shRNA沉默RAGE基因表达对前列腺癌细胞增殖的抑制作用

目的:构建针对人晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products , RAGE)基因的特异性短发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)表达载体,探讨其对前列腺癌细胞DU145增殖的抑制作用.方法:设计并合成4种针对RAGE基因的特异性短链寡核苷酸,构建含shRNA RAGE的表达载体,转染高表达RAGE的亚克隆细胞株sub DU145-2C1.荧光显微镜下观察细胞转染后的情况,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative -PCR, RFQ-PCR)检测转染shRNA后对RAGE mRNA表达的影响,Western印迹法检测对RAGE蛋白表达的影响,CCK-8法检测对细胞增殖的影响,划痕实验观察对细胞迁移能力的影响.结果:构建获得的shRNA RAGE表达载体能够有效抑制RAGE基因的表达(P<0.05),其中以shRNA RAGE -1(R1)的抑制作用最强,其对RAGE mRNA表达的抑制率为84%,对蛋白表达的抑制率为27%.细胞增殖结果显示,转染shRNA RAGE后细胞增殖能力明显降低;而细胞迁移能力则无明显变化.结论:shRNA RAGE能有效下调RAGE基因的表达水平,抑制细胞增殖.     

人颊癌细胞信号转导抑制因子1沉默对细胞增殖及化疗药物敏感性的影响

目的:探讨人颊癌细胞中细胞因子信号转导抑制因子1（SOCS1）沉默与细胞增殖及化疗药物敏感性影响的关系。方法:Western blot、PCR及定量PCR验证SOCS1干扰序列沉默人颊癌细胞系BcaCD885中SOCS1的表达。MTT法检测颊癌细胞对化疗药物敏感性的变化。细胞计数法观察细胞的增殖速度。流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:将SOCS1干扰序列转染BcaCD885细胞后,SOCS1 mRNA及蛋白表达水平均明显下降。SOCS1表达抑制后,转染72h后,BcaCD885细胞数量较对照组显著减少（P＜0.05）。化疗药物卡铂和紫杉醇对BcaCD885细胞的半数抑制浓度（IC50）均显著降低（P＜0.01）。SOCS1表达抑制后BcaCD885细胞G0/G1期细胞比例明显升高,而S期和G2/M期细胞比例明显降低,与对照组比较,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:SOCS1基因沉默后,人颊癌细胞株BcaCD885的增殖能力下降,并增强对化疗药物的敏感性。     

抑癌基因PTEN对肝癌细胞增殖的抑制及作用机制

目的探讨抑癌基因PTEN对肝癌细胞增殖和细胞周期的调控作用。方法构建野生型PTEN基因和突变型PTEN基因的真核表达载体pEGFP—WT—PTEN和pEGFP—PTEN;G129R。采用脂质体介导的基因转染法,分别将上述载体转染不表达PTEN蛋白的人肝细胞肝癌细胞系HHCC,经G418筛选,获得稳定表达PTEN蛋白的细胞克隆。以流式细胞仪测定细胞周期,以Western blot法分析稳定表达PTEN蛋白的肝癌细胞内源性的磷酸化AKT表达水平,同时与未进行基因转染和转染空载体pEGFP-C1的HHCC细胞进行对照。结果稳定表达野生型PTEN蛋白的肝癌细胞,细胞生长受到明显抑制,与转染空载体的HHCC细胞比较,G1期细胞比例显著增高,G2期和S期细胞比例显著降低,且差异有统计学意义（P〈0．05）;而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞,与转染空载体的HHCC细胞比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。与转染空载体的HHCC细胞比较,稳定表达野生型PTEN蛋白的HHCC细胞,其内源性磷酸化AKT水平明显减低;而转染突变型PTEN基因的HHCC细胞,其AKT水平无明显变化。结论野生型PTEN基因对肝癌细胞周期具有调控作用,而突变型PTEN基因丧失对肝癌细胞周期的调控作用;野生型PTEN基因可能通过降低AKT的活化而实现对肝癌细胞周期的调控。     

