肝癌高转移细胞株的肿瘤干细胞生物学特性研究

目的:建立高转移肝癌细胞株,研究其肿瘤干细胞生物学特征,为靶向人肝癌干细胞治疗提供有价值的细胞模型。方法:肝癌细胞系Bel7402接种裸鼠皮下,成瘤后,取小鼠肺部转移灶,通过机械分离法,获取肺部肝转移细胞,体外扩大培养后,再次接种裸鼠。如此反复接种裸鼠,获得稳定肺转移肝癌细胞株Bel7402-V13。采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定Bel7402-V13中肿瘤干细胞的存在。流式细胞术分析亲本Bel7402和Bel7402-V13中肿瘤干细胞标志物ESA的表达情况,分选Bel7402和Bel7402-V13中ESA+细胞并进行体外生物学特征研究及裸鼠致瘤实验。结果:建立高转移Bel7402-V13细胞株,Bel7402-V13细胞无血清悬浮培养7d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。与Bel7402中ESA+细胞相比,流式分析显示干细胞标志物ESA比例高转移Bel7402-V13显著提高5.67倍（17.6±0.4 vs 3.1±1.5）。Bel7402-V13中ESA+细胞具有更强的自我更新能力［成球率:（94.8±7.5）% vs （52.3±6.9）%,P<0.01］,侵袭能力提高1.51倍（397.7±79.4 vs 262.0±40.1,P<0.01）,耐药能力也显著增强（IC50:0.286 vs 0.196,P<0.01）,ESA+细胞Bel7402-V13在裸鼠皮下接种2×102个细胞3月即可致瘤（3/6）,而接种2×102个ESA+细胞Bel7402细胞3月才能致瘤（1/6）。结论:获得高转移肝癌细胞株Bel7402-V13,伴随ESA+细胞增加,其体内外功能显著增强,为肝癌干细胞的靶向治疗提供有价值的细胞模型。     

人胃癌CD90+干细胞可能影响胃癌的转移和患者的预后

目的： 分离并鉴定人胃癌细胞系SNU-5中的肿瘤干细胞,探讨人胃癌CD90+干细胞对胃癌转移和预后的影响。 方法： 无血清悬浮培养及PKH26染色确定SNU-5细胞系中是否存在肿瘤干细胞,流式细胞术分析SNU-5亲本及球体细胞中肿瘤干细胞标志物的表达,分选CD90+SNU-5细胞并进行体外生物学特征研究及SCID鼠致瘤实验。收集肿瘤医院腹部外科95例胃癌患者肿瘤病理标本,免疫组化方法检测胃癌组织中CD90的表达。 结果： SNU-5细胞无血清悬浮培养11 d后形成的细胞球体中存在单个PKH26阳性细胞。无血清悬浮培养可将CD90+SNU-5细胞富集6.1倍,且CD90可在球体细胞中与标示干细胞的PKH26共染。CD90+SNU-5细胞较CD90- SNU-5细胞和亲本SNU-5细胞具有更高的自我更新能力\[成球率（7.7±1.1）% vs (1.3±0.4)%、(1.8±0.3)%,均P<0.01\]和侵袭能力\[侵袭细胞数(283.3±30.2) vs (48.0±7.5)、(156.7±72)个,均P<0.01\]。CD90+SNU-5细胞在重症联合免疫缺陷（severe combined immune deficency,SCID）小鼠皮下接种2×102个细胞6周即可致瘤（1/6）,而接种2×104个CD90- SNU-5细胞10周才能致瘤（1/6）。95例胃癌患者组织中CD90的表达与胃癌的远处转移显著相关（P<0.01）,且CD90阳性胃癌患者的生存期明显短于CD90阴性的患者（P<0.01）。 结论： 人胃癌细胞系SNU-5中存在具有更强自我更新及侵袭能力的CD90+干细胞,人胃癌组织中CD90+干细胞数量与肿瘤的转移与患者生存期明显相关。     

