慢病毒介导的RNA干扰技术建立hPARP-1缺陷细胞株

聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP ribose polymerase,PARP)是真核细胞生物体内一类重要的DNA损伤修复酶家族.其在各种生物效应引起的DNA断裂的活化下,产生聚(ADP-核糖)合成活性与聚(ADP-核糖)转移活性,将ADP核糖单位转移至某些氨基酸残基上,对蛋白质进行修饰,继而产生各种不同的生物学效应[1].     

TC-1蛋白高表达对子宫内膜腺癌细胞凋亡的影响

目的 构建甲状腺癌相关基因1(TC-1)基因的高表达真核表达系统pTRE3G-TC-1,获得重组高表达TC-1蛋白的子宫癌细胞株HEC-TC1,检测TC-1蛋白高表达时对子宫内膜腺癌(HEC)细胞凋亡的抑制作用,为进一步对TC-1基因或蛋白功能及药物研究提供良好模型.方法 采用真核表达载体p3FLAG-CMV构建表达TC-1基因的质粒,脂质体法转染HEC细胞,检测高表达TC-1蛋白,然后用同样的基因,构建pTRE3G-TC-1表达载体,转染HEC细胞,经数周筛选,获得稳定高表达TC-1蛋白的单克隆细胞株HEC-TC1,采用流式细胞术检测该蛋白对HEC细胞的凋亡影响.结果 获得了稳定高表达TC-1蛋白的单克隆细胞株HEC-TC1.免疫组化结果显示在子宫内膜癌组织中癌细胞上具有C8ORF4蛋白高表达现象.C8ORF4蛋白在子宫内膜癌细胞中,胞内与核内均有表达,但转染激活后该基因在胞内与核内有更高表达并具有生物活性;检测转染后激活的高表达C8ORF4基因的细胞株HEC-TC1分别在0h、24h、48h与对照组未转染的HEC细胞比较,转染后C8orf4高表达细胞凋亡数显著少于未高表达组,C8orf4基因表达的蛋白对肿瘤细胞凋亡有显著抑制作用.结论 获得高表达TC-1基因的细胞株,检测该基因对HEC细胞的凋亡具有显著抑制作用,C8ORF4基因可能参与调控HEC细胞凋亡过程.     

RNA干扰技术建立人PARP-1缺陷细胞株

目的建立并鉴定聚ADP核糖聚合酶1(hPARP1)缺陷细胞株,用于研究hPARP1基因的作用机制及其缺陷与DNA损伤发生的关系。方法将用已经构建的pEGFPC1shRNA(包含两个PARP1基因及一个阴性对照)转染支气管上皮细胞(16HBE),使之在16HBE中表达,转染后命名为16HBEP1、16HBEP2及16HBEN。用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hPARP1基因的表达水平。结果pEGFPC1shRNA在真核细胞成功表达;16HBEP1和16HBEP2的蛋白表达水平分别下降了84.3%及63.7%。结论hPARP1缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hPARP1基因功能研究提供了一种有效手段。     

稳定表达GRIM-19的Hela细胞株的建立及其对STAT3的抑制作用

目的:建立Grim-19基因稳定表达的人子宫颈癌Hela细胞株,探讨Grim-19及其对下游基因STAT3表达的影响。方法:将构建好的质粒采用脂质体法转染人子宫颈癌Hela细胞株,经G418筛选,得到稳定表达Grim-19的Hela细胞株,并分别通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western-blot)检测Grim-19及其下游基因STAT3的表达。结果:成功建立了高表达GRIM-19的Hela/Grim-19细胞株,并在mRNA与蛋白水平上均发现Grim-19在转染细胞中的高表达和其下游基因STAT3表达的明显下调。结论:上调子宫颈癌Hela细胞Grim-19的表达对STAT3的表达有抑制作用。     

ERCC1密码子118单核苷酸多态性转染细胞模型建立

目的 建立切除修复交叉互补集团1(ERCC1)基因单核苷酸多态性(SNP)转染细胞模型,为体外研究基因多态性功能提供平台.方法Gateway定向克隆技术构建ERCC1表达载体,包含不同ERCC1 codon 118 SNP表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)缺陷型UV20细胞,蛋白免疫印迹法(western blot)检测ERCC1蛋白表达,焦磷酸短序列测序PSQ检测ERCC1 118 SNP基因型.结果酶切鉴定及测序分析表明ERCC1表达载体构建正确,各转染细胞表达绿色荧光蛋白并可在G418培养基选择生长;ERCC1在UV20细胞中表达分子量为38 kDa蛋白,ERCC1SNP基因型正确,2种转染细胞ERCC1的SNP基因型不同,分别为C/C或T/T.结论 ERCC1 codon 118 SNP细胞转染模型构建成功,为体外研究ERCC1 codon 118 SNP不同基因型提供了实验技术平台.     