肾癌组织Pokemon基因表达及其生物学意义的研究

目的:探讨Pokemon基因在肾细胞癌组织中的表达及其生物学意义。方法:收集47例肾癌手术切除的癌、癌旁及邻近正常组织,用逆转录实时聚合酶链反应(Real-time PCR)及蛋白质印迹法分别从核酸及蛋白水平检测标本中Pokemon基因的表达,并结合性别、年龄、肿瘤大小、病理分级和TNM分期等临床资料进行统计分析,对mRNA和蛋白表达的水平进行相关性研究。结果:Real-time PCR及蛋白质印迹法均检测出Pokemon在肾癌、癌旁及正常对照组织中的表达,差异有统计学意义,P<0.05。肾癌组织中,Pokemon的表达与肿瘤病理分级有关,而与患者的性别、年龄、肿瘤最大直径、TNM及病理类型无明显相关性。肾组织中,Pokemon的mRNA与蛋白的表达呈正相关,r=0.494,P<0.05。结论:Pokemon表达和肾癌的发病及恶性程度有关,有望成为肾癌的预后指标和肾癌靶向治疗的有效靶点。     

沉默PLCε基因对人膀胱癌裸鼠移植瘤中Bcl-2及Bax蛋白表达水平的影响

目的:探讨应用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默磷脂酶Cε (phospholipase C epsilon,PLCε)基因对人膀胱癌移植瘤生长及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响.方法:人膀胱癌BIU-87细胞种植于裸鼠皮下,待移植瘤体积达40 mm3左右时,在肿瘤部位分别直接注射建构有PLCε特异性shRNA的重组表达质粒pGenesil-PLCε、阴性对照重组pGenesil-NP质粒以及0.9%氯化钠溶液;观察肿瘤体积的变化情况,30 d后处死全部裸鼠,取瘤组织,称瘤质量;瘤组织制备病理切片,HE染色观察细胞形态的变化;RT-PCR鉴定瘤组织中PLCε mRNA的表达;Western 印迹法检测瘤组织中PLCε、Bcl-2、Bax、p-Akt1/ Akt1和p-Bad/Bad蛋白的表达.结果:pGenesil-PLCε组小鼠移植瘤生长明显缓慢,瘤组织体积和质量均明显小于对照组;HE染色结果显示,瘤组织中出现细胞核固缩和裂碎等凋亡征象;RT-PCR检测结果显示, PLCε mRNA表达明显降低(P<0.05);Western 印迹法结果提示,PLCε和Bcl-2蛋白表达量明显降低,Bax蛋白表达增加,与2个对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而Akt1、Bad蛋白的表达在实验组以及对照组中差异均无统计学意义,p-Akt1和p-Bad在移植瘤中未见表达.结论:沉默PLCε基因可明显抑制PLCε的表达,并下调Bcl-2蛋白以及上调Bax蛋白的表达,促进膀胱癌细胞凋亡而抑制肿瘤生长.     

小干扰RNA沉默survivin基因对结肠癌Caco-2细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察survivin在人结肠癌细胞Caco-2中的表达及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默survivin基因对survivin蛋白表达、细胞增殖及凋亡的影响.方法:以脂质体LipofectAMINE 2000为载体,将针对特异靶点survivin基因的siRNA转染入人结肠癌细胞Caco-2.应用免疫细胞化学SP法和Western印迹法检测survivin蛋白表达的变化,MTT法检测细胞增殖,FCM法检测细胞凋亡.结果:免疫细胞化学检测结果显示,survivin蛋白在Caco-2细胞空白对照组、脂质体对照组及阴性错配对照组的细胞质中均呈强阳性表达,而在survivin-siRNA转染组细胞质中呈弱阳性表达;Western印迹法检测结果显示,survivin-siRNA转染组细胞的蛋白条带亮度明显低于空白对照组、脂质体对照组和阴性错配对照组;MTT检测结果显示,与阴性错配对照组相比, survivin-siRNA转染组细胞生长出现明显的抑制(P＜0.05),且不同时段(24、48和72 h)的肿瘤细胞增殖抑制率之间差异有统计学意义(P＜0.05);FCM检测结果显示,survivin-siRNA转染组细胞出现明显的亚二倍体峰,细胞凋亡率(9.72%)明显高于空白对照组(P＜0.01).结论:siRNA沉默survivin基因可抑制结肠癌细胞增殖,促进细胞凋亡.推测survivin基因可能成为结肠癌基因治疗的一个新靶点.     

