胍丁胺拮抗谷氨酸所致大鼠海马神经元兴奋性神经毒性的研究

目的探讨胍丁胺对L-谷氨酸（Glu）诱导的大鼠海马神经元损伤的影响。方法采用大鼠原代海马神经元培养的方法,用不同浓度Glu（1、10、100μmol/L）处理原代培养海马神经元1h,建立Glu诱导的原代培养大鼠海马神经元损伤模型,经乳酸脱氢酶（LDH）活性检测和显微镜下观察,确定建立大鼠海马神经元损伤模型的最佳浓度。处理组在已建立的大鼠海马神经元损伤模型中加入不同浓度（10、50、100μmol/L）胍丁胺,观察胍丁胺对Glu诱导的海马神经元损伤的作用。未经Glu处理的为正常对照组。结果上清液中的LDH活性（P〈0.01）和形态学观察均提示100μmol/L Glu为诱导原代海马神经元损伤的最佳浓度;100μmol/L胍丁胺能显著抑制模型中大鼠海马神经元LDH的释放（P〈0.01）;明显改善损伤后的神经元形态。结论胍丁胺对Glu诱导的大鼠海马神经元损伤具有保护作用。     

胎鼠海马神经细胞的原代培养及鉴定

目的建立较理想的SD大鼠胎鼠海马神经细胞体外原代培养方法。方法孕18 d(E18)SD大鼠的胎鼠,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法进行海马神经元的原代无血清培养。结果在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化,并能形成典型的神经细胞网络。结论该培养技术是海马神经细胞体外培养的理想方法。     

原代SD大鼠海马神经元扫描电镜形态学特点

目的:观察体外培养的原代海马神经元扫描电镜形态学特点。方法:体外培养新生SD乳鼠原代海马神经元,行免疫细胞化学鉴定,用扫描电镜观察其形态学特点。结果:培养的海马神经元形态多样,梭形神经元胞体较大,伸出两个突起;神经元细胞有的基底宽广,突起有粗有细,与周围的神经元细胞连结紧密;锥体细胞从胞体发出2～3个突起,从粗大的突起上又分出突起;培养的神经元以锥体形为主,其次为梭形、三角形。结论:培养的神经元为MAP-2染色阳性,扫描电镜可见神经元胞体及突起形成神经元的特有结构。     

大鼠脑海马神经元原代培养方法的建立及其纯度的鉴定

目的：为建立一种稳定的大鼠胎鼠海马神经元培养方法并能够有效的鉴定其纯度。方法：分离Wista大鼠胚胎并取海马组织,比较两种常用酶,胰酶和木瓜酶消化效果对海马神经元产量的影响及两种不同培养方法对海马神经元纯度的影响。结果：培养的神经元胞体清晰晕光明显,应用两种不同的酶消化对神经元的产量影响无明显统计学意义,而应用无血清方法培养神经元在纯度上要优于应用阿糖胞苷去除神经胶质细胞的培养方法。结论：采用木瓜酶消化并用无血清培养的方法培养大鼠胎鼠海马神经元,稳定可靠,提高了原代神经元培养的产量和纯度。     

新生大鼠海马神经元的原代培养与鉴定

目的:探讨建立简便高效的大鼠海马神经元原代培养的纯化方法。方法:(1)离体培养新生24 h内SD乳鼠海马神经元,每天在倒置相差显微镜下进行神经元的形态学观察;(2)MTT法检测培养不同时间段神经元的活力变化,并绘制生长曲线;(3)纯化培养9 d神经元利用免疫荧光染色法检测β-微管蛋白Ⅲ(β-tublinⅢ)的表达率。结果:(1)倒置相差显微镜下观察原代培养的海马神经元,刚分离种植时可见神经细胞为圆形,24 h大多数细胞贴壁,3 d细胞突起增大、增粗,培养5~7 d神经元胞体丰满,突起交织成的网络更密集,培养14~16 d后,神经元开始退化;(2)生长曲线结果发现海马神经元体外培养经历了4个时期,即生长潜伏期、对数生长期、平台期、生长停滞期;(3)经β-tublinⅢ鉴定海马神经元纯度为(93.0%±2.5%)。结论:本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础。     

