息模型.NRG-1预处珲组在缺氧缺血前30 min腹腔注射1 mg/kg NRG-1.分别在造模后6,12、24、48 h各时间点取其外周血和左心室前壁心肌,酶联免疫吸附法榆测其外周血血浆CT-1蛋白的表达.采用Western blot检测其心肌CT-1蛋白表达.结果 窒息组新生大鼠外周血血浆CT-1的表达在各时间点均显著高于正常对照组,24 h达到高峰(Pa<0.05);窒息后24 h,新生大鼠外周血血浆CT-1的表达与CK-MB水平呈显著正相关(r=0.733 P<0.01).窒息后新生大鼠心肌中CT-1的表达逐渐增加,在各时间点均显著高于正常对照组(Pa<0.05).其心肌中CT-1蛋白表达量在24 h组(1 211.9±237.7)(P<0.05);窒息后24 h,NRG-1预处理组外周血血浆CT-1蛋白表达[(1 287.7±18.9)ng/L]显著高于窒息组[(712.5±24.6)ng/L](P<0.05).结论 窒息可导致新生大鼠心肌和外周血血浆CT-1的表达增加.CT-1可能为心肌细胞损害的诊断提供一个新的检测指标.NRG-1可通过诱导CT-1表达上调,产生保护心肌的作用.     

Bax抑制肽对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用

目的通过观察Bax抑制肽(BIP)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)后神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的影响,了解其对新生大鼠脑的保护作用。方法 7日龄Wistar大鼠随机分成假手术(Sham组)、BIP组、HIBD组,HIBD造模后在不同时间点进行皮质脑组织染色、免疫组化检测,观察细胞凋亡、NSE的表达。结果与Sham组相比,HIBD组大鼠脑组织凋亡病理改变明显,BIP组则有明显改善。HIBD组和BIP组大鼠NSE阳性细胞数随观察时间推移逐渐减少,差异均有统计学意义(P均0.05)。48 h、96 h和7 d时NSE阳性细胞数在三组间的差异均有统计学意义(F=45.35~81.66,P均0.01),其中48 h、96 h和7 d时,HIBD组NSE阳性细胞数均少于Sham组和BIP组;96 h和7 d时,BIP组NSE阳性细胞数均少于Sham组,差异均有统计学意义(P0.05)结论 BIP能减轻新生大鼠HIBD大脑皮质区神经细胞的凋亡,具有早期的神经保护作用。     

人胰岛素样生长因子-1基因修饰的神经干细胞移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的治疗作用

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因修饰神经干细胞(NSCs-IGF-1)移植对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑功能恢复的治疗作用.方法 采用结扎大鼠左侧颈总动脉,低氧箱中缺氧处理的方法,制成新生大鼠HIBD模型,随机分为正常对照组、模型对照组、神经干细胞(NSCs)移植组和NSCs-IGF-1移植组,尾静脉注入法进行干细胞移植.分别于移植1 d、7 d、14 d、21 d 取5只大鼠脑组织进行病理切片,通过5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色观察NSCs在宿主脑内存活及增殖和分化情况,并通过Y-迷宫实验和运动功能检测对剩余大鼠脑功能恢复情况进行观察.结果 移植7 d后,NSCs移植组和NSCs-IGF-1移植组均可见到BrdU阳性细胞,二组比较差异有统计学意义(P<0.05).在观测时间点内,NSCs-IGF-1移植组Nestin阳性细胞表达量早期升高,移植后14 d达峰值,后逐渐下降;NSE阳性细胞表达量逐渐升高.模型对照组在移植7 d后Nestin及NSE阳性细胞表达量逐渐降低,2组比较差异均有统计学意义(Pa<0.01).移植14 d,NSCs-IGF-1移植组Nestin及NSE阳性细胞表达量均明显高于NSCs移植组(Pa<0.01).大鼠学习记忆功能检测及运动功能检测结果均显示NSCs-IGF-1移植组明显优于模型对照组及NSCs移植组,二者差异均具有统计学意义(Pa<0.01,0.05).结论 NSCs及NSCs-IGF-1可以在脑内存活、增殖及分化,并可部分促进缺氧缺血大鼠脑功能的恢复;NSCs-IGF-1较单独移植NSCs效果好.