促凋亡因子Omi/HtrA2对凋亡抑制蛋白表达及A549细胞凋亡的影响

目的观察Omi／HtrA2对凋亡抑制蛋白（XIAP）表达的影响和对肺癌A549细胞凋亡的影响。方法将构建的携带绿色荧光蛋白（GFP）和Omi／HtrA2基因的表达载体（PEGFP-N1-Omi）转染至人肺腺癌A549细胞中，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测Omi／HtrA2对XIAP转录和表达的影响，流式细胞仪检测Oml／HtrA2协同顺铂作用于A549细胞后该细胞的凋亡变化。结果Omi／HtrA2基因转染组XIAP的mRNA表达水平下降37％（P〈0．05），XIAP的蛋白表达水平下降69％（P〈0．05），顺铂诱导后，基因转染组细胞凋亡率为（36．00±1．95）％，显著高于对照组的细胞凋亡率（17．00±1．12）％（P〈0．05）。结论Omi／HtrA2通过抑制XIAP的抗凋亡作用可协同顺铂促进A549细胞凋亡。     

红细胞生成素对马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞凋亡的保护机制研究

目的探讨红细胞生成素（EPO）抑制马兜铃酸（AA）所诱导的肾小管上皮细胞（LLC—PK1）凋亡的作用机制。方法以不同浓度AA（5、10、20mg／L）刺激LLC—PK1细胞株，同时培养体系中加入不同浓度的EPO（5、10、20U／m1），另设对照组。各组细胞培养24h后，TUNEL法原位检测细胞凋亡情况；流式细胞仪检测凋亡细胞的比例；Western印迹检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶（caspase）3、bcl—xL的蛋白表达。结果（1）与对照组（6．09±1．84）％相比，AA5mg／L组TUNEL阳性细胞比例增加【（9．79±2．58）％】；AA10、20mg／L阳性细胞比例显著增加[（37．67±8．23）％、（62．95±8．29）％】，与对照组差异有统计学意义（P〈0．05）。AA10mg／L组细胞经EPO10、20U／ml干预后，阳性细胞比例显著下降f（22．41±3．47）％、（14．63±2．66）％，P〈0．051；AA20mg／L组细胞经不同浓度EPO干预后，阳性细胞比例无显著变化。（2）与对照组相比，AA5mg／L组细胞caspase-3的活性表达有少量增加；AA10mg／L组细胞caspase-3显著增加；而AA20mg／L组caspase-3表达降低。与AA10mg／L组相比，EPO10U／ml和EPO20U/ml干预后，细胞caspase-3的表达显著降低。（3）与对照组相比，AA5mg／L组细胞bcl—xL的表达明显增加；AA10mg／L组细胞bcl-xL表达减少；AA20mg／L组细胞bcl—xL表达显著减少。与AA10mg／L组相比，EPO5U/ml干预后，细胞bcl-xL有所增加；EPO10U／ml和EPO20U／ml干预后，细胞bcl—xL的表达显著增加。结论EPO可能通过促进抗凋亡蛋白bcl-xL的表达、抑制凋亡蛋白酶caspase-3的过高表达，从而抑制了AA诱导的肾小管上皮细胞的凋亡。     