牛磺酸对锰致原代培养海马神经元细胞氧化应激损伤的影响

目的：研究牛磺酸对锰引起的海马神经元细胞氧化应激损伤的影响。方法：采用原代培养方法,对大鼠海马神经元细胞进行原代培养后给予牛磺酸干预及染锰处理,用光学显微镜观察细胞形态学改变,MTT法测定细胞活力;荧光测定法检测细胞内活性氧族的生成和增加。结果：各牛磺酸干预组细胞生长活性均高于同级染锰剂量的染锰组;随着处理时间、染锰浓度的增加,细胞内氧化应激活性氧（ROS）含量均跟随增加;牛磺酸一定程度上可拮抗锰引起的原代培养海马神经元细胞氧化应激损伤。结论：牛磺酸对锰诱导的海马神经元细胞氧化应激损伤具有保护作用。     

体外铅暴露对发育脑海马第Ⅱ组mGluRs基因表达的影响

目的研究铅暴露对发育脑海马第Ⅱ组代谢性谷氨酸受体(mGluRs)基因表达的影响.方法在体外培养3d的原代胚鼠海马神经元中加入氯化铅暴露3周,用实时荧光定量RT-PCR方法,检测不同程度的铅暴露对胚鼠海马神经元第Ⅱ组mGluRs基因表达的影响.结果胚鼠海马神经元铅暴露后,第Ⅱ组mGluRs基因表达较正常对照组增高,铅暴露水平不同,诱发的基因表达变异情况亦不同.结论铅暴露引起发育脑海马第Ⅱ组mGluRs基因的上调可能是其影响学习记忆的机制之一.     

体外铅暴露对发育脑海马第Ⅱ组mGluRs基因表达的影响

目的研究铅暴露对发育脑海马第Ⅱ组代谢性谷氨酸受体(mGluRs)基因表达的影响.方法在体外培养3d的原代胚鼠海马神经元中加入氯化铅暴露3周,用实时荧光定量RT-PCR方法,检测不同程度的铅暴露对胚鼠海马神经元第Ⅱ组mGluRs基因表达的影响.结果胚鼠海马神经元铅暴露后,第Ⅱ组mGluRs基因表达较正常对照组增高,铅暴露水平不同,诱发的基因表达变异情况亦不同.结论铅暴露引起发育脑海马第Ⅱ组mGluRs基因的上调可能是其影响学习记忆的机制之一.     

低密度体外培养大鼠海马神经元的形态学观察

目的 :建立大鼠海马神经元低密度体外培养方法 ,并观察其发育分化过程中的形态学指征变化情况 .方法 :采用神经元与星形胶质细胞立体共培养方法 .首先以新生大鼠为实验材料培养纯化单层星形胶质细胞 ,随后以孕 18d胎鼠为实验材料 ,分离海马皮层 ,经胰酶消化制备单细胞悬液 .以(2～ 5 )× 10 3·cm-2 密度接种于包被有多聚赖氨酸的盖玻片上 ,而后采用无血清培养液与星形胶质细胞立体共培养 ,并对不同培养时间的神经元进行形态学观察 .结果 :利用低密度体外培养方法成功培养出海马神经元 ,其在不同发育分化阶段具有不同的形态学特征 .结论 :低密度培养的海马神经元不同发育分化阶段具有不同的形态学特征 ,为今后的相关研究奠定了基础     

Aβ25-35对海马和隔区胆碱能神经元毒性的比较

目的 探讨Aβ25-35对原代培养的海马神经元和隔区神经元毒性作用。方法 采用体外原代培养,用Aβ25-35诱导大鼠海马和隔区神经元损伤,MTT法比较两种神经元的存活率,电镜下的形态学变化、并测定SOD活性的改变。结果 Aβ25-35可使海马和隔区神经元的存活率下降,发生凋亡的形态学改变,对两种神经元的Mn-SOD的活性无明显影响,但可使海马神经元CuZn-SOD活性明显下降。结论 Aβ25-35具有神经毒性,它对两种神经元的损伤程度相似,无细胞差异性,但其毒性损伤作用可能不同。     