高转移肺癌细胞株的建立及其肿瘤干细胞生物学特性

 目的 研究高转移肺腺癌细胞株的肿瘤干细胞生物学特征。方法 肺腺癌细胞系A549接种裸鼠皮下成瘤后,取肺的转移灶,通过机械分离法获取肺转移细胞,体外扩大培养后,再次接种裸鼠。如此反复接种裸鼠,获得稳定肺转移的细胞株A549-V13。采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定A549-V13存在肿瘤干细胞。流式细胞术（FACS）检测和分选A549和A549-V13中肿瘤干细胞标志物CD133的表达并进行体内外生物学特征实验。结果 建立稳定高转移A549-V13细胞株。无血清悬浮培养A549-V13,7天后形成的球形细胞团中存在单个PKH26阳性细胞。FACS检测显示,与A549中CD133⁺细胞相比,高转移A549-V13细胞株中CD133⁺细胞的表达比例显著提高4.85倍。A549-V13中CD133⁺细胞具有更强的自我更新能力,侵袭能力提高1.42倍,耐药能力也显著增强,其IC₅₀提高1.26倍,A549-V13的CD133⁺细胞在裸鼠皮下接种2×102个细胞3月致瘤4/6,而接种2×10²个A549的CD133⁺细胞3月才致瘤2/6。结论 建立高转移肺癌细胞株A549-V13,伴随CD133⁺细胞表达比例的增加,其体内外生物学功能显著增强。     

胃癌细胞中CD44阳性细胞具有肿瘤干细胞特征

目的:在原位移植瘤模型上验证CD44+胃癌细胞的肿瘤干细胞特性.方法:选取MKN-45胃癌细胞株,通过流式细胞仪分选为CD44+和CD44-两组,以未分选的MKN-45胃癌细胞为对照.体外部分,通过MTT法和克隆形成实验验证CD44+胃癌细胞体外增殖能力,通过Transwell实验验证其侵袭力.体内部分,将上述细胞通过原位移植法接种至裸鼠,同等条件下饲养8周后处死裸鼠,检验其成瘤率;分离肝脏,检测肝转移瘤数目;H-E染色观察胃肿瘤和肝转移瘤形态;通过免疫荧光法检测两处肿瘤CD44+细胞数量.结果:CD44+胃癌细胞相比CD44‘胃癌细胞具有明显增强的细胞增殖力(P＜0.01)和侵袭力(P＜0.01),更容易成瘤且更容易发生转移(P＜0.05),但和MKN-45未分选组相比差异无统计学意义(P＞0.05).不论是在原发肿瘤还是转移瘤中,CD44+胃癌细胞均能产生CD44‘细胞,但后者不能产生CD44+细胞.结论:CD44+ MKN-45胃癌细胞相比CD44-胃癌细胞具备更强的增殖力和侵袭力、更容易成瘤和发生转移,符合肿瘤干细胞部分特征,值得进一步研究.     