小分子RNA干扰Notch1基因对肾癌Caki-1细胞增殖的影响

目的：探讨Notch1在肾透明细胞癌株中的表达,采用短片段RNA（small interferhtg RNA,siRNA）干扰技术沉默肾透明细胞癌中Notch1的表达,并观察其对Caki-1增殖的影响。方法：体外培养人正常肾小管上皮细胞HK-2及人肾癌细胞786—0和Caki-1。实时荧光定量PCR（RT—PCR）检测Notch1 mRNA的表达,蛋白印迹法检测Notch1蛋白的含量。特异性Notch1 siRNA干扰肾癌Caki-1细胞,用Lipofectamine2000转染48h后,实时荧光定量PCR和蛋白印迹法分别检测其中Notch1 mRNA、蛋白的表达变化,CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果：Notch1在肾癌细胞株中的表达要明显高于正常肾小管上皮细胞,差异具有统计学意义（P〈0.05）。siRNA—Notch1干扰以后可以明显降低Caki-1细胞中Notch1 mRNA和蛋白的表达,差异具有统计学意义（P〈0.05）,同时检测Caki-1细胞增殖能力也随之下降（P〈0.05）。结论：Notch1在肾癌透明细胞癌中高表达,下调Notch1信号通路可以抑制肾细胞癌Caki—1的增殖,调节肾癌的生长。     

RNAi抑制肾癌细胞MDR1基因表达及对顺铂化疗耐药的逆转

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)对肾癌细胞多药耐药基因1(multidrug resistance,MDR1)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对顺铂(cisplatin)敏感度的变化.方法:根据MDR1基因序列设计3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染肾癌A498细胞;RT-PCR法检测转染前后MDR1 mRNA表达水平的变化,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆;Western印迹法检测MDR1蛋白表达水平;MTT法检测干扰前后顺铂对半数细胞抑制浓度(half inhibitory concentration,IC_(50))的变化.结果:3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDR1基因,使MDR1 mRNA表达水平下降67%;筛选得到稳定转染的细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降(P<0.01),并使顺铂对细胞的IC_(50)值降低约83.37%(P<0.01).结论:RNAi能有效抑制肾癌A498细胞MDR1基因的表达,并可显著增加其对顺铂的敏感度,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能.     

NS398抑制肾癌细胞增殖作用的研究

目的：探讨NS398对肾癌细胞增殖作用的影响及作用机制。方法：采用人肾癌786—0细胞系进行细胞培养,将NS398分别以25、50、100、150和200μmol／L的剂量加入细胞中,应用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞凋亡。应用RT—PCR和Western blot方法检测COX-2 mRNA及其蛋白的表达。结果：NS398对肾癌786—0细胞具有较强的抑制作用,且这种抑制作用随浓度和时间的增加而增大,呈浓度依赖关系;NS398作用肾癌786—0细胞24h后,在细胞周期G0／G1期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,随着浓度升高凋亡峰亦越来越增高,P〈0．05;RT-PCR和Western blot结果表明,不同浓度NS398作用下的肾癌786～0细胞中,COX-2 mRNA及其蛋白的表达明显减弱,且呈剂量梯度下降,P〈0．05。结论：COX-2选择性抑制剂NS398通过生长抑制、诱导调亡来抑制肾癌细胞的增殖。NS398作为活疗和预防肾癌的有效药物值得进一步深入研究。     

腺病毒介导的shRNA沉默hTERT基因表达对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨靶向人端粒酶反转录酶（hTERT)的短发夹RNA（shRNA)对人鼻咽癌细胞株CNE-2 hTERT表达的影响,及其对鼻咽癌细胞增殖和凋亡的效应。方法构建表达绿色荧光蛋白(EGFP)基因和靶向hTERT基因短发夹RNA的重组腺病毒质粒,观察其对鼻咽癌细胞株(CNE-2)的转染效果,RT-PCR检测hTERT mRNA表达水平,Western blot检测hTERT蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡状况。结果Adv-EGFP-shTERT重组腺病毒质粒转染率可达90%以上,成功转染CNE-2细胞24 h后,hTERT mRNA的表达水平显著下降,转染48 h后,hTERT蛋白表达明显下调,细胞增殖活性受到显著抑制,细胞凋亡率可达23.0%。结论腺病毒载体介导靶向hTERT基因的RNA干扰,能显著抑制端粒酶反转录酶表达,进而抑制端粒酶活性,抑制CNE-2细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌的基因治疗研究提供了理论基础。     

