神经营养因子受体亚细胞定位改变参与食管癌细胞上皮间质转化及放射抗性的形成

目的 探讨神经营养因子受体(NRAGE)亚细胞定位改变与人食管癌细胞上皮和间质转化及放射抗性形成的关系。方法 应用转化生长因子(TGF-β1)诱导人食管癌细胞TE13,建立上皮间质转化(EMT)模型细胞。以TE13细胞、EMT模型细胞、放射抗拒TE13R120细胞为研究对象,通过Real-time PCR和Western blot检测EMT标记物mRNA和蛋白表达,验证EMT模型的建立和TE13R120存在EMT样表型。Real-time PCR比较NRAGE在3组细胞中mRNA水平的表达情况,Western blot检测3组细胞中NRAGE总蛋白及胞质、胞核蛋白的表达。结果 TGF-β1诱导TE13细胞形态向间质型细胞转化,EMT标志物E-cadherin和Vimentin表达发生改变(t=13.56、-232.84,P<0.05),成功建立EMT模型细胞。放射抗拒TE13R120细胞中EMT标记物表现出与EMT模型细胞相似的趋势(t=15.84、-54.54,P<0.05)。NRAGE在EMT模型细胞、TE13R120细胞中的表达较TE13细胞明显上调,且均在细胞核内表达明显升高(t=-8.73、-5.62, P<0.05),而在细胞质中表达差异无统计学意义。NRAGE在EMT模型细胞和TE13R120细胞胞质、胞核中的表达差异均无统计学意义。结论 放射抗拒 TE13R120细胞存在EMT样表型,且其放射抗性的形成可能因EMT的发生参与了NRAGE亚细胞定位的改变而导致。     

放射抗拒性食管癌细胞系的建立及基因表达差异分析

目的观察食管癌细胞经射线反复照射后放射敏感性的变化，应用基因芯片技术分析放射抗拒性食管癌细胞基因表达变化。方法食管鳞状细胞癌细胞株TE13经反复γ射线照射（累积剂量120Cy），逐步筛选出具有放射抗拒性的细胞TE13R120。相差显微镜下观察TE13及TE13R120的形态学差异；应用细胞克隆形成实验，验证TE13及TE13R120两种细胞的不同放射敏感性，用流式细胞术检测它们的细胞周期分布特征；基因芯片分析两种细胞基因表达差异。结果TE13R120的细胞群体倍增时间为39．93h，长于亲代TE13（33．94h）。TE13及TE13R120的放射敏感性明显不同（仇值分别为1．63和2．85Gy，SF2值分别为0．55和0．64，Dq值分别为1．38和1．15Gy，n值分别为2．33和1．49）。两种细胞经4Gy放射线照射后，出现不同的细胞周期分布改变，12～48h TE13R120细胞周期变化不明显，而其亲代细胞TE13发生明显G1期阻滞。应用DNA芯片对2159个基因进行了筛选，TE13R120与TE13相比，上调基因96个，下调基因80个。结论新的食管癌细胞系TE13R120比其亲本对射线更加抗拒，并且在基因水平上发生明显变化。4Gy照射后12～48hTE13R120细胞周期变化不明显，而其亲代细胞TE13发生明显G1期阻滞。     

今又生联合h-R3对不同放射敏感性食管癌细胞的作用研究

目的探讨重组腺病毒-p53抗癌注射液（今又生）、重组人源化表皮生长因子受体单克隆抗体（h-R3）单独及联合应用对不同放射敏感性食管癌细胞的作用。方法用MTT法测定h—R3、今又生及两药联合对TE13及放射抗拒性细胞TE13R120的生长情况的影响；采用流式细胞术检测两种药物单独及联合作用对TE13、TE13R120细胞周期分布的影响及对Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果h-R3、今又生及联合用药组均对两种细胞增殖产生抑制作用，联合用药组对两种细胞的抑制作用高于h-R3单药组和今又生单药组，但差异均无统计学意义（P〉0.05）。h-R3与今又生同时作用后12h，对TE13细胞产生明显的G1期阻滞（P〈0.05），而对TE13R120可产生轻度的G1期阻滞。两药同时作用后12h，对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响不明显。结论h—R3与今又生联合应用对不同放射敏感性的食管癌细胞产生了增殖抑制作用，这种增殖抑制作用的发生可能与G1期阻滞有关，其具体机制有待于进一步研究。     

低剂量辐射诱导小鼠红细胞免疫及2,3-DPG、SOD适应性反应

笔者在本实验中用不同剂量⁶⁰Coγ射线照射人食管癌细胞系Eca-109,研究照射前后癌细胞的凋亡率的变化和检测凋亡相关基因p53、bcl-2和bax的表达,探讨放射诱导食管癌细胞凋亡的分子机理。     