一株胃癌干细胞功能性单克隆抗体的鉴定及功能研究

[目的]从抗人胃癌干细胞单克隆抗体杂交瘤库中筛选鉴定识别胃癌干细胞的单克隆抗体,并证明其具有抑制胃癌干细胞自我更新能力和侵袭功能的功能性单抗,为靶向人胃癌干细胞治疗胃癌提供有治疗潜能的单抗候选药物。[方法]采用无血清培养、PKH26染色及流式细胞术等方法确定人胃癌细胞系SNU-5中存在肿瘤干细胞,可作为研究抗人胃癌干细胞单抗的细胞模型。应用双色免疫荧光、流式细胞分选等技术分析鉴定单克隆抗体25G5是识别胃癌干细胞的单克隆抗体。用肿瘤干细胞的成球生长实验、Transwell侵袭实验及耐药性实验研究分析25G5单抗对胃癌干细胞功能的影响。[结果]SNU-5细胞在无血清培养基中存活并增殖成球形生长,SNU-5球体细胞中表达胃癌干细胞标志物CD44~+和CD90~+的细胞比例分别为72.4%和8.55%,较亲本细胞分别提高了21.3倍和2.4倍,表明SNU-5中存在有CD44~+、CD90~+的胃癌干细胞。细胞免疫荧光结果显示25G5单抗识别的抗原分子与CD44、CD90胃癌干细胞标志物共染表达于胃癌干细胞膜上。流式细胞术分选的25G5~+细胞的成球率为(21.4±0.3)%,显著高于25G5-细胞(12.3±0.7)%和亲本细胞(16.1±1.0)%。Transwell侵袭实验、细胞耐药性实验和动物体内致瘤实验结果显示25G5~+细胞的侵袭能力和耐药能力也显著高于25G5-细胞和亲本细胞,表明25G5单抗识别的细胞是具有自我更新、高侵袭、高耐药性特征的肿瘤干细胞。体外功能研究发现,单抗25G5能显著抑制SNU-5胃癌细胞在无血清培养液中的成球生长,抑制率可达46.4%,也能显著地抑制SNU-5成球细胞(Sphere细胞)的侵袭,抑制率达58.4%。单抗25G5是一株能显著抑制SNU-5中肿瘤干细胞自我更新和侵袭能力的功能性抗人胃癌干细胞单抗。[结论]单克隆抗体25G5是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

胃癌干细胞单克隆抗体联合顺铂靶向治疗胃癌的实验研究

目的:探讨靶向胃癌干细胞单克隆抗体的生物学特征及其联合顺铂治疗胃癌的疗效.方法:采用无血清悬浮培养法和PKH26染色法确定胃癌SNU-5细胞中存在肿瘤干细胞.细胞免疫荧光法检测单克隆抗体21A3识别的抗原蛋白与PKH26+细胞及特异性抗原(CD90)在SNU-5细胞中的表达情况.无血清悬浮培养法检测流式细胞术分选出的21A3+细胞的自我更新能力以及21A3对SNU-5细胞自我更新能力的影响.CCK8法检测21A3对细胞顺铂耐药能力的影响.裸鼠体内治疗实验分析21A3联合顺铂对SNU-5移植瘤生长的抑制作用.结果:SNU-5细胞无血清悬浮培养11d后形成的细胞球体中存在单个PKH26+细胞.细胞免疫荧光显示,单克隆抗体21A3识别的抗原分子能与PKH26和CD90在SNU-5细胞上共定位.21A3+细胞体外成球率高于21A3-细胞.21A3+细胞具有更高的耐药性,21A3+细胞和21A3-细胞的IC 50分别为0.104μmol/L和0.025μmol/L.单克隆抗体21A3能够显著抑制SNU-5细胞的无血清成球,抑制率为37.5%.经21A3处理后的SNU-5细胞,耐药能力下降,其IC 50为0.001μg/ml,而对照组的IC 50为0.003μg/ml.抗体体内治疗实验结果显示,10、5、2.5mg/kg的21 A3组的肿瘤生长抑制率分别为80.6%、69.6%和59.2%,10mg/kg 21A3+顺铂组的肿瘤生长抑制率为90.6%,顺铂组的肿瘤生长抑制率为55.8%.结论:单克隆抗体21A3是抗胃癌干细胞的功能性单克隆抗体.     

大肠癌细胞HCT-15肿瘤干细胞样细胞分离及成瘤性比较

目的:依据人大肠癌细胞HCT-15的表面标志物,分离其中的干细胞亚群。建立裸鼠体内原代大肠癌荷瘤模型,比较各亚群肿瘤体积和质量。方法:利用免疫磁珠分选技术,分离其中CD133/CD44干细胞亚群。分选得到CD133+CD44+、CD133+CD44-亚群分别接种于裸鼠体内,并观察肿瘤大小和质量。结果:CD133+CD44+和CD133+CD44-细胞亚群成功的从HCT-15细胞中分离出来。接种CD133+CD44+细胞的裸鼠形成的肿瘤体积［（2.76±0.22）cm3］和质量［（5.2±0.21）g］明显高于接种CD133+CD44-细胞裸鼠的肿瘤体积与质量［（1.56±0.34）cm3,（3.4±0.18）g］（P＜0.05）。结论:CD44阳性的大肠癌肿瘤干细胞成瘤能力明显高于CD44阴性的大肠癌肿瘤干细胞。     