丙戊酸钠诱导胃癌细胞凋亡及其机制

目的观察丙戊酸钠（VPA）对胃癌细胞系BGC-823的生长抑制及诱导凋亡作用．并通过检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase3、caspase8、caspase9）的活性和蛋白表达变化探讨VPA诱导凋亡的可能机制。方法M1Tr法检测细胞生长抑制、Annexin V／PI双染检测细胞凋亡、间接免疫荧光法分析caspase3、caspase8、caspase9蛋白变化，分光光度法检测caspase3、caspase8、caspase9活性改变。结果VPA0．75～4．00mmol／L干预BGC-823细胞24h和48h后，细胞生长被明显抑制，细胞凋亡率显著增加[VPA0．75mmol／L，24h时细胞凋亡率为（7．2±0．5）％，48h时为（9．2±1．0）％；VPA4．00mmol／L，24h时为（16．7±2．2）％，48h时为（20．4±1．6）％]，与对照组[24h时细胞凋亡率为（4．9±0．2）％，48h时为（5．1±0．8）％]比较．差异有统计学意义（P〈0．001），并呈时间、剂量依赖趋势；caspase3、caspase9蛋白表达被明显上调．活性升高．与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．001）。caspase8活性及蛋白表达在VPA作用24h后未见明显改变，48h后仅轻度增加。结论VPA可明显抑制胃癌细胞的生长并诱导其凋亡，而且该作用主要通过激活caspase9介导的内源性凋亡途径实现；caspase8介导的外源性细胞凋亡途径未参与或仅部分参与了该诱导过程。     

靶向突变K-ras基因的小干扰RNA体内外抑制肺癌细胞生长的研究

目的探讨应用小于扰RNA（siRNA）敲除突变K-ms基因对肺癌细胞H441体内外生长的抑制作用。方法构建真核表达载体pSilencer3．1-K-ras^v12,转染H441细胞后应用半定量RT-PCR及Westernblotting检测突变K-l＇as基因mRNA及蛋白质的表达变化,噻唑蓝法检测H441细胞增殖速度的变化,流式细胞仪检测H441细胞凋亡率的变化。裸鼠皮下移植pSilencer3．1-K-ras^v12。处理的H441细胞,观察其成瘤性的改变。结果测序证实pSilencer3．1-K-ras^v12。真核表达载体构建成功。RT-PCR灰度比值结果示空载体组、阴性对照组、实验组K-rasmRNA相对表达量分别为：93．7％±2．2％、95．1％±2．5％、43．6％±3．1％,差异有统计学意义（F=78,P〈0．01）;Westernblotting结果示空载体组、阴性对照组、实验组K-ms蛋白相对表达量分别为：98．1％±2．4％、97．5％±2．0％、33．5％±3．7％,差异有统计学意义（F=93,P〈0．01）;经pSilencer3．1-K-ras^v12。作用的H441细胞生长受到明显抑制（P〈0．05）,凋亡率较对照组明显升高（F=8．9,P〈0．01）,H441细胞在裸鼠体内生长受到明显抑制。结论靶向突变K-ras基因的siRNA可以抑制肺癌H441细胞在体内外的生长速度,诱导细胞凋亡,为肺癌的基因治疗提供了新的思路和方法。     

全反式维甲酸和三氧化二砷协同诱导胰腺癌细胞凋亡

目的研究与三氧化二砷（As2O2）具有协同效应治疗胰腺癌的药物。方法以胰腺癌细胞系SWl990为研究对象，观察5-氟尿嘧啶（5-Fu）、健择（Gemcitabine）和全反式维甲酸（AT—RA）与As2O3共同作用对细胞的影响。通过台盼蓝拒染法检测细胞生长和细胞活力，流式细胞仪检测AnnexinV或PI阳性细胞的含量，评价以上药物对细胞增殖和凋亡的作用。结果5-Fu和Gemcitabine与As2O3无协同效应。单独应用As2O3或ATRA均抑制SWl990细胞生长，不诱导细胞凋亡。其中，对照组活细胞密度为（8．5±0．3）×10^5个／ml，As2O3组为（4．4±0．1）×10^5个／ml，ATRA组为（6．7±0．2）×10^5个／ml。但是，As203和ATRA共同处理SWl990细胞后，细胞生长明显抑制，并诱导细胞凋亡。对照组活细胞密度为（8．5±0．3）×10^5个／ml，As2O3＋ATRA组为（3．3±0．1）×10^5个／ml；对照组细胞活力为（92，0±1．2）％，As2O3组为（90．0±1．3）％，ATRA组为（93．0±1．4）％，As2O3＋ATRA组为（65．0±2．1）％；对照组Annexin V和PI阳性细胞的含量为（6．0±1．2）％，As2O3组为（11．0±3．3）％，ATRA组为（5．0±1．4）％，As2O3＋ATRA组为（37．0±5．3）％。结论As2O3和ATRA可协同诱导胰腺癌细胞凋亡，两者联合应用可能作为胰腺癌辅助治疗的另一选择。     