全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

乙肝病毒preS1基因与截短C基因真核表达载体构建及表达

目的建立乙型肝炎病毒（HCV）preS1基因与截短C基因真核表达载体，并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因，克隆入真核表达载体pcDNA3．1（-）后测序鉴定，并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-Ct-preS1，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3．1（-）-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体，可在CHO细胞中瞬时表达，为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。     

THY1基因影响上皮性卵巢癌SKOV3细胞株生长的体内和体外实验研究

目的构建THY1基因真核表达载体，并转染卵巢癌细胞株SKOV3，观察重组载体在体内和体外对SKOV3生长的影响。方法本研究于2005年3月至2007年3月通过目的基因克隆、载体构建技术构建重组载体pcDNA3．1（＋）-THY1，转染SKOV3（SKOV3-THY1组），同时设空载体转染组（SKOV3-Null组）和空白对照组（SKOV3组），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）测定法及流式细胞术检测细胞生长及细胞周期变化；并建立雌性裸鼠异体移植卵巢癌模型，观察瘤体生长速率。结果PCR、酶切及DNA测序证实，THY1基因正确插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），RT—PCR和蛋白质斑迹法（Westernblot）证实重组载体已整合于SKOV3；SKOV3-THY1组细胞抑制率明显高于SKOV3-Null组（P〈0．05）；建立裸鼠致瘤模型4周后，SKOV3-THY1组瘤体体积较SKOV3-Null组和SKOV3组显著降低（P〈0．05）。结论THY1真核表达载体能抑制SKOV3的恶性增殖，THY1基因可能在上皮性卵巢癌发生发展中起重要作用。     

c-Jun氨基末端激酶1反义真核表达载体及其蛋白缺陷细胞株的构建与鉴定

目的 构建反义JNK1荧光真核细胞表达载体,建立JNK1蛋白缺陷人胚肺成纤维细胞(HELF)株.方法 用Trizol试剂抽提HELF细胞中总RNA,以反转录PCR扩增JNK1目的 片断,双酶切,纯化PCR产物后,反向插入pEGFP-C1绿色荧光质粒,构建反义pEGFP-C1-asJNK1真核表达载体;大量抽提质粒并转染至HELF细胞中.24 h后使用G418筛选,挑选单克隆细胞扩大培养,经荧光显微成像和蛋白免疫印迹鉴定.结果 pEGFP-C1-asJNK1表达载体DNA测序结果与预期目的 片断序列一致,且JNK1蛋白表达水平明显抑制.结论 反义pEGFP-C1-asJNK1真核表达载体构建成功,JNK1蛋白质缺陷HELF细胞株成功建立.     

DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株的建立

目的 建立并鉴定DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株。用于研究hMSH2基因的作用机制及其缺陷与肿瘤发生的关系。方法 运用基因工程的方法获得hMSH2 cDNA片段,并反向克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上,随后将构建好的hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体转染入人胚肺成纤维细胞(HLF)．使之在HLF中表达,用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hMSH2基因的表达水平。结果 构建了hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体,并在真核细胞成功表达;hMSH2酶缺陷细胞株hMSH2基因的蛋白表达水平下降了44％。结论 hMSH2缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hMSH2基因功能研究提供了一种有效手段。     

子宫颈癌细胞株表达kiss-1基因重组慢病毒的构建

目的 探讨体内表达kiss-1基因的方法 治疗子宫颈癌的可行性,构建可表达kiss-1基因的重组慢病毒.方法 采用RT-PCR方法 ,根据制备两端含有酶切位点的kiss-1基因的cDNA片段,通过常规分子生物学手段在确保信号肽酶的识别点的条件下,构建可以表达kiss-1基因的慢病毒包装专用质粒pLenti6/V5D-TOPO,与其他辅助质粒共同转染293细胞,获得能表达kiss-1的重组慢病毒.结果 测序证实克隆kiss-1的cDNA与Genebank提供的序列完全一致;经限制性内切酶物理图谱方法 证实已经成功地将kiss-1和cDNA重组到含NT4的信号肽和前导序列下游.经RT-PCR方法 证明重组慢病毒在人子宫颈癌Hela细胞中可以表达kiss-1基因.结论成功构建了能够表达kiss-1的重组慢病毒.     