5-FU对小鼠乳腺癌4T1细胞株中肿瘤干细胞样细胞的富集作用

目的:探讨以氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)处理并通过荷瘤小鼠模型体内传代的方法富集乳腺癌干细胞样细胞的可行性,为靶向肿瘤干细胞治疗奠定基础.方法:以乳腺癌细胞株4T1皮下接种小鼠制备荷瘤模型,以一定剂量5-FU腹腔注射4周;处死小鼠后取肿瘤组织制成细胞悬液,并接种小鼠制备下一代小鼠荷瘤模型,5-FU处理及再次传代方法同上,共传4代.对照组小鼠给予生理盐水注射,其余处理同模型组.流式细胞术检测各代肿瘤组织中CD44+ CD24-/low细胞比例,Hoechast 33342染色法检测侧群(side population,SP)细胞的比例,免疫组化法检测CD55和ALDH1蛋白的表达,倒置显微镜观察乳腺癌细胞微球体的形成,小鼠致瘤实验检测不同肿瘤细胞的致瘤能力.结果:各代对照组小鼠模型肿瘤组织中CD44+CD24-/low细胞比例为(11.5±0.9)％,SP细胞比例为(9.7±1.3)％,ALDH1表达阴性,CD55强阳性表达细胞数为(0.6±0.3)％,乳腺癌细胞微球体比例为(0.5±0.2)％;5-FU处理组4代小鼠模型肿瘤组织中CD44+ CD24-/low细胞比例分别为(49.8±1.2)％、(56.8％±1.7)％、(66.4±1.5)％、(69.0±1.6)％,SP细胞比例分别为(25.0±1.2)％、(42.6±2.8)％、(58.4±2.1)％、(61.3±2.6)％,ALDH1阳性表达细胞比例为(3.8±0.7)％、(14.1±2.4)％、(25.2±3.1)％、(27.5±2.7)％,CD55强阳性细胞比例为(7.8±1.6)％、(10.1±2.0)％、(15.6±1.4)％、(17.3±1.9)％,乳腺癌细胞微球体形成比例为(5.9±0.4)％;两组各相应指标之间差异均具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).5-FU作用后富集了肿瘤干细胞的第3代肿瘤细胞的致瘤作用显著强于对照组细胞(P＜0.05).结论:5-FU作用并通过荷瘤小鼠体内传代能够富集小鼠乳腺癌4T1细胞株中的肿瘤干细胞样细胞.     

靶向胃癌干细胞单克隆抗体2C12的鉴定及功能研究

目的:研究胃癌干细胞的功能性单克隆抗体2C12体外功能实验,为胃癌干细胞的靶向治疗提供候选单抗药物。方法:以胃癌细胞系SNU-5为细胞模型,流式细胞术检测其亲本细胞和通过无血清悬浮培养的球体细胞中2C12+细胞的表达水平,双色细胞免疫荧光检测单抗2C12和CD90识别的抗原在SNU-5细胞中的表达情况。流式细胞术分选SNU-5细胞中2C12+和2C12-细胞,采用无血清悬浮培养成球实验和Transwell小室法分别检测其自我更新能力和侵袭能力。用单抗2C12处理SNU-5的球体细胞后,检测其对SNU-5的球体细胞自我更新能力和侵袭能力的影响。结果:2C12+细胞在SNU-5的球体细胞中的表达水平明显高于亲本细胞。免疫荧光结果显示单抗2C12识别的抗原分子能与CD90在SNU-5细胞上共定位。流式细胞术分选结果表明SNU-5细胞中2C12+细胞成球数明显高于2C12-细胞（103.3±9.07 vs 50.67±5.86）（P<0.01）,侵袭能力也明显较高（209.3±12.9 vs 99.0±3.61）（P<0.01）。对2C12单抗的体外功能研究发现,不同浓度的单抗2C12（0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL）能显著抑制SNU-5的球体细胞的成球能力（122.0±5.66、83.0±5.66、59.0±4.24）,抑制率达到31.97%和51.64%,同时侵袭能力也显著降低（178.0±8.49、106.5±5.0、78.0±2.83）,抑制率达到40.17%和56.18%。结论:单抗2C12是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,能够显著抑制胃癌干细胞的干性相关特征,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

