细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF-1α的重组腺病毒

目的:利用细菌内同源重组快速构建携带hSDF-1α cDNA重组腺病毒质粒和制备表达hSDF-1α重组腺病毒. 方法: 制备感受态BJ5183,将pAdEasy-1转化BJ5183,制备含pAdEasy-1的BJ5183感受态,将线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdEasy-1的BJ5183感受态菌. 采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α. pAd-EGFP-hSDF-1α用Pac Ⅰ线性化后,再用LipoVec介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α. 采用荧光显微镜下观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况. 结果:pShuttle-EGFP-hSDF-1α成功地转化了含pAdEasy-1的BJ5183,并在其内发生了同源重组. 荧光显微镜下观察证实了pAd-EGFP-hSDF-1α转染AD293后,产生了重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α. 病毒滴度为4.1×1015 pfu/L. 结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达hSDF-1α的高滴度重组腺病毒. 为研究hSDF-1α在动员骨髓源干细胞迁移到组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

细菌内同源重组高效制备人突变p27基因重组腺病毒

目的:利用细菌内同源重组法,构建含人突变p27(hp27mt)基因重组腺病毒. 方法:hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出,亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-hp27mt;然后再用PmeI线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组. 重组质粒鉴定正确后经PacI酶切,转入Ad293细胞,包装成重组腺病毒Ad-hp27mt. 采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用紫外分光光度计进行滴度测定. 结果:用含pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183后,可获得约30%的阳性重组质粒. PCR检测表明重组腺病毒含有目的基因. 滴度为7.95×1015 pfu/L. 结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备均一的高滴度重组腺病毒. 为研究p27mt对消化道肿瘤的治疗奠定了基础.     

细菌内同源重组法高效制备携带增强型绿色荧光蛋白与人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组腺病毒载体

目的:利用细菌内同源重组法快速构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人内皮型一氧化氮合酶(he-NOS)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达EGFP和heNOS的重组腺病毒。方法:质粒载体pHCMV SP1A-heNOS用EcoRⅠ酶切,回收heNOS cDNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,形成转移质粒pShuttle-heNOS-EGFP;然后用PmeI线性化后的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定后经PacⅠ酶切,转入AD 293细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP,纯化,鉴定,滴度测定。结果:heNOS cDNA成功地插入到穿梭质粒中,pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP。重组腺病毒经PCR检测表明携带有目的基因heNOS,滴度约为6.5×1015pfu/L。结论:细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP为勃起功能障碍的基因治疗奠定了基础,携带的EGFP标记基因可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况。     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

应用AdEasy腺病毒载体系统构建人GST-π基因的重组腺病毒

目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建人谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）基因重组腺病毒并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法：从质粒中通过PCR的方法扩增出目的基因GST-π并带有适宜的酶切位点,双酶切后连pAdtrackCMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdtrack-GST-π,经酶切线性化后,采用电穿孔转化到含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细菌中,挑选同源重组质粒AdEasy-GST-π,酶切线性化重组质粒并转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。重组病毒上清乒乓交互感染HEK293细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果：经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论：成功地构建了携带GST-π基因的重组腺病毒载体,为利用GST-π基因转染造血干细胞的基因治疗奠定了基础。     

乙肝病毒X基因重组腺病毒载体的构建

目的为了探讨HBx基因与肝癌发生的关系,构建HBx基因重组腺病毒载体。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统,首先从质粒pCDNA3．1-HBx中酶切得到HBx基因,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack—CMV中,得到pAdTrack—CMV—HBx,将其PmeI酶切线性化后,转到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中,通过同源重组得到重组腺病毒质粒载体pAd—HBx,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚肾293细胞,产生重组腺病毒颗粒Ad—HBx。结果、PCR和酶切鉴定证明重组腺病毒Ad—HBx构建成功,在转染的293细胞中可以观察到绿色荧光蛋白GFP。结论成功构建了携带HBx基因的重组腺病毒载体,为后续研究奠定了基础。     

携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒的构建及其在人血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒质粒pAd-GFP,制备重组腺病毒Ad-GFP,并使GFP在血管平滑肌细胞中得到高效表达。方法:将线性化的穿梭质粒pRNAT-H1.1与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在感受态BJ5183内进行同源重组,并筛选出阳性重组子pAd-GFP;用Pac I酶切线性化pAd-GFP,线性化的腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞,进行重组腺病毒的包装和扩增。采用CsC1密度梯度离心进行病毒浓缩和纯化。获得的腺病毒感染人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell,hVSMC),观察其感染效率和GFP表达水平。结果:通过Pac I酶切证实腺病毒载体构建成功,包装出携带GFP基因的腺病毒,滴度达到4.5×1012pfu/mL,获得的腺病毒对hVSMC的感染效率约为100%。结论:利用细菌内同源重组方法成功地构建了携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒,并能够在hVSMC细胞中高效地表达,为利用GFP作为报告基因的研究奠定了实验基础。     

新法制备含VEGF启动子驱动的CD／TK融合基因重组腺病毒

目的 应用简化的细菌内同源重组法高效制备含血管内皮细胞生长因子(VEGF)启动子驱动的CD／TK融合基因重组腺病毒。方法 先以氯化钙法替代电穿孔法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌，制备BJ5183pAdEasy-1细菌；再以后者作感受态细菌，与线性化的转移质粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK进行同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK，转染293细胞，制备含VEGF启动子驱动的CD／TK融合基因重组腺病毒。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为60％(6／10)。转染293细胞后7～12d可收获病毒。结论 简化的细菌内同源重组法简便易行，重组效率较高，易于推广应用。     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。