大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型的建立

目的建立大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型。方法在大鼠鼠胚海马神经元培养基础上,给予不同时间的缺氧复氧,应用Wright-Giemsa染色、TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果随着缺氧和复氧时间的延长神经细胞凋亡数逐渐增加,其中缺氧4 h复氧48 h大鼠海马神经细胞凋亡最为显著。结论缺氧复氧可诱导培养的大鼠海马神经细胞发生凋亡,缺氧4 h复氧48 h可作为细胞凋亡模型。     

新生大鼠海马神经元的原代培养方法

目的：介绍一种条件简单，生长良好的海马神经元培养方法。方法：急性分离及原代培养海马神经元，并用膜片钳全细胞记录方法观察培养好的神经元电生理学特性。结果：培养的神经元胞体清晰，晕光明显，表达了多种电压门控和化学门控离子通道。结论：本实验方法简单、可靠，保持了神经元结构和功能特性。     

原代培养新生大鼠海马神经元实验技术的建立

目的：摸索应用适合培养条件获取新生大鼠海马神经元的技术方法。方法：采用较低浓度、短时的酶消法配合应用含B-27的特殊培养基培养海马神经元细胞。结果：培养出的新生大鼠海马神经元结构特征明显且生长良好,有较高纯度。结论：本方法可以稳定地获得较高纯度的新生大鼠海马神经元。     

姜黄素对离体培养大鼠海马神经元突触传递的影响

目的 探讨姜黄素对离体培养的大鼠海马神经元突触传递的影响.方法 离体培养胚胎18 d SD大鼠海马神经元,9 d后加入姜黄素(终浓度10 μmol/L),继续培养24 h,采用全细胞膜片钳技术,自由记录模式,观察姜黄素对海马神经元自发兴奋性突触后电流(sEPSC)和微小兴奋性突触后电流(mEPSC)频率和幅度的影响.结果 (1)姜黄素干预的海马神经元sEPSC频率(1.4 Hz±0.5 Hz)明显高于对照组(0.8 Hz±0.4 Hz,P＜0.01);但姜黄素组海马神经元sEPSC幅度(1834 pA±244 pA)和对照组海马神经元sEPSC幅度(1721 pA±391 pA)比较差异没有统计学意义(P=0.115).(2)姜黄素干预的海马神经元mEPSC频率(6.4 Hz±0.8 Hz)明显高于对照组(5.1 Hz±0.9 Hz,P＜0.01);但姜黄素组神经元mEPSC幅度(34 pA±10 pA)和对照组海马神经元mEPSC幅度(30 pA±9pA)比较差异没有统计学意SL(P=0.057).结论 姜黄素可以增强海马神经元突触传递,这可以为最近研究发现姜黄素具有缓解脑缺血、改善AD大鼠认知功能提供神经电生理学依据.     

谷氨酸受体拮抗剂对培养大鼠海马神经元活力的影响

目的:观察N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂卓西平马来酸盐、艾芬地尔、CGP-37849、L-701.324、HA-966和AMPA受体拮抗剂NBQX分别对培养大鼠海马神经元细胞活力的影响。方法:取孕18天的SD胎鼠海马神经元细胞原代培养,培养的细胞在加入上述药物后,在培养第2天和第7天行台盼蓝染色观察细胞存活情况,四甲基偶氮唑盐法检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:各浓度的卓西平马来酸盐对培养大鼠海马神经元活力均产生显著毒性。高浓度艾芬地尔和L-701.324可诱导细胞产生凋亡,而低浓度则没有显著作用。各浓度的CGP-37849、NBQX和HA-966对细胞存活无显著影响。结论:只有非选择性NMDA阻断剂MK-801,可降低大鼠海马神经元细胞活力并诱导其凋亡。     