抗胃癌干细胞单克隆抗体的筛选鉴定及功能研究

目的:筛选鉴定靶向胃癌干细胞的功能性单克隆抗体,为胃癌干细胞靶向治疗提供抗体候选药物。方法:以胃癌细胞系BGC-823为模型,采用流式细胞术分选CD44+细胞后检测其自我更新和致瘤能力。双色细胞免疫荧光检测单抗11H5和CD44在BGC-823细胞中的表达情况。流式细胞术分选11H5+细胞后检测其自我更新能力、细胞增殖和耐药能力。结果:流式细胞术分选CD44+细胞成球率明显高于CD44-细胞［（27.2±1.6）% vs （12.9±1.2）%］（P<0.01）,CD44+细胞的致瘤性比CD44-细胞至少高100倍。细胞免疫荧光结果显示单抗11H5识别的抗原能与CD44在BGC-823细胞上共定位。流式细胞术分选11H5+细胞体外成球率明显高于11H5-细胞［（21.4±2.0）% vs （6.2±1.0）%］（P<0.01）,耐药性也明显高于11H5-细胞(IC50值:0.986 μmol/L vs 0.315 μmol/L)。抗体体外功能研究发现,单抗11H5能显著抑制BGC-823细胞成球,抑制率达到47.9%。单抗11H5能抑制其sphere细胞的增殖,抑制率为44.9%（P<0.05）。经单抗11H5作用的耐药能力显著降低(IC50值:0.52 μg/ml vs 0.64 μg/ml)。结论:单克隆抗体11H5是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。     

人前列腺癌细胞系DU 145中肿瘤干细胞样侧群细胞的分离

目的:分离人前列腺癌细胞系DU 145中的侧群(side population,SP)细胞,并初步分析其生物学特性。方法:采用荧光激活细胞分类(fluorescence activated cell sorting,FACS)技术,从DU 145细胞中分离出侧群细胞,并检测其比例;继而培养于无血清培养基中,观察其生长特性。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测侧群细胞中ABCG2的表达水平。结果:DU 1 4 5细胞中存在含量极少的侧群细胞,比例约1.1%;培养于无血清培养基中成簇生长。和对应的母系DU 145细胞相比,DU 145侧群细胞的ABCG2表达增高。结论:人前列腺癌细胞系DU 145中存在具有肿瘤干细胞特性的侧群细胞。     

Identification of a cancer stem-like population in the Lewis lung cancer cell line

Objective: Although various human cancer stem cells (CSCs) have been defined, their applications are restricted to immunocompromised models. Developing a novel CSC model which could be used in immunocompetent or transgenic mice is essential for further understanding of the biomolecular characteristics of tumor stem cells. Therefore, in this study, we analyzed murine lung cancer cells for the presence of CSCs. Methods: Side population (SP) cells were isolated by fluorescence activated cell sorting, followed by serum-free medium (SFM) culture, using Lewis lung carcinoma cell (LLC) line. The self-renewal, differentiated progeny, chemosensitivity, and tumorigenic properties in SP and non-SP cells were investigated through in vitro culture and in vivo serial transplantation. Differential expression profiles of stem cell markers were examined by RT-PCR. Results: The SP cell fraction comprised 1.1% of the total LLC population. SP cells were available to grow in SFM, and had significantly enhanced capacity for cell proliferation and colony formation. They were also more resistant to cisplatin in comparison to non-SP cells, and displayed increased tumorigenic ability. Moreover, SP cells showed higher mRNA expression of Oct-4, ABCG2, and CD44. Conclusion: We identified SP cells from a murine lung carcinoma, which possess well-known characteristics of CSCs. Our study established a useful model that should allow investigation of the biological features and pharmacosensitivity of lung CSCs, both in vitro and in syngeneic immunocompetent or transgenic/knockout mice.     

