脱细胞猪主动脉瓣膜与可降解聚合材料共同构建复合组织工程瓣膜

目的对新型复合组织工程瓣膜进行体外生物力学和动物体内移植试验，为临床应用过渡提供依据。方法以脱细胞猪主动脉瓣作为支架，用可降解聚合材料3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯（3一hydroxybutyrate—co-3-hydroxyhexanoate，PHBHHx）涂层，构建新型复合组织工程瓣膜。（1）复合组织工程瓣膜、新鲜猪主动脉瓣和脱细胞猪主动脉瓣各12枚，用单轴生物拉伸机进行体外生物力学测试；（2）小尾寒羊10只，其中5只在全身麻醉非体外循环下接受复合组织工程瓣膜，移植到羊的肺动脉瓣位；其余接受脱细胞猪主动脉瓣作为对照。术后18周处死动物，取出移植瓣膜，进行组织学、免疫荧光染色、扫描电子显微镜检查和钙含量测定。结果复合组织工程瓣膜保持了自然瓣形态，抗拉强度显著提高（P〈0．05）；瓣膜柔软，表面光滑无血栓；免疫荧光染色检测，瓣膜新生内膜中内皮细胞呈CD31阳性反应，沿瓣表面连续排列，间质细胞呈现单克隆鼠抗人平滑肌actin（sMA）阳性反应；复合组织工程瓣膜钙含量明显低于脱细胞猪主动脉瓣（P〈0．05）。结论复合组织工程瓣膜具有自然瓣膜的三维形态结构，良好的生物力学特性、生物相容性和细胞引导性，初步具备组织工程瓣膜雏形。     

不同脱细胞方案制备主动脉细胞外基质支架的比较研究

目的 应用不同方法对猪升主动脉进行脱细胞,从脱细胞有效性、细胞外基质破坏、生物力学和组织相容性等方面进行综合比较,以期获得适宜的组织工程血管支架。方法 取市售猪升主动脉30根随机分成6组(n=5),分别行以下脱细胞处理:A组0.1%胰蛋白酶/0.02%EDTA/PBS,B组1%Triton X-100/0.02%EDTA/蒸馏水,C组1%脱氧胆酸钠/蒸馏水,D组0.5%脱氧胆酸钠/0.5%SDS/蒸馏水,E组1%脱氧胆酸/蒸馏水;F组未行脱细胞处理,作为对照。观察各组支架大体结构,行HE染色观察支架显微结构和脱细胞有效性,DNA定量分析评价脱细胞效率;免疫组织化学染色观察Ⅰ型胶原和弹性蛋白损伤;扫描电镜观察内膜表面结构,测定生物力学性能。取90只SD大鼠随机分为6组(n=15),于腹壁肌内分别植入各组支架,术后7、14、28 d行HE染色评价支架免疫原性和组织相容性。结果 HE染色及DNA定量分析示,仅A、D组支架完全去除细胞成分。A组Ⅰ型胶原表达量显著低于其余各组(P<0.05),基底膜破坏严重,生物力学性能下降,最大应力和抗张强度显著低于其余各组(P<0.05),断裂伸长率显著高于其余各组(P<0.05)。D组Ⅰ型胶原破坏较B、C、E、F组严重(P<0.05),但基底膜完整,生物力学性能接近于F组(P>0.05)。植入大鼠体内实验显示,D组支架免疫原性和组织相容性明显优于其余各组,炎性细胞浸润程度轻(P<0.05)。结论 采用0.5%脱氧胆酸钠/0.5%SDS/蒸馏水对猪主动脉进行脱细胞,获得的细胞外基质支架具有用于构建组织工程血管的潜能。     