~(60)Coγ射线诱导食管癌细胞凋亡的研究

笔者在本实验中用不同剂量60 Ｃｏγ射线照射人食管癌细胞系Ｅｃａ 10 9,研究照射前后癌细胞的凋亡率的变化和检测凋亡相关基因ｐ5 3、ｂｃｌ 2和ｂａｘ的表达 ,探讨放射诱导食管癌细胞凋亡的分子机理。一、材料和方法1 细胞培养 :人食管癌细胞系Ｅｃａ 10 9细胞由河南省肿瘤研究所提供。培养液为含 10 %新生牛血清及青霉素 (10 0Ｕ ｍｌ)和链霉素 (10 0 μｇ ｍｌ)的ＲＰＭＩ 16 40。细胞置于 37℃、5 %ＣＯ2 、饱和湿度的培养箱内培养 ,每隔 3ｄ传代 1次。2 照射处理 :在细胞呈指数生长期时 ,随机分为对照组和实验组 ,照射前 2 4ｈ更换培…     

阻断血管内皮生长因子表达对食管癌细胞放射敏感性的影响

目的 观察转染反义VEGF cDNA质粒和反义寡核苷酸后,TE-1食管癌细胞在体外的生长状况、VEGF表达水平及其放射敏感性的变化。方法 分别用反义VEGF cDNA质粒及空载体质粒和反义VEGF寡核苷酸经Lipofectamine^TM2000介导转染TE-1细胞,然后经γ射线照射。采用RT-PCR、Western blotting、流式细胞术、MTT法和克隆形成实验分别检测4组细胞照射前后VEGF基因的表达、凋亡率和细胞周期变化、细胞增殖情况以及转染细胞放射敏感性的变化。结果 将反义VEGF cDNA和反义寡核苷酸成功转入食管癌TE-1细胞后,VEGF表达水平明显降低,细胞增殖反应、细胞周期无明显变化,亦未见明显凋亡发生。照射后4组细胞增殖情况未见明显差异;反义组细胞凋亡率略有上升, 放射敏感性增加。结论 转染反义VEGF cDNA质粒和反义寡核苷酸可抑制食管癌TE-1细胞VEGF表达,联合放射线作用,对TE-1细胞的增殖无明显影响,而对其放射敏感性有增强作用。     

鼻咽癌细胞系CNE-2Z放射敏感性的异质性及其机理探讨

目的　进一步证实人鼻咽癌细胞系CNE 2Z确实存在着放射敏感性的异质性 ,并探讨其有关机理。方法　观察人鼻咽癌细胞系CNE 2Z亚克隆株H5和S1的裸鼠移植瘤放射敏感性的不同 ;用流式细胞仪、荧光显微镜、Western blot检测H5和S1凋亡能力的不同及凋亡相关蛋白表达的差异 ;用3H掺入法说明DNA合成抑制率与放射敏感性的不同 ;用RT PCR观察相关癌基因 (fas、p5 3)的表达与放射敏感性的关系。结果　鼻咽癌细胞系CNE 2Z中确实存在放射敏感性的异质性 ,H5、S1两种细胞的凋亡率都随着照射后时间的延长而增加 ,但H5比S1高且差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。两种细胞的DNA合成率于放射前无差别 ;照射后都较放射前受到抑制 (P <0 0 5 ) ,H5受抑制程度大 (P <0 0 5 )。H5与S1细胞fas、p5 3基因的表达差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论　本实验再次证实了鼻咽癌细胞系CNE 2Z确实存在放射敏感性异质性 ,并证实了其异质性的机理与细胞受射线照射后引起凋亡的能力不同有关、与DNA合成的抑制率成正相关、与癌基因fas、p5 3的表达无关。     

辐射相关基因芯片的制备及其在肺癌细胞中的应用

目的 寻找参与肺癌细胞辐射抗性的基因。方法构建辐射相关的基因芯片，初步筛选出在不同辐射敏感性肺癌细胞系中差异表达的基因。为了评价芯片结果的可靠性，我们对一些差异表达基因进行了RT-PCR验证。结果和辐射敏感的NCI-H446细胞相比，辐射抗性的A549中有18个基因有明显的改变，8个基因是上调，10个基因是下调。在照射后6h和24h，A549细胞中分别有22个基因(19个基因上调，3个下调)和26个基因(8个上调，18个下调)的差异表达；NCI-H446细胞中分别有17个基因(9个基因上调，8个下调)和18个基因(6个上调，12个下调)差异表达。从这些基因中，我们发现一些参与细胞增殖和抗凋亡的基因，在照射后的A549细胞中是增高的，而在NCI-H446细胞中是降低的。另外一些参与DNA修复的基因，在A549中比在NCI-H446细胞中有更高的表达。结论一些参与细胞DNA修复、细胞周期调控、细胞增殖和抗凋亡作用的基因可能有助于A549细胞辐射抗性的形成。     