烟台市部分HIV-1流行毒株的基因特征和亚型分析

目的了解烟台市HIV-1流行毒株的流行情况和基因亚型特征.方法采集了7份HIV-1感染者的全血分离单个核细胞(PBMC),提取前病毒DNA,经nested-PCR扩增HIV-1膜蛋白(env)基因的核酸片段进行扩增,并测定和分析了C2-V3区及其邻区270个核苷酸序列.结果7份HIV-1感染者的PBMC样品中扩增到HIV1env基因片段,经序列分析发现7份样品中有A、B′和E亚型.5名有偿献血人员均为B′(泰国B)亚型,2名回国劳务人员分别为A、E亚型.结论烟台市目前存在HIV-1A、B′和E三种亚型毒株,感染情况复杂,因此应加强对献血者及回国劳务人员等高危人群的检测和控制,以防HIV-1各亚型毒株在烟台市的蔓延.     

细胞工厂培养甲型肝炎病毒L-A-1减毒株的增殖规律

目的探讨细胞工厂培养甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus,HAV）L-A-1减毒株的增殖规律,寻找最佳增殖周期。方法采用10层细胞工厂培养人胚肺二倍体细胞（2BS株）,同时感染HAV L-A-1减毒株,分别于感染后的7、14、17、21、24和28d,收获含病毒的细胞,进行细胞计数,并检测抗原滴度和病毒滴度。选择病毒收获的一个最佳时间点,连续试验5批,检测HAV病毒滴度,并与培养28d结果进行比较。结果细胞感染HAV 14~21d,活细胞数量基本达平台期,随培养时间延长,细胞数量略有降低;随着培养时间的延长,抗原和病毒感染性滴度逐渐增高,培养17d时已达病毒增殖高峰,17~28d抗原和病毒滴度分别维持在1∶64~1∶128和7.00~7.50lgCCID50/ml。连续5批培养21d的病毒液病毒滴度的均值与培养28d相近,且差异无统计学意义。结论细胞工厂培养HAV L-A-1减毒株增殖高峰可缩短为21d左右。     

人α-防御素-1基因与J链基因的融合及其表达载体的构建

目的本研究旨在将α-防御素-1(HNP-1)基因与J链基因进行融合使其成为融合基因J-HNP-1。方法从pCH-J质粒中扩增出J链;从pBabeNeo-HNP-1质粒中扩增出HNP-1;然后以它们的自身产物为模板,进行重组PCR,获取J-HNP-1 DNA片段,并插入编码双重报告基因Myc和6个多聚组氨酸(His)的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-HisC中,构建出C端带Myc和6×His的rpcDNA3.1(-)/Myc-HisC/J-HNP-1。结果经过重组得到的融合基因J-HNP-1的目的片段为786 bp,与预测相符。结论杀菌分子J-HNP-1的重组和哺乳动物细胞表达载体的构建,为进一步进行抗菌肽的研究及制备奠定了基础。     

亚砷酸钠对HaCaT细胞中DNMT1、HDAC1基因mRNA转录及蛋白表达的影响

目的 了解不同剂量的亚砷酸钠(NaAsO2)对人皮肤角质形成细胞(HaCaT细胞)中DNA甲基转移酶1(DNMT1)、组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因mRNA转录和蛋白表达的影响.方法 分别以0、3.13、6.25、12.5和25μmol/L NaAsO2溶液重复间隔处理HaCaT细胞72 h(NaAsO2处理24...     