羊颈动脉脱细胞血管基质的制备及其生物相容性评价

目的研究脱细胞血管基质快速高效的制备方法并对其进行生物相容性评价,为组织工程血管的研究寻找合适的支架材料。方法取20根长50mm新鲜山羊颈动脉经-80℃冷冻、37℃水浴复温,反复冻融3次,在506MPa、4℃条件下超高压处理20min,0.125%SDS中37℃振摇(100r/min)12h,彻底去除细胞后,行HE染色、Masson染色、扫描电镜观察及生物力学测定研究其组织结构的变化;Hoechst33258荧光染色和细胞DNA残留量分析评价脱细胞效果;通过接触细胞毒性实验、MTT活性测试及皮下埋植实验对制备的脱细胞血管基质进行生物相容性分析。皮下埋植实验取清洁级SD大鼠10只,体重200～230g,分为2组(n=5),实验组于大鼠背部皮下埋植结合物理化学方法处理的脱细胞血管基质,对照组埋植单纯物理方法处理的脱细胞血管基质,分别于术后1、2、3、4、8周取出行HE染色观察。结果 HE染色及Masson染色显示脱细胞血管基质无细胞成分残留,保持较完整的胶原成分;扫描电镜观察血管表面以胶原为主,适合细胞黏附;Hoechst33258荧光染色脱细胞血管基质材料未见明显阳性核染色;苯酚-氯仿提取脱细胞血管基质残留DNA含量,电泳检测分析显示其中DNA含量较正常血管显著降低;生物力学检测示脱细胞血管基质最大荷载时的应力及应变与正常血管比较差异无统计学意义,保持了正常血管的力学特征;接触细胞毒性实验与MTT法测定示脱细胞血管基质与细胞有良好的黏附性,细胞毒性为0～1级;实验组皮下埋植术后8周材料周围基本未见炎性细胞,对照组仍有明显淋巴细胞浸润。结论经反复冻融、超高压及小剂量SDS处理的脱细胞血管基质是一种构建组织工程血管的理想支架材料。     

脱细胞天然支架生物力学性能变化及预处理改善组织相容性的实验研究

目的观察脱细胞猪主动脉瓣的生物力学性能变化,探讨不同预处理改善天然支架组织相容性的效果。方法新鲜猪主动脉瓣经酶加去污剂法去除细胞,力学测试仪检测其最大负荷、最大应力、最大应变和弹性模量的变化,苏木精-伊红（HE）染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色和扫描电镜观察其病理形态学变化;将脱细胞瓣膜分别予磷酸缓冲液、多聚赖氨酸和未灭活胎牛血清包被处理,然后种植大鼠主动脉肌成纤维细胞,甲基噻唑基四唑试验检测细胞黏附率,HE染色和扫描电镜观察形态学变化。结果酶加去污剂法能完全脱去瓣膜细胞,基本维持胶原纤维的空间结构,但其最大负荷、最大应力及弹性模量下降,最大应变上升（P〈0．05）;胎牛血清预处理去细胞瓣能显著提高肌成纤维细胞的黏附率,促进细胞生长、分化和增殖,并在瓣膜表面形成连续的细胞层（F值=129．26,P=0．000）。结论酶加去污剂法可较完全去除猪主动脉瓣膜细胞并保持细胞外基质的三维结构,但其生物力学性能有所下降;胎牛血清预处理能改善脱细胞瓣天然支架的细胞黏附、生长和繁殖。     