转染人Endostatin基因对胰腺癌SW1990细胞增殖、凋亡及血管内皮生长因子表达的影响

目的观察转染人Endostatin（hEndostatin）基因对胰腺癌细胞株SW1990增殖、凋亡及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法携带hEndostatin基因的复制缺陷型重组腺病毒载体体外转染SW1990细胞，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡，实时荧光定量PCR和ELISA分析检测hEndostatin和VEGF的表达。建立裸鼠胰腺癌模型，随机分为3组（n=8），瘤体内分别注射磷酸盐缓冲液（PBS组）、报告基因LacZ重组腺病毒（Ad—LacZ组）、hEndostatin重组腺病毒（Ad—bEnd组）100山，隔日1次，共4次。4周后免疫组织化学染色检测肿瘤组织中hEn．dostatin、VEGF、增殖性细胞核抗原（PCNA）的表达，TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。结果体外转染hEndostatin基因不影响SW1990细胞的增殖和凋亡（P〉0．05），但下调VEGF的表达（P〈0．01），下调作用第5天最大，在mRNA和蛋白水平的抑制率分别为84．67％和81．41％。体内转染4周后，Ad．bend组VEGF、PCNA阳性表达率分别为（36．3±7．1）％、（38．2±3．9）％，显著低于Ad．LacZ组的（81．2±6．6）％、（93．2±4．9）％和PBS组的（78．4±6．2）％、（90．1±5．7）％（P〈0．01）；肿瘤细胞凋亡率为（31．2±5．4）％，显著高于Ad—LacZ组的（9．4±4．9）％和PBS组的（8．5±3．7）％（P〈0．01）。结论hEndostatin基因转染抑制SW1990细胞的体内增殖并促进凋亡；下调SW1990细胞内源性VEGF的表达可能是抗肿瘤的作用机制之一。     

hTERT基因短发夹状RNA表达载体对肾癌细胞生长的抑制作用

目的观察针对hTERT基因的短发夹状RNA（shRNA）表达载体pSilencer-hTERT对人肾癌细胞及移植瘤生长的抑制作用。方法（1）pSilencer-hTERT转染人肾癌Kerr-3细胞，1、3、5、7d后逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印迹技术检测hTERTmRNA、蛋白表达，MTT法检测细胞增殖，原位末端标记法检测凋亡。（2）BALB／C-nu裸鼠接种Ketr-3细胞成瘤，瘤内分别注射pSilencer-hTERT（50μg）、空质粒pSilencer1．0-U6（50μg）及等体积（100μg）生理盐水，隔日1次，共7次。治疗结束后第3天处死小鼠，取瘤组织检测肿瘤体积，免疫组织化学染色检测hTERT表达。结果（1）pSilencer-hTERT转染3d后Ketr-3细胞hTERTmRNA表达（43．2±4．4）％、蛋白表达（42．6±5．6）％最低，细胞增殖抑制率（37．3±6．6）％、凋亡细胞阳性率（30．5±4．7）％最高，分别与空质粒对照组[（98．8±4．7）％、（98．0±3．7）％、（3．3±0．9）％、（10．4±2．4）％]比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。（2）pSilencer-hTERT处理组小鼠肿瘤体积（62．4±36．5）mm^3减小，hTERT表达率（65．7±4．7）％降低，分别与空质粒对照组（83．2±38．7）、（90．7±4．2）％比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论pSilencer-hTERT能有效、持续抑制人肾癌Ketr-3细胞及裸鼠肾癌移植瘤生长。     