人卵巢癌细胞系干/祖细胞分离及其鉴定

目的:自人卵巢癌细胞系SK-OV-3中分离干/祖细胞并进行鉴定。方法:采用无血清球形体形成法从SKOV-3中分离培养卵巢癌干/祖细胞;采用实时定量PCR和蛋折质印迹法测定球形体细胞干/祖细胞相关标志ABCG2、Oct-4、Nanog基因和蛋白的表达;流式细胞仪检测其耐药性;双层软琼脂检测其克隆形成能力;NOD/SCID小鼠检测其体内致瘤性。结果:球形体细胞表达干/祖细胞相关标志Oct-4、ABCG2、Nanog;对顺铂高耐药;在双层软琼脂上克隆形成率达(13.67±1.48)%;1 000个球形体形成细胞就能在NOD/SCID鼠中成瘤。结论:采用无血清培养基中球形体形成法从SKOV-3细胞系中可以分离出具有干/祖特性的卵巢癌细胞,可为今后研究卵巢癌的发生、发展、复发及其化疗药物筛选提供简便实用的体外模型。     

舌癌耐药细胞株的建立及癌干细胞特性的实验观察

目的建立舌癌耐药细胞株,并观察耐药细胞株癌干细胞的相关生物学特性。方法以低浓度阿霉素持续增量诱导法建立TCA-8113舌癌耐药细胞株,并对亲代与舌癌耐药细胞株进行癌细胞基本特性、癌干细胞相关细胞学特性的检测,分别以计数法检测癌细胞生长曲线、倍增时间以及用MTT法测定耐药倍数,并进行单个细胞成克隆实验、平板克隆形成实验和悬浮球形成实验。结果TCA-8113舌癌耐药细胞为“铺路石”状上皮样生长方式,但其中异形细胞略多,耐药倍数为22倍;生长曲线提示其增殖速度明显低于亲本TCA-8113舌癌细胞,且倍增时间增加,但在细胞周期中各期细胞比例未见明显改变;TCA-8113舌癌耐药细胞克隆形成率、单个细胞培养成株率均明显低于其亲本TCA-8113舌癌细胞（P〈0．05）。结论低浓度阿霉素持续增量法可诱导形成舌癌耐药细胞株,但舌癌耐药细胞株的癌干细胞特征并不明显。     

人结肠癌ccl227细胞系肿瘤干细胞生长特性研究

目的：研究体外培养条件下人结肠癌ccl227细胞系肿瘤干细胞的生长特性。方法：用荧光染料Hoechst33342染色培养在SSM和SFM中的ccl227细胞,荧光显微镜观察SP细胞。用6孔板接种的方法绘制ccl227细胞的生长曲线。显微镜观察肿瘤球的生长。结果：在两种培养条件下均观察到ccl227细胞系中存在浅染和拒染的SP细胞。生长曲线显示在两种培养条件下,ccl227细胞的繁殖能力不同。在玻璃培养瓶和低吸附6孔板中均可以培育出肿瘤球,但形态有些不同。结论：SSM和SFM培养条件下,ccl227细胞中均存在SP细胞;在SFM中,ccl227细胞增殖缓慢;SFM可培育出富含肿瘤干细胞的肿瘤球。在低吸附条件下,更易形成悬浮的肿瘤球。     