猪主动脉脱细胞基质的简化制备及生物学评价

目的应用酶法制备猪主动脉脱细胞基质，并评价其生物学性能。方法取新鲜屠宰的16根肉猪降主动脉，长10～12cm，应用0．1％胰蛋白酶和0．01％EDTA于37℃震荡条件下脱除细胞成分，HE和Masson染色行脱细胞基质的组织学观察，扫描电镜和透射电镜观察超微结构改变。应用单轴拉伸方法比较脱细胞前和脱细胞后48、96和120h时材料两断端厚度、极限抗张强度（ultimate tension stress，UTS）和断裂伸长率（strain of failure，SOF），绘制应力-应变曲线。取成年杂种犬3只，体重20～30kg，雌雄不限。将脱细胞前后片状主动脉基质埋植于犬脊柱两侧皮下，分别于埋植后1、3和6周取材，行HE染色观察，参照半定量的Wakitani评分法，对取材时的大体形态、浸润细胞种类和数量、新生血管等指标进行比较，观察宿主炎性细胞反应和脱细胞基质变化。将犬内皮细胞种植于猪脱细胞基质，HE染色和扫描电镜观察细胞相容性。结果HE染色和电镜检查显示在96h可将新鲜猪主动脉细胞成分脱除，Masson染色显示细胞外纤维成分保留完整。脱细胞前后的动脉基质厚度、UTS和SOF差异均无统计学意义（P〉0．05），但UTS显示降低趋势，SOF则呈现增加趋势，应力-应变曲线呈现力学强度降低和延展性增加的变化趋势。犬皮下埋植，各组脱细胞标本炎性细胞浸润明显减轻，6周时以成纤维细胞浸润为主，且基质中见新生毛细血管。半定量组织学评分，在大体观察、浸润细胞种类和数量方面与脱细胞前比较有统计学意义（P〈0．05）；新生血管数量比较，差异无统计学意义（P〉0．05）。HE染色和扫描电镜显示种植的内皮细胞可在基质表面形成单细胞层。结论应用0．1％胰蛋白酶和0．01％EDTA持续振荡96h制备的猪主动脉脱细胞基质，在生物力学、免疫原性和细胞相容性方面可满足血管组织工程的需要。     

应用四枝化状聚乙二醇-乙烯砜基交联去细胞带瓣管道的实验研究

目的利用四枝化状聚乙二醇-乙烯砜基（polyethylene glycol-VS,PEG-VS）交联去细胞主动脉带瓣管道,制备新型组织工程复合支架,研究其力学和生物学性能。方法采用胰酶法制备兔主动脉去细胞带瓣管道,利用四枝化状PEG-VS与兔去细胞带瓣管道交联构建复合支架,体外静态条件应用力学测试仪检测去细胞管道和复合支架力学性能。将纯种新西兰大白兔30只随机分为3组,每组10只,对照组：正常兔主动脉带瓣管道;去细胞组：去细胞带瓣管道;复合支架组：PEG复合支架。构建兔颈总动脉瓣膜移植模型,术后28 d分别用超声心动图检测3组移植管道通畅率,用HE染色、扫描电子显微镜观察微观形态和炎症细胞浸润,免疫荧光染色检测复合支架体内内皮化程度。结果体外力学测试结果示：PEG复合支架弹性模量及最大负荷力均较去细胞管道有明显提高（P弹性模量=3.1×10-9,P最大负荷力=1.1×10-6）。术后血管彩色多普勒超声心动图提示：复合支架组管腔通畅率高于对照组（P=0.054）和去细胞组（P=0.019）,腔内血栓形成率、管腔形变率明显降低;HE染色、扫描电子显微镜检测显示：复合支架组体内内皮化程度增高,内皮细胞于支架上均匀附着;免疫荧光检测显示：支架表面内皮细胞标记物CD34阳性率高于对照组和去细胞组。结论利用四枝化状功能化PEG-VS改性去细胞主动脉瓣带瓣管道,可明显改善组织工程支架生物力学性能和组织相容性。     

氯化镁缓释抗钙化组织工程小口径血管体外性能测试

目的:构建氯化镁(MgCl 2)微米缓释抗钙化的组织工程小口径血管。 方法:联合应用Triton X-100+脱氧胆酸钠盐、DNA/RNA核酶对绵羊颈动脉行脱细胞处理,制成组织工程小口径血管支架,HE染色,电镜下观察脱细胞情况和血管支架性能。采用复乳法超声破碎高速搅拌挥发法,制备载有MgCl ...     

