超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的探讨应用超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxid,SPIO）标记间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）的有效性、安全性及可靠性。方法分离、培养SD大鼠MSCs,通过流式细胞仪分析鉴定表面抗原CD34、CD44。选取第4代MSCs,在铁（Fe）浓度为25、50、75μg.ml-1和多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine,PLL,0.75μg.ml-1）的DMEM/F12培养液中,孵育48h,作为3个实验组。通过普鲁士蓝染色、流式细胞仪检测、台盼蓝染色及MTT细胞增殖活性检测SPIO,探讨不同SPIO浓度对MSCs标记效率、免疫学表型、细胞活性及增殖的影响。结果经Fe浓度为25、50、75μg.ml-1SPIO标记后,普鲁士蓝染色标记效率均在99%以上;3个实验组细胞表面均表达CD44,阳性细胞率为超过98%。与对照组相比,Fe浓度为25、50μg.ml-1的SPIO标记的MSCs活细胞比率均在96%左右,细胞增殖活性差异无统计学意义,而Fe浓度为75μg.ml-1时,活细胞比率约为93%,对细胞的增殖有明显的抑制作用（P〈0.05）。培养4周,细胞内检测不到SPIO。结论全骨髓直接贴壁法可以成功分离、培养MSCs。超顺磁性氧化铁在PLL介导下,能高效地标记MSC,且在合适的浓度范围不会影响MSCs的免疫学表型、细胞活性及增殖能力等生物学特性。细胞内的SPIO,大约在4周左右,即可被完全降解。     

SPIO标记下大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能及体外MR成像

【目的】探讨超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPIO）标记对骨髓间充质干细胞生物学特性和多向分化潜能的影响以及体外磁共振（MRI）成像的可行性,为移植干细胞活体MRI成像提供实验基础。【方法】采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）,采用25μg/mLSPIO联合0.75μg/mL多聚赖氨酸（PLL）标记BMSC,比较标记和未标记MSC细胞活力、增值、细胞周期、凋亡和成骨、成脂多向分化能力;应用1.5TMR对不同数量级细胞分别进行T1WI、T2WI和T2＊WI序列扫描。【结果】普鲁士兰染色显示SPIO（25μgFe/mL,48h）对细胞的标记率接近100%,细胞活力、增殖、周期和凋亡检测,均显示SPIO标记细胞与未标记细胞间无统计学差异（P〉0.05）;成骨、成脂诱导显示,BMSC和标记BMSC均具备成骨、成脂分化能力;对不同数量级的SPIO标记BMSC行MR扫描,T1WI、T2WI和T2＊WI能检测到的最小数量级细胞分别为2×10^4,1×10^4,0.5×10^4,呈低信号。【结论】25μg/mLSPIO联合0.75μg/mLPLL能有效标记BMSC,不影响BMSC的活力、增值、细胞周期、凋亡和多向分化能力,1.5TMR示踪标记细胞可行,与T1WI和T2WI序列相比,T2＊WI最敏感。     

大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO标记及检测

目的：研究大鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCS）的分离、培养、SPIO标记,SPIO对EPCS的标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响,为进一步的实验研究奠定基础。方法：SD大鼠体重120～150 g,采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠EPCS,采用25μg/ml SPIO对其标记,比较标记和未标记的EPCS。普鲁士蓝染色观察铁标记率,台盼蓝检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖力,Calcein-AM/PI染色检测细胞活性及细胞膜完整性,AO/PI染色检测细胞凋亡率。结果：分离培养EPCS 7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的铺路石样外观。普鲁士兰染色显示SPIO（25μg/ml,24 h）对细胞的标记率接近94%;比较SPIO标记及未标记的EPCS,细胞活力分别为（94.34±0.25）%和（95.33±0.31）%;MTT法检测两组间相比差异无统计意学义（P〉0.05）;Calcein-AM/PI染色检测细胞的活性和膜完整性,存活率分别为96%和97%;AO/PI染色两组细胞的凋亡率均为5%。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养。25μg/ml浓度的SPIO细胞标记率高,对细胞毒性小,且不影响EPCS的活力、增殖及凋亡。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究

目的:使用超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)对成肌细胞进行体外标记,探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响.方法: 常规方法进行成肌细胞培养,应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞,用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响,台盼蓝染色及JC-1观测SPIO对细胞活力的影响.结果: 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒,单纯SPIO标记有效率为50%,脂质体包被的SPIO标记有效率为100%,电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒.SPIO标记对细胞无毒性,不影响细胞的增殖及活性.结论: 脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒,可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究.     