小干扰RNA对特异性沉寂淋巴细胞白细胞介素-2基因表达和功能的影响

目的 探讨体外转录法合成的小干扰RNA（siRNA）对大鼠淋巴细胞白细胞介素（IL）-2基因的表达和功能的影响。方法 设计并合成3条siRYA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）在阳离子脂质体的介导下转染淋巴细胞。于转染后0、24、48h收集细胞，用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测IL-2mRNA的变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测IL-2表达的变化。结果 体外合成的3条siRNA通过脂质体转染淋巴细胞后，均能不同程度地抑制I[,-2的表达。转染后24h的ELISA方法检测显示siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3组的抑制率分别为（79．20±1．83）％、（66．50±1．42）％、（43．90±1．22）％，以siRNA-1的IL-2抑制作用最强。半定量RT-PCR方法检测显示siRNA-1、6iRNA-2、siRNA-3转染后的IL-2mRNA均受到不同程度的抑制，其中siRNA-2组的抑制作用最明显（82，10±1．85）％。结论 siRNA可特异性的抑制淋巴细胞IL-2基因的转录和表达，为研究siRNA在移植免疫耐受及防移植物抗宿主病（GVHD）方面的应用提供了依据。     

小檗胺诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡及其机制

目的探讨小檗胺体外诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡的作用及其机制。方法噻唑蓝（MTT）法检测10、20、30和40mg／L小檗胺作用于PC-3细胞24、48、72h的吸光度（A）值；流式细胞仪检测小檗胺作用后细胞凋亡率及细胞周期的变化；透射电镜观察细胞凋亡形态；免疫细胞化学法检测小檗胺作用后bcl-2、bax和Survivin表达变化。结果各浓度组小檗胺作用48h。细胞抑制率分别为（13．60±1．49）％、（31．79±2．31）％、（54．16±3．09）％和（63．72±2．46）％，与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。小檗胺对PC-3细胞的抑制作用呈时间-浓度依赖性；40mg／L小檗胺作用24、48、72h，细胞凋亡率分别为（31．44±3．27）％、（50．32±4．03）％和（63．46±3．75）％，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。随小檗胺浓度的增高，凋亡率随之升高，细胞周期呈现G0／G1期、S期细胞比例增多，G2／M期细胞比例减少趋势；电镜扫描可见典型的“凋亡小体”；40mg／L小檗胺作用72h，PC-3细胞中bax的表达增加、Survivin表达减少（P〈0．05），而bcl-2的表达差异无统计学意义（P〉0．05）。结论小檗胺通过诱导细胞凋亡和影响细胞周期的方式抑制PC-3细胞的增殖，并具有时间和浓度依赖性；诱导凋亡的机制可能是通过下调Survivin、上调bax蛋白的表达来实现。     

存活素反义寡核苷酸诱导肾癌细胞凋亡及机制的实验研究

目的观察存活素反义寡核苷酸封闭存活素的表达对肾癌细胞凋亡的影响。方法采用脂质体介导的存活素反义寡核苷酸技术转染肾癌细胞786-0。电镜观察细胞超微结构,免疫组织化学、Western blot及RT-PCR方法检测存活素蛋白及mRNA表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑盐比色法检测癌细胞抑制率。酶标免疫测定caspase-3活性。结果存活素反义寡核苷酸能显著降低存活素蛋白和mRNA的表达,并呈浓度和时间依赖效应。转染后的肾癌细胞出现了大量凋亡小体。400、600、800 ng／ml反义寡核苷酸细胞凋亡率分别为（10．54±0．72）％,（12．80±0．38）％,（22．30±1．23）％,较空白对照组[（6．05±0．48）％]和正义对照组[（5．70±0．41）％]显著增加（P〈0．05）。反义寡核苷酸各组caspase-3的相对活性分别为0．052±0．009,0．078±0．004和0．092±0．002,与空白对照组（0．027±0．008）和正义对照组（0．028±0．001）相比,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论存活素反义寡核苷酸能显著下调存活素基因表达,明显促进肾癌细胞786-0凋亡并抑制其增殖;可能是通过上调caspase-3表达来促进凋亡。