细胞增殖凋亡及血管生成在肾盂输尿管移行细胞癌中的作用

我们通过检测肾盂输尿管移行细胞癌中Ｋｉ 6 7、细胞凋亡、ＣＤ31的表达 ,探讨了细胞增殖、凋亡及血管生成在肾盂输尿管移行细胞癌中的作用。一、资料与方法1 研究对象 :肾盂输尿管移行细胞癌 4 2例中 ,Ｔ1期 14例 ,Ｔ2期 17例 ,Ｔ3～ 4期 11例。细胞分级为 :1级 8例 ,2级2 2例 ,3级 12例。2 细胞增殖、微血管密度和原位凋亡细胞的检测 :用免疫组化ＳＰ法检测Ｋｉ 6 7与ＣＤ31的表达 ,用ＴＵＮＥＬ法检测凋亡细胞。在每张切片阳性细胞最密集的区域中 ,计数 10 0 0个肿瘤细胞 ,并按Ｋｉ 6 7阳性细胞所占的比率计算增殖指数(ＰＩ) ;按ＴＵＮ…     

shRNA表达载体介导的细胞周期蛋白E1基因沉默对肾癌ACHN细胞生长的抑制作用

背景与目的: 肾细胞癌中细胞周期蛋白E1(eyclinE1)的过表达与预后密切相关.为进一步验证其作为肿瘤基因治疗新靶点的可行性,本研究探讨shRNA表达载体介导的cycl inE1基因沉默对肾癌ACHN细胞生长的抑制作用.方法:针对cyclinE1基因设计并合成特定的RNA干扰模板片段,连接到pGenesil-1-U6载体上构建shRNA真核表达载体;将上述重组载体经脂质体转入ACHN肾癌细胞株.RT-PCR、Western印迹分析cyclinE1基因mRNA及蛋白表达抑制率;MTT比色法绘制细胞生长曲线;流式细胞术测细胞周期和凋亡细胞比率;Transwell小室体外侵袭实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力.结果: shRNA重组载体介导肾癌ACHNcyclihE1抑制效果显著(0.09±0.05),显著低于空载体对照组(0.884±0,04)及未转染组(0.904±0.03)(P<0.05).经流式细胞术测得转染重组质粒组细胞生长停滞于G1期且凋亡比率显著升高(11.154±4.00)%(P<0.05).生长曲线结果显示重组载体转染组细胞生长明显缓慢(P<0.05).Transwell及迁移实验结果提示,转染重组质粒组细胞侵袭和迁移能力显著下降(P<0.05). 结论: 肾癌cycl inE1的表达可被载体介导诱发的RNA干扰所成功抑制,进而导致细胞生长、增殖以及侵袭能力受抑并诱导凋亡;本研究为探讨肾癌的RNAi治疗提供了初步实验依据.     

DEK基因沉默对宫颈癌CaSki细胞增殖和凋亡影响的研究

目的:通过观察DEK基因沉默后对CaSki细胞增殖、细胞周期及凋亡影响,探讨DEK原癌基因siRNA对宫颈癌细胞的影响和机制.方法:将DEK siRNA真核表达载体转入CaSki细胞,转染48 h后,采用MTT法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期改变情况.结果:与对照组和未转染组相比,转染psiRNA-hH...     

siRNA干扰FLOT2基因表达对肾细胞癌细胞增殖的影响

目的:探讨FLOT2在肾细胞癌细胞株中的表达,并观察小干扰RNA沉默FLOT2基因对肾细胞癌786-O细胞增殖能力的影响。方法:将化学合成的FLOT2的小干扰siRNA用脂质体 Lipofectamine2000转染至肾细胞癌786-O细胞;分别用RT-PCR、Western blot方法检测细胞转染前后FLOT2以及细胞增殖相关因子CCND1的表达。CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果:转染FLOT2-siRNA的肾细胞癌786-O细胞,RT-PCR、Western blot检测显示FLOT2在基因及蛋白水平明显下调（P<0.05）;与对照组比较786-O细胞增殖能力明显下降（P<0.05）,细胞增殖相关因子CCND1明显下调（P<0.05）。结论:FLOT2在肾细胞癌细胞系中高表达,采用特异性FLOT2-siRNA 能够显著降低FLOT2和CCND1表达。干扰FLOT2表达能显著抑制786-O细胞的增殖,FLOT2基因可能参与了肾细胞癌的生物学行为。     