超声辐照联合微泡增强介导SPIO标记ADSCs及细胞内铁蛋白表达

目的:探讨超声辐照联合微泡增强介导超顺磁氧化铁(SPIO)标记脂肪干细胞(ADSCs),及其对干细胞内铁蛋白表达的影响。方法:使用超声辐照干细胞+超声微泡+SPIO细胞悬液标记ADSCs,使用普鲁士蓝染色检测细胞的SPIO标记情况,台盼兰染色检测细胞活力,并使用Western-blot对ADSCs内的铁蛋白轻链(Fn-L)表达进行检测。结果:普鲁士蓝染色可见ADSCs铁染色呈阳性,在胞浆内可见蓝色颗粒;台盼兰染色检测细胞活力实验组与对照组差异无统计学意义(P>0.05),标记后的ADSCs内的Fn-L表达在标记后2 h即升高。结论:超声辐照联合微泡增强可以有效对ADSCs进行磁探针标记,标记后细胞内铁蛋白升高。     

超顺磁性纳米铁标记大鼠骨髓基质干细胞的实验研究

目的研究超顺磁性纳米铁粒子（superparamagnetic iron nanoparticle,SPIO）标记骨髓基质干细胞（bone mar-row stem cells,BMSCs）对其存活、增殖能力的影响,确定最佳标记浓度。方法分离、纯化4周龄SD大鼠的BM-SCs,分别用15、25、50 mg/L浓度的SPIO标记1×106个BMSCs分别作为实验组1、实验组2、实验组3,未做标记的BMSCs为对照组。用普鲁士蓝染色法和透射电镜鉴定SPIO-BMSCs的效率,台蓝染色法观察SPIO-BMSCs的存活,MTT比色法检测SPIO-BMSCs增殖活性。结果普鲁士蓝染色显示,随SPIO浓度的升高,标记的细胞染色程度逐渐加深。透射电镜检查显示细胞内含致密铁颗粒。实验组1的细胞增殖性与对照组差异无统计学意义（P〉0.05）,实验组2和实验组3与对照组相比,死亡细胞增多,细胞增殖性受到明显抑制（P〈0.05）。结论培养基SPIO浓度在15 mg/L时,SPIO对BMSCs标记效率较高,且不影响其存活、增殖。     

超顺磁性氧化铁标记脂肪干细胞移植入大鼠心脏后的活体磁共振示踪成像

目的 探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)标记脂肪干细胞(ADSCs)移植入大鼠心脏后的活体磁共振成像(MRI)示踪的可行性.方法 使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记ADSCs.采用普鲁士蓝染色及透射电镜观察细胞内铁颗粒,台盼兰染色检测细胞活力,并对标记的干细胞进行体外MRI成像.将经过SPIO标记的干细胞移植入正常大鼠心脏,使用MRI进行活体成像观察并与病理结果进行对照分析.结果 普鲁士蓝染色于ADSCs胞浆内可见蓝色颗粒,电镜检查见铁颗粒位于内涵体/溶酶体内;台盼兰染色检测细胞活力实验组与对照组差异无显著性(P>0.05);标记了SPIO的干细胞体外MRI成像时,实验组信号显著低于阴性对照组和空白对照组;标记后的干细胞移植到心脏后,MRI显示细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞.结论 MRI可以对移植入心脏的经SPIO标记的干细胞进行无创、动态的活体示踪成像,有助于了解移植细胞在体内的存活及迁徙情况.     