来源于长管状骨的组织工程纤维环支架的理化特性及细胞生物学相容性研究

[目的]以来源于长管状骨的骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)为材料制备纤维环支架,并检测其理化特性及细胞生物相容性.[方法]以猪股骨近端松质骨为材料,制备外径为1 cm、内径为0.5 cm的中空环,经脱钙脱细胞处理后制成纤维环支架.支架行Hoechst 33258、HE、Ⅰ型胶原免疫荧光、天狼星红染色,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察并计算孔径,同时进行生物力学测定.四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)检测支架不同浓度浸提液的细胞毒性,取P1代山羊纤维环细胞,用注射器将细胞接种至支架上,体外培养48 h,通过活/死细胞染色(LIVE/DEAD cells staining)、扫描电镜(SEM)、HE染色评价支架与细胞的生物相容性.[结果]大体观察支架表面光滑,呈乳白色,扫描电镜支架孔隙分布较均匀且相连通,支架孔径为(401.4±13.1) μm,Hoechst 33258、HE染色均未见细胞残留,Ⅰ型胶原免疫荧光阳性,天狼星红染色支架红染,支架压缩弹性模量为(47.75±6.32) kPa.四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组间细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05),活/死细胞染色示细胞在支架上呈绿色荧光,扫描电镜和HE染色示细胞粘附在支架孔隙表面及周围,有基质分泌.[结论]以来源于长管状骨的骨基质明胶为材料制备的中空环形支架脱细胞彻底,具有合适的孔径结构,在机械性能、组成方面与正常纤维环相接近,具有良好的生物相容性,符合组织工程纤维环支架载体的条件.     

组织工程心脏瓣膜的初步构建

目的探讨用体外培养的犬骨髓基质干细胞（MSC）和由聚4-羟基丁酸酯（P4HB）制作的心脏瓣膜支架构建组织工程心脏瓣膜（TEHv）的可行性。方法取年轻健康犬髂前上嵴的骨髓，分离培养出骨髓基质干细胞，通过苏木素-伊红（HE）染色、Mallory染色、Masson染色及免疫组织化学鉴定细胞，取第3代细胞种植在P4HB构建的心脏瓣膜支架上，培养2周后，用扫描电镜观察。结果MSCs经20～25d的培养后，梭形细胞已达到90％以上融合；经HE染色、Mallory染色、Masson染色及免疫组织化学证实培养出来的细胞为MSCs。扫描电镜下，未种植细胞的瓣膜呈蜂窝状，孔径在89～150btm之间，适宜MSCs的爬行；种植细胞后，瓣膜表面有大量MSCs黏附，且爬行长入蜂窝状孔径内。结论MSCs和以P4HB为材料的瓣膜支架构建TEHV具有可行性。     

组织工程角膜生物材料载体制备的比较性研究

目的 比较用不同的方法脱细胞处理异种（猪）角膜基质制备组织工程角膜支架材料，并对其生物相容性进行研究。方法 成年York猪角膜基质材料，以Triton联合0．25％胰酶，处理30min 3h为材料1；Triton联合DNA—RNA酶，处理8～14h为材料2；Triton联合0．25％胰酶、DNA—RNA酶，处理3～5h为材料3。3种材料用无水氯化钙脱水干燥保存。在材料上接种兔角膜基质成纤维细胞，观察细胞生长情况。新西兰大白兔24只，随机分为3组，每组8只。右眼为实验眼，左眼为空白对照眼。将材料植入兔眼角膜基质层中，术后每日裂隙灯检查术眼；1、4、8和12周分别随机取2只兔眼角膜作HE染色，观察材料的生物相容性。结果 材料1、2细胞脱出不完全，处理最佳时间分别是2hN10～12h，角膜基质网状间隙无明显增大；接种兔角膜基质成纤维细胞后，3～4d细胞死亡；植入兔角膜基质中有明显的免疫排斥反应。材料3脱出细胞完全，其脱细胞处理的最佳时间为4h，角膜基质纤维结构无破坏，呈三维网状结构，网状间隙明显增大；接种兔角膜基质成纤维细胞后，细胞在材料上贴附生长良好；将其植入兔角膜基质中无炎性及排斥反应，可逐渐降解吸收，有良好的生物相容性。结论 Triton联合0．25％胰酶、DNA—RNA酶法处理的异种（猪）角膜基质具有良好的生物相容性，可作为一种组织工程角膜的支架材料。