shRNA沉默Sp1对胶质瘤细胞放射敏感性的影响

目的 探讨下调Sp1基因表达对胶质瘤细胞放射敏感性的影响。方法 设计并合成编码shRNA的寡核苷酸序列,克隆入LV3（H1/GFP&Puro）载体中构建重组体。然后重组慢病毒分别感染U251和U87细胞,嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株。荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测细胞中Sp1 mRNA和蛋白表达水平;克隆存活法检测细胞存活;流式法检测细胞周期;免疫荧光法检测DNA损伤程度。结果 两株胶质瘤细胞在感染72 h后荧光显微镜观察Sp1慢病毒载体均高表达,RT-PCR和蛋白质印迹法结果显示转染后shRNA-U87和shRNA-U251细胞Sp1 mRMA和蛋白表达量均明显降低（P<0.01）,Sp1敲除率达90%以上。shRNA-U251和shRNA-U87细胞在10%细胞存活水平下的放射增敏比（SER）分别为1.39和1.18;两株Sp1敲除组细胞经辐照后G₂/M期比率及γ-H2AX foci数目与对照组相比均极显著增大。结论 shRNA沉默Sp1增大了X线诱导的G₂/M期阻滞,加重了DNA双链断裂程度,提高了胶质瘤细胞的放射敏感性。     

肾透明细胞癌组织SMO表达与肾癌细胞增殖和凋亡的相关性

目的 Hedgehog信号通路参与了肿瘤的发生发展,本研究探讨该通路关键信号分子Smoothened(SMO)在肾透明细胞癌中的表达及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 选取2012-01-01-2013-06-30青岛大学附属医院泌尿外科,行手术治疗的80例肾透明细胞癌患者的临床及病理资料,采用免疫组织化学方法检测SMO在肾透明细胞癌组织中的表达并分析其与临床病理特征间的关系.采用小干扰RNA下调SMO在人肾癌细胞786-O中的表达,分别应用CCK-8法、流式细胞术及蛋白质印迹法检测下调SMO表达对细胞增殖、凋亡及Gli1和Gli2表达的影响.结果 SMO在73例(91.25％)肾透明细胞癌组织中有表达,其在高级别肾癌中表达(80.49％)较低级别(56.41％)显著升高,x2 =5.39,P=0.02.RT-PCR 检测结果显示,SMO在人肾癌细胞系786-O中表达量为0.704±0.059;蛋白质印迹结果显示,SMO在786-O中表达量为0.651±0.074.在786-O细胞中应用小干扰RNA沉默SMO表达后,实验组细胞相较于对照组其活力百分比在48、72和96 h分别为92.7％、80.9％和79.9％,3个时间点差异有统计学意义(P=0.003),细胞凋亡显著增加,t=-29.2,P＜0.001;与空白对照组和阴性对照组相比,其下游分子Gli1和Gli2蛋白表达明显减少(Gli1:3.2 vs 2.9 vs1;Gli2:2.5 vs 2.1vs 1).结论 SMO可能通过调控细胞增殖和凋亡,以及调节Gli蛋白表达参与了肾癌的发生发展.     

过度活化Notch1信号促进肾癌细胞增殖的机制研究

目的 研究Notch1信号过度活化对肾癌细胞增殖的影响及其可能的分子机制。方法 首先应用免疫组织化学法检测120例肾透明细胞癌患者的肿瘤组织中Notch1的表达水平,并结合患者的临床病理特征进行比较。然后在肾癌细胞系ACHN中开展体外的机制和功能研究。用Western blot检测Notch1过度活化对PI3K/Akt信号通路的调控。并进一步分析Notch1和PI3K/Akt信号通路对细胞增殖和细胞周期的影响。结果 120例肾透明细胞癌组织标本中,有64例高表达Notch1,占53.3%。Notch1在直径≥7cm的肿瘤中的表达强度要高于直径＜7cm的肿瘤(P = 0.005)。与局限期(TNM Ⅰ～Ⅱ)肾癌相比,进展期(TNM Ⅲ～Ⅳ期)肾癌有高表达Notch1的趋势(P = 0.062)。结论 肾癌细胞中过度活化的Notch1信号,通过上调PI3K/Akt信号通路的活性,加快了肿瘤细胞的增殖,进而促进肾癌的发生、发展。该发现提供了一种可能的肾透明细胞癌发生的新机制和潜在分子药靶。     