SPIO标记骨髓间充质干细胞移植入心肌梗死大鼠的示踪研究

目的探讨超顺磁性氧化铁微粒(SPIO)体外标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)及体内示踪移植入大鼠心肌梗死心脏的BMSCs的能力。方法使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记BMSCs。采用普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒,流式细胞术检测细胞活力,将经过SPIO标记的干细胞移植入心肌梗死大鼠心脏,应用1.5TMRI系统行磁标记干细胞成像。超声心动图检测各组心脏的左室射血分数(EF),左室舒张末期内径(LVIDd),左室收缩末期内径(LVIDs)及短轴缩短率(FS)。结果普鲁士蓝染色显示,SPIO标记的BMSCs细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,标记效率为(99.81±1.57)%;与正常未标记细胞相比较,细胞的活力差异无统计学意义(P0.05)。标记了SPIO的BMSCs体内MRI成像时显示,细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞。超声心动图显示,PBS组FS移植前后没有明显变化,BMSC组FS从移植前的(23.1±1.88)%上升到第1周的(31.28±4.15)%。BMSC组EF在移植前是(51.13±5.07)%,第1周时上升到(60.12±8.40)%。结论 SPIO能成功地标记BMSCs,且对BMSCs的活力无明显影响。BMSCs移植后能改善心梗大鼠的心功能。SPIO标记的BMSCs移植后在大鼠体内的分布、迁移过程可用MRI进行检测评价。     

体外纳米磁标记骨髓间充质干细胞生物学特性及其MR成像

目的 研究超顺磁性氧化铁粒子(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)体外标记兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及MR细胞成像示踪可行性.方法 从兔骨髓中分离培养MSCs,体外不同浓度SPIO联合硫酸鱼精蛋白标记,未标记细胞设为对照组.普鲁士蓝染色和电镜检查鉴定细胞内铁颗粒,台盼蓝染色检测细胞存活,MTF法测定细胞生长曲线的变化,磁标记MSCs转入成骨、成脂肪培养基中进行诱导培养后进行鉴定,应用1.5T MR梯度回波T2加权(GRE T2 *WI)扫描序列和自旋回波T2加权(SE T2WI)扫描序列对磁标记细胞成像示踪.结果 普鲁士蓝染色和电镜检查显示细胞质内含致密铁颗粒,磁标记对MSCs活性和增殖无统计学差异(P<0.05),标记细胞可正常成骨、成脂肪分化.GRE T2*WI序列和SE T2WI序列提示与未标记细胞信号强度(sI)相比,1×106(标记细胞)、5×105(标记细胞)SI均显著性下降(P<0.05),其中GRE T2*WI的信号强度衰减率(△SI)显著高于T2WI序列(P<0.05).在2个序列中1×106(标记细胞)△SI均高于5×105(标记细胞)△SI,但不具有显著性差异(P>0.05).结论 SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记MSCs,磁标记对细胞存活、增殖及潜在多向分化能力无影响.磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变.应用1.5T MR成像示踪标记细胞可行,以GRE T2*WI序列成像最为敏感.     

应用超顺磁性氧化铁纳米粒子标记神经干细胞及活体磁共振示踪的实验研究

目的 探索超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)标记神经干细胞体的方法及其检测手段,研究标记细胞移植后在活体上磁共振信号的改变。方法 分离培养新生鼠皮层神经干细胞,使用SPIO和多聚赖氨酸联合标记神经干细胞;将标记后的神经干细胞移植入Wistar大鼠脑内,应用不同的扫描序列对脑内移植的神经干细胞进行示踪。结果 体外标记的神经干细胞普鲁士蓝染色见细胞浆内有许多蓝染的铁颗粒,电镜检查表明SPIO颗粒存在于标记细胞的吞饮小泡及细胞基质内,标记后的细胞可正常分化。脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,以GREE序列信号改变最为明显。结论 超顺磁性氧化铁粒子可以用来标记神经干细胞,且对细胞增殖、分化无影响,SPIO颗粒存在于标记细胞的吞饮小泡及细胞基质内。标记后体内移植的神经干细胞可以在MR上产生明显的低信号改变。     