红藻氨酸作用后海马神经元胞膜表面的超微结构的原子力显微镜观察

目的 观察原代培养神经元在红藻氨酸(KA)作用下细胞表面形态的三维构像变化。方法 利用原子力显微镜(AFM)对大鼠海马神经元经不同浓度的KA(25和250μmol／L，50和100nmol／L)分别作用10min和100min后的表面结构进行纳米级水平扫描和观测。结果 正常海马神经元表面光滑，起伏均匀、规律；KA作用后神经元呈退行性改变，表现为胞体肿胀，胞膜表面粗糙，出现隆起和“孔洞”样结构，并且其变化程度分别与作用时问和KA浓度呈量-效关系。结论 KA对海马神经元毒性作用后胞膜表面超微结构所产生的明显变化，可借助AFM清晰观察，并定量分析。     

大鼠海马神经元缺氧/复氧后caspase-3活性的变化

目的：研究caspase-3在体外培养的海马神经元缺氧／复氧损伤中的作用及其抑制剂的干预效果，为缺血性脑损伤的治疗提供实验资料。方法：诱导体外培养的大鼠海马神经元缺氧3h，再复氧12－4，并在缺氧前1h用不同剂量的caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CMK进行干预处理，应用MTT比色法测定细胞存活率，底物裂解法caspase-3活性。结果：缺氧／复氧后大鼠海马神经元存活率逐渐降低，caspase-3活性明显增强，复氧24h达高峰；用Ac-DEVD-CMK预处理的海马神经元caspase-3活性降低，细胞存活率增高，并呈剂量依赖性。结论：体外培养的大鼠海马神经元缺氧及缺氧／复氧后出现迟发性死恨，caspase-3介导的细胞凋亡机制在这种损伤过程中起一定的作用，通过抑制其活性可产生神经保护作用。     

三种培养液进行海马神经元原代培养的对比研究

目的 使用3种培养液对海马神经元进行培养,遴选出一种使神经元存活率较高、存活时间较长的培养液。方法 分离SD大鼠胎鼠的海马神经元,分别用DMEM、DMEM／F12和Neurobasal培养液进行培养,应用倒置相差显微镜、台盼蓝排斥实验、MTT法和LDH释放率法进行细胞形态和细胞活力分析。结果 Neurobasal培养液培养的神经元细胞活力,与另二组培养液培养的神经元活力相比差异有显著性（P〈0．05）。结论 Neurobasal培养液可作为海马神经元体外培养的良好培养液。     

镁对N-甲基-D-天冬氨酸诱导离体海马神经元凋亡的作用

目的研究硫酸镁对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导海马神经元凋亡的影响。方法离体培养出生3d以内的SD大鼠海马神经元7d后,用NMDA诱导神经细胞凋亡,分别于处理前、后用硫酸镁处理。用Hoechst33258作凋亡形态学的判定,用MTT法作细胞生存率情况的测定。结果与对照组相比,硫酸镁能抑制NMDA诱导神经细胞凋亡,在缺氧处理前后不同时间使用硫酸镁对细胞凋亡的影响有显著差别。结论镁离子对NMDA诱导的海马神经元凋亡有保护作用。     

TRPC离子通道参与硝普钠诱导海马神经元凋亡

目的 探讨TRPC离子通道在一氧化氮供体硝普钠(SNP)诱导原代培养海马神经元凋亡中的作用.方法 原代培养的海马神经元作为空白对照组,实验组分为3组,分别为原代培养神经元中加入SNP;SNP TRPC通道阻断剂组;SNP TRPC通道激活剂组.细胞处理24 h后MTT比色法检测各组细胞存活率,Hoechest33342荧光染色观察细胞凋亡.结果 SNP处理24h,神经元存活率为67.4％;与空白对照组有显著差异(P<0.05),SNP TRPC阻断剂组神经元存活率分别为102％、92.7％,与SNP组有显著差异(P<0.05);而SNP TRPC激活剂组神经元存活率为56.9％.与SNP组有统计学差异(P<0.05);单纯给予TRPC阻断剂或激动剂对神经元存活率无明显影响.荧光显微镜下观察.空白对照组神经元胞核均匀蓝染;SNP处理组胞核明显固缩、凝聚,可见凋亡小体;SNP TRPC激动剂组可见大量凋亡细胞;而SNP TRPC阻断剂组胞核均匀蓝染.结论 TRPC离子通道参与SNP诱导海马神经元凋亡.