FEZ1基因在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义

目的：探讨FEZ1基因在宫颈鳞癌组织中的表达及其意义。方法：收集宫颈鳞癌标本102例,宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）66例,正常宫颈组织40例。通过免疫组织化学（immuno-histochemistry,IHC）方法检测各标本中FEZ1蛋白的表达情况,并分析其表达与宫颈鳞癌临床参数的关系。结果：FEZ1蛋白在正常宫颈组织中的阳性表达率显著高于CIN和宫颈鳞癌组织（P〈0.05）;FEZ1蛋白的表达随着癌组织分化程度的降低而显著降低（P〈0.05）,而与患者年龄、浸润深度、临床分期和有无淋巴结转移无关（P〉0.05）。结论：FEZ1的表达缺失或下调可能与宫颈鳞癌的发生与演进有关。     

Monarch-1 Activation in Murine Macrophage Cell Line (J774 A.1) Infected with Iranian Strain of Leishmania major

Background

Leishmania major is an intracellular parasite transmitted through the bite of the female phlebotomine sand flies. Leishmania major is able to escape the host immune defense and survive within macrophages. Modulation of the NF-κB (Nuclear Factor-Kappa B) activation and suppression of the pro-inflammatory cytokines by L. major are the main evasion mechanisms that remain to be explored. This study aims to examine the expression level of the Monarch-1 in L. major-infected macrophages, as a negative regulator of the NF-κB activation.

Methods

Murine macrophage cell line (J774 A.1) was infected by metacyclic form of Leishmania promastigotes at macrophage/parasite ratio of 1:10. After harvesting infected cells at different times, total RNA was extracted and converted to cDNA. Semi-quantitative RT-PCR was performed for Monarch-1 by specific primers. Hypoxanthine Phospho-Ribosyl Transferase (HPRT) was used as an internal control to adjust the amount of mRNA in each sample.

Results

Semiquantitive analysis of Monarch-1 mRNA expression level showed a significant expression increase within 6 to 30 hours after L. major infection of macrophages when compared to the control macrophages.

Conclusion

Monarch-1 expression level reveals a significant increase in the early phase of macrophage infection with L. major, which in turn may suppress IL-12 production in Leishmania infected macrophages and deeply influence the relationship between host and parasite.     

自噬基因Beclin 1与膀胱癌发生发展及其预后相关性分析

目的探讨自噬基因Beclin 1在膀胱移行细胞癌（BTCC）组织中的表达和其在膀胱癌发生发展中的作用及预后的相关性。方法免疫组化EnVision法检测58例BTCC组织和20例正常膀胱组织中Beclin 1的表达,分析其与BTCC的分级、分期、侵袭及转移等生物学行为的关系,并对BTCC患者进行随访以期了解Beclin 1对患者生存率的影响。结果 Beclin 1在58例BTCC组织中阳性表达率明显低于正常膀胱黏膜组织中的表达（χ2=9.24,P〈0.01）。Beclin 1的表达与病理分级、TNM分期、生长方式、淋巴结转移有关（P〈0.05）。Beclin 1表达阳性患者的5年生存率明显优于Be-clin 1表达阴性的患者（P〈0.01）。Cox回归多因素分析表明Beclin 1表达是与患者5年生存率相关的独立预后因素（P〈0.05）。结论 Beclin 1在BTCC组织中表达下调,并可以作为BTCC预测发生发展和判断预后的生物学标志物。     

人tankyrase 1反义基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响

目的 探讨反义tankyrase 1基因转染对SGC-7901胃癌细胞形态学的影响.方法 构建人tankyrase 1基因反义真核表达载体,采用脂质体法将其转染至SGC-7901胃癌细胞中,从光镜、电镜水平观察转染与未转染细胞形态学的变化.结果 与亲本细胞相比,光镜下反义tankyrase 1基因转染的SGC-7901...     

肿瘤转移抑制基因KiSS-1的克隆与真核表达载体的构建

目的克隆不含信号肽的人肿瘤转移抑制基因KiSS-1,构建KiSS-1基因的真核表达载体并鉴定。方法从正常人膀胱组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,将其克隆到真核表达栽体pcDNA3.1( ),构建真核表达质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1。结果经基因序列分析及PCR和酶切鉴定,证实目的基因片段已成功插入载体pcDNA3.1( )且序列正确。结论重组质粒pcDNA3.1( )/KiSS-1构建成功,为下一步KiSS-1蛋白的表达和研究该蛋白的功能奠定了良好的基础。