超顺磁性氧化铁对大鼠神经干细胞生物学活性的影响

目的 初步研究利用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓基质细胞来源的神经干细胞及其对细胞活力、增殖等生物学活性的影响,并确定最佳标记浓度.方法 无菌条件下取大鼠股骨骨髓,梯度密度离心法分离得到骨髓基质细胞.体外培养、诱导成神经干细胞,使用不同终浓度的(6.25、12.5、25、37.5、50μg/ml)Ferumoxides(超顺磁性氧化铁)标记神经干细胞,采用普鲁士蓝染色、MTT法、流式细胞仪、透射电镜等方法鉴定Ferumoxides标记神经干细胞的效率及对细胞活力、增殖等生物学特性的影响.结果 Ferumoxides可以高效率标记神经干细胞,标记效率在90%以上.普鲁士蓝染色显示标记的神经干细胞胞质内存在细小蓝色铁颗粒,细胞呈淡蓝至深蓝色,颜色的深浅与所加Ferumoxides的剂量成正相关.电镜结果显示标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡,主要集中在胞体上.当Ferumoxides终浓度高于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒在细胞内聚集成团块状,量较多,在一定程度上影响了细胞超微结构的观察;低于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒散布于细胞胞质内,并随着浓度的降低,Ferumoxides颗粒在胞质内分布越分散,量越少.MTT及流式细胞仪结果显示Ferumoxides终浓度大于25 μg/ml时则对细胞活力、增殖、凋亡有一定影响,小于等于25 μg/ml时对细胞活力、增殖无明显影响.结论 利用Ferumoxides在体外标记神经干细胞是一种可行的实验方案,其最佳终浓度为25 μg/ml.     

Superparamagnetic Iron Oxide Labeling of Spinal Cord Neural Stem Cells Genetically Modified by Nerve Growth Factor-β

This study established superparamagnetic iron oxide （SPIO）-labeled nerve growth fac-tor-β （NGF-β） gene-modified spinal cord-derived neural stem cells （NSCs）. The El4 rat embryonic spinal cord-derived NSCs were isolated and cultured. The cells of the third passage were transfected with plasmid pcDNA3-hNGFβ by using FuGENE HD transfection reagent. The expression of NGFβ was measured by immunocytochemistry and Western blotting. The positive clones were selected, allowed to proliferate and then labeled with SPIO, which was mediated by FuGENE HD transfection reagent. Prussian blue staining and transmission electron microscopy （TEM） were used to identify the SPIO particles in the cells. The distinctive markers for stem cells （nestin）, neuron （β-Ⅲ-tubulin）, oligodendrocyte （CNPase） and astrocyte （GFAP） were employed to evaluate the differentiation ability of the labeled cells. The immunocytochemistry and western blotting showed that NGF-β was expressed in spinal cord-derived NSCs. Prussian blue staining indicated that numerous blue-stained particles appeared in the cytoplasma of the labeled cells. TEM showed that SPIO particles were found in vacuolar structures of different sizes and the cytoplasma. The immunocytochemistry demonstrated that the labeled cells were nestin-positive. After differentiation, the cells expressed β-Ⅲ-tubulin, CNPase and GFAP. It was concluded that the SPIO-labeled NGF-β gene-modified spinal cord-derived NSC were successfully established, which are multipotent and capable of self-renewal.     

大鼠骨髓源神经干细胞的Sinerem体外标记及磁共振成像研究

目的 应用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)复合物标记大鼠骨髓源神经干细胞,初步评价磁共振成像活体示踪Sinerem标记干细胞的可行性.方法 分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞.将制备的Sinerem-PLL复合物以浓度Sinerem 200μg/ml和干细胞共孵育培养过夜.采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况;并对细胞增殖、凋亡检测评价.体内外以SE序列T2WI与T2*WI行4.7T磁共振干细胞成像.结果 该方法标记干细胞效率为95%以上,普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;该浓度时Sinerem对细胞的活性影响与未标记细胞相比差异无统计学意义(P＞0.05).标记后细胞体内外的T2WI与T2*WI信号强度明显降低.结论 利用Sinerem对比剂经PLL介导标记骨髓源神经干细胞高效易行,磁共振可用于活体示踪神经干细胞.     