RMP基因沉默对肝癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响

目的:建立RMP(RPB5-mediating protein)基因沉默的稳定细胞株,研究RMP小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和迁移的抑制作用.方法:首先,体外合成3条RMP基因的siRNA,并转染到SMMC-7721细胞中,RT-PCR检测3条siRNA对RMP基因表达的抑制作用,筛选出最佳干扰序列;然后,pGPU6-Neo-RMP-484真核表达载体转染,G418筛选出稳定干扰RMP基因的细胞株,RT-PCR法检测该稳定细胞株中RMP基因的干扰效率,MTT法检测RMP-siRNA对SMMC-7721细胞增殖及细胞黏附能力的影响,划痕实验检测细胞迁移能力的变化.结果:利用RNA干扰技术成功建立了RMP基因下调的稳定细胞株,与SMMC-7721细胞对照组比较,其RMP mRNA表达水平下调了(83.67±2.56)%.稳定转染siRNA的细胞株细胞增殖受到抑制,增殖抑制率可达(74.33±0.58)%.稳定转染细胞株的细胞黏附能力有所增加,迁移率则相应降低.结论:成功筛选出了稳定转染RMP-siRNA重组载体的细胞株.pGPU6-Neo-RMP-484重组载体能有效抑制RMP基因在肝癌SMMC-7721细胞内的表达,可作为RMP分子机制研究的细胞模型.RMP基因的下调能有效抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖,使其黏附率增加,同时细胞的迁移率降低.     

shRNA沉默Sp1对胶质瘤细胞放射敏感性的影响北大核心CSCD

目的探讨下调Sp1基因表达对胶质瘤细胞放射敏感性的影响。方法设计并合成编码shRNA的寡核苷酸序列,克隆入LV3(H1/GFP&Puro)载体中构建重组体。然后重组慢病毒分别感染U251和U87细胞,嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株。荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测细胞中Sp1 mRNA和蛋白表达水平;克隆存活法检测细胞存活;流式法检测细胞周期;免疫荧光法检测DNA损伤程度。结果两株胶质瘤细胞在感染72 h后荧光显微镜观察Sp1慢病毒载体均高表达,RT-PCR和蛋白质印迹法结果显示转染后shRNA-U87和shRNA-U251细胞Sp1 mRMA和蛋白表达量均明显降低(P<0.01),Sp1敲除率达90%以上。shRNA-U251和shRNA-U87细胞在10%细胞存活水平下的放射增敏比(SER)分别为1.39和1.18;两株Sp1敲除组细胞经辐照后G2/M期比率及γ-H2AX foci数目与对照组相比均极显著增大。结论shRNA沉默Sp1增大了X线诱导的G2/M期阻滞,加重了DNA双链断裂程度,提高了胶质瘤细胞的放射敏感性。     

shRNA沉默HMGA2对食管癌ECA109细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨shRNA沉默HMGA2对食管癌ECA109细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并探究所涉及的相关机制.方法 构建针对人HMGA2基因的shRNA表达载体,瞬时转染至人食管癌细胞系ECA109中,24 h后应用蛋白免疫印迹法(WB)检测转染效率;应用MTT法比较转染后sh-HMGA2组与sh-NC组细胞增殖情况;应用流式细胞术检测HMGA2沉默对细胞凋亡的影响;应用Transwell测定评估HMGA2沉默对细胞迁移和侵袭能力的影响;应用WB检测HMGA2沉默对ECA109细胞内HMGA2、TGF-βRⅡ、Vimentin、Smad2、Smad3、磷酸化Smad2/3、E-cadherin、N-cadherin、Bax、Bcl-xl、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响.结果 与sh-NC组相比,sh-HM-GA2组中HMGA2的蛋白表达水平降低(P﹤0.05).MTT结果显示,与sh-NC组相比,sh-HMGA2组细胞增殖率明显降低(P﹤0.01).流式细胞术结果显示,与sh-NC组相比,sh-HMGA2组细胞凋亡率增加(P﹤0.05).Tran-swell测定结果显示,与sh-NC组相比,sh-HMGA2组中ECA109细胞迁移和侵袭数量均减少(P﹤0.05).WB结果显示,与sh-NC组相比,sh-HMGA2组细胞内Bax和E-cadherin表达水平增加,而Bcl-xl、Vimentin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、TGF-β、Smad2、Smad3、p-Smad2/3蛋白表达水平均降低(P﹤0.05).结论 shRNA沉默HMGA2基因通过下调Bcl-xl表达、上调Bax表达水平来抑制食管癌细胞系ECA109细胞增殖并促进细胞凋亡,并通过抑制MMP及上皮间质转化来抑制细胞迁移和侵袭,这一过程涉及TGF-β/Smad信号通路.