RhoB对胃癌细胞SGC7901的负性调控作用

目的研究RhoB对胃癌细胞SGC7901增殖调控作用。方法用PCR扩增出RhoB的全长cDNA，构建RhoB可诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB；脂质体介导法将调控载体pSwitch及诱导表达载体pGene／V5-His-RhoB先后转入人胃癌细胞SGC7901中，筛选出稳定抗性克隆；Western blot检测米非斯酮诱导后转染细胞中RhoB蛋白的表达。用MTT assay检测RhoB转染细胞株的生长速度、双苯并咪唑染料(Hoechst 33258)活细胞吸收分析法、流式细胞仪(FCM)检测RhoB对胃癌细胞凋亡指数作用。结果成功构建RhoB可诱导真核表达载体pGene／V5-His-RhoB，并经酶切和测序鉴定；转染后经潮霉素B和Zeocin筛选出稳定抗性克隆SGC7901／RhoB；米非斯酮诱导出RhoB蛋白表达，在诱导24小时后蛋白表达最高；细胞增殖试验结果显示，RhoB表达上调后胃癌细胞增殖受到抑制；细胞凋亡检测提示高表达RhoB可明显诱导胃癌细胞凋亡。结论RhoB对胃癌细胞增殖具有负性调控作用，可诱导胃癌细胞出现凋亡。     

人结肠癌ccl227细胞系肿瘤干细胞生长特性研究

目的:研究体外培养条件下人结肠癌cc l227细胞系肿瘤干细胞的生长特性。方法:用荧光染料Hoechst33342染色培养在SSM和SFM中的cc l227细胞,荧光显微镜观察SP细胞。用6孔板接种的方法绘制cc l227细胞的生长曲线。显微镜观察肿瘤球的生长。结果:在两种培养条件下均观察到cc l227细胞系中存在浅染和拒染的SP细胞。生长曲线显示在两种培养条件下,cc l227细胞的繁殖能力不同。在玻璃培养瓶和低吸附6孔板中均可以培育出肿瘤球,但形态有些不同。结论:SSM和SFM培养条件下,cc l227细胞中均存在SP细胞;在SFM中,cc l227细胞增殖缓慢;SFM可培育出富含肿瘤干细胞的肿瘤球。在低吸附条件下,更易形成悬浮的肿瘤球。     

人小细胞肺癌细胞株H446侧群细胞的生物学特征

背景与目的:肿瘤干细胞学说的提出为肿瘤治疗提供了新的靶点和方向,但肿瘤干细胞的分离纯化一直是个难题。本研究拟从人小细胞肺癌细胞株H446中分离并鉴定出具有干细胞特性的侧群(SP)细胞,研究其生物学特征,为肿瘤干细胞的分离纯化奠定基础。方法:采用荧光激活细胞分选(FACS)技术分选得到H446细胞中SP细胞和非侧群(NSP)细胞,并检测纯度。观察形成悬浮肿瘤细胞球的能力,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量PCR检测这两种细胞亚群中CD133、ABCG2、NucleosteminmRNA水平。MTT法比较SP细胞、NSP细胞及未分选细胞体外增殖能力及耐药性差异,流式细胞仪检测体外分化能力,裸鼠成瘤实验检测体内成瘤能力。结果:荧光显微镜下H446细胞中Hoechst33342阴性细胞约为(5.1±0.2)%。流式细胞分选结果显示,H446中SP细胞比例为(6.3±0.1)%。SP细胞在无血清培养基中形成悬浮肿瘤细胞球的能力强于NSP细胞。CD133、ABCG2在SP细胞中的表达是NSP细胞的(21.60±0.26)倍、(7.10±0.14)倍,差异有统计学意义(P<0.01);Nucleostemi...     

Pygopus2的表达下调抑制肺癌细胞的增殖能力

目的:探讨肺癌细胞中Pygopus2（Pygo2）的表达及意义。方法:Western Blot明确肺癌细胞系中Pygo 2的表达后,应用 siRNA、MTT、流式细胞术等方法检测及其表达对肺癌细胞增殖凋亡能力的影响。结果:肺癌细胞系中存在Pygo2的过表达,其表达下调能够通过阻滞细胞周期及促进细胞凋亡,进而抑制肺癌细胞的增殖能力。结论:Pygo2的异常表达是导致肺癌发生发展的重要因素。