Experimental Study of Cell Migration and Functional Differentiation of Transplanted Neural Stem Cells Co-labeled with Superparamagnetic Iron Oxide and Brdu in an Ischemic Rat Model

Objective To explore the migration of transplanted neural stem cells co-labeled with superparamagnetic iron oxide （SPIO） and bromodeoxyuridine （Brdu） using the 4.7T MR system and to study the cell differentiation with immuno-histochemical method in ischemic rats. Methods Rat neural stem cells （NSCs） co-labelled with SPIO mediated by poly-L-lysine and bromodeoxyuridine （BrdU） were transplanted into the unaffected side of rat brain with middle cerebral artery occlusion （MCAO）. At weeks 1, 2, 3, 4, 5, and 6 after MCAO, migration of the labelled cells was monitored by MRI. At week 6 the rats were killed and their brain tissue was cut according to the migration site of transplanted ceils indicated by MRI and subjected to Prussian blue staining and immunohistochemical staining to observe the migration and differentiation of the transplanted NSCs. Results Three weeks after transplantation, the linear hypointensity area derived from the migration of labelled NSCs was observed by MRI in the corpus callosum adjacent to the injection site. Six weeks after the transplantation, the linear hypointensity area was moved toward the midline along the corpus callosum. MRI findings were confirmed by Prussian blue staining and immunohistochemical staining of the specimen at week 6 after the transplantation. Flourescence co-labelled immunohistochemical methods demonstrated that the transplanted NSCs could differentiate into astrocytes and neurons. Conclusion MRI can monitor the migration of SPIO-labelled NSCs after transplantation in a dynamical and non-invasive manner. NSCs transplanted into ischemic rats can differentiate into astrocytes and neurons during the process of migration.     

SPIO标记兔BMSCs的生物学特性与体外MRI显像研究

目的采用超顺磁性氧化铁（SPIO）作为磁探针标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）,探讨不同浓度SPIO的磁标记效率及其对细胞活力的影响观察标记干细胞体外MR显像情况。方法采用含铁不同浓度（11.2μg/ml、22.4μg/ml、44.8μg/ml）的SPIO标记兔BMSCs,分别行普鲁士蓝染色和MTT比色法检测其标记效率和BMSCs增殖活性,同时观察不同浓度磁标记细胞组（1×106、1×105、1×104和1×103细胞数/ml）和对照组（1×106细胞数/ml）的T1WI、T2WI及T2·WI体外显像信号。结果 SPIO标记BMSCs中铁含量越高,其标记率越高,含铁浓度为22.4μg/ml时磁标记率达95%且对BMSCs生长活性无明显影响。三种MR序列信号变化随细胞浓度的增加,其信号变化越明显,但在相同细胞浓度下,T2·WI信号变化率最大（P〈0.05）。结论采用含铁浓度为22.4μg/ml的SPIO来标记BMSCs,其磁标记率和安全性均很高。T2·WI是体外示踪磁标记BMSCs最佳的MR成像序列。     

磁标记大鼠神经干细胞移植入脑缺血大鼠的磁共振示踪

[目的]使用菲立磁（Feridex）体外标记胎鼠神经干细胞（neural stem cells,NSCs）,并在移植脑缺血大鼠后进行活体MRI示踪观察。[方法]分离、培养大鼠胚胎源性神经干细胞,使用“Feridex-多聚赖氨酸复合物（FE-PLL）” ,标记神经干细胞,对标记细胞分别进行普鲁士蓝染色、电镜观察,将FE-PLL标记神经干细胞分别移植人脑缺血大鼠左右侧脑室内,活体移植后1、5、14d体内MRI示踪。[结果]菲立磁可以高效率地标记神经干细胞,普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记神经干细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示FE-PLL标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。MRI检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变。[结论]菲立磁可以用来体外标记神经干细胞,利用MRI技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。