神经纤毛蛋白1对非小细胞肺癌放射敏感性的影响

目的 探讨神经纤毛蛋白1 (neuropilin 1,NRP1)在不同种类非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的表达情况及其与肿瘤放射敏感性的关系.方法 通过Western blot技术检测不同来源的5种人NSCLC细胞系(H358、H460、H1299、A549、SK-MES-1)NRP1的基础表达水平,MTT方法检测经不同剂量X射线照射后肺癌细胞的存活情况,初步筛选5种细胞中辐射敏感和辐射抵抗的2种细胞;采用克隆形成实验及流式细胞术分别检测细胞存活分数及凋亡率的变化,分析2种肺癌细胞的放射敏感性,采用Western blot检测2种细胞受X射线作用后 NRP1 的表达变化,通过克隆形成实验检测靶向抑制NRP1对A549细胞放射敏感性的影响.结果 5种肿瘤细胞NRP1表达量由高到低依次为:A549>SK-MES-1>H358>H460>H1299;X射线对肿瘤细胞的抑制能力呈剂量依赖性增强,其抑制率由高到低依次为:H460>H1299>H358>SK-MES-1>A549,因此选取A549细胞和 H460细胞做后续研究.克隆形成实验显示,A549在2 Gy照射下的存活分数(SF₂)是0.887,而H460细胞为0.313.A549细胞受照后的凋亡率为对照组的122.54%,明显低于H460细胞的238.88%.辐射可以诱导A549细胞NRP1的表达上调达40%,同时靶向抑制NRP1则可以增强A549细胞的放射敏感性.结论 在NSCLC细胞中A549细胞具有较强的辐射抗性,且辐射抗性的形成与其NRP1表达上调有关.     

乙醛对大鼠HSC增殖以及胶原基因表达影响的实验研究

目的：研究乙醛对新分离的肝星状细胞（hepatic stelalate,cell,HSC）增殖、表达α1（Ⅰ）型胶原mRNA、IkB和NF-kB的影响，以探讨酒清性肝纤维化发病机理。方法：用链霉蛋白酶、胶原酶以及密度梯度分离培养大鼠肝星状细胞。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、原位杂交法、免疫细胞化学法、凝胶电泳迁移率法（EMSA）分别检测肝星状细胞的增殖、胶原合成、IkBα以及NF－kB的表达。结果：（1）成功分离出大鼠肝星状细胞。（2）乙模型刺激新分离培养的肝星状细胞后细胞明显增殖；乙醛刺激传一代肝星关细胞后，α1（Ⅰ）型胶原mRNA表达显著增加；IkBα表达明显下降；乙醛作用肝星状细胞后30min，NF－kB的表达即有增加，到120min时达最高值。结论：乙醛可以使静止的肝星状细胞活化，表现为增殖、α1（Ⅰ）型胶原mRNA合成、IkBα表达下降、NF-kB活性增加。     

食管癌放射抗拒关键基因及通路的生物信息学分析

目的 寻找食管癌放射抗拒关键分子及通路,从分子水平揭示食管癌放射抗拒发生机制。方法 从基因芯片公共数据库GEO中下载食管癌放射抗拒相关芯片数据（GSE61772,GSE61620）;进一步运用GEO2R进行差异基因分析,利用DAVID、String等分析软件对差异基因进行生物信息学分析。RT-PCR技术检测差异基因在不同放射敏感性细胞中表达差异。结果 两组芯片数据中共筛选出49个差异基因,这些基因参与生物学过程主要集中在调节多细胞生物合成、离子转运、DNA合成、代谢、调节细胞增殖等。差异基因涉及的主要生物学通路是Wnt信号通路。12个差异基因间存在相互作用关系,关键节点为CHN2。CHN2基因在不同放射敏感性食管癌细胞中表达未见明显差异。结论 包括CHN2在内的49个差异基因可能与食管癌放射抗拒发生相关, Wnt信号通路在其中具有重要作用。     

照射后不同p53基因状态胃癌细胞的G1期阻滞和凋亡

目的　评价抑癌基因ｐ５３（ 野生型ｐ５３） 对照射后人胃癌细胞系（ＢＧＣ８２３） 的Ｇ１ 期阻滞和凋亡的控制作用。方法　３ 种具有不同ｐ５３ 状态的人胃癌细胞系,即转染人野生型ｐ５３ 基因的ＢＧＣ８２３ｗｔｐ５３ 细胞、转染人突变型ｐ５３ 基因的ＢＧＣ８２３ｍｕｔｐ５３ 细胞和转染无ｐ５３ 基因的空载质粒的ＢＧＣ８２３ｖｅｃｔ 细胞,用流式细胞计分析细胞,４Ｇｙ 照射后０、８ 和２４ 小时后各细胞时相分布和凋亡的反应。结果　照射４Ｇｙ 后８ 小时和２４ 小时后的ＢＧＣ８２３ｗｔｐ５３ 细胞出现强烈的Ｇ１ 期阻滞（分别占原细胞总数的６７－９％ 和６１－１ ％） ,而ＢＧＣ８２３ｍｕｔｐ５３ 、ＢＧＣ８２３ｖｅｃｔ 细胞几乎没有Ｇ１ 期阻滞;照射４Ｇｙ 后８ 小时和２４ 小时后的ＢＧＣ８２３ｗｔｐ５３ 细胞出现明显的预示凋亡的亚Ｇ１ 峰,凋亡细胞比例分别达１３－０ ％ 和１５－３ ％ ;而ＢＧＣ８２３ｍｕｔｐ５３ 和ＢＧＣ８２３ｖｅｃｔ 细胞几乎没有出现亚Ｇ１ 峰和凋亡细胞比例都为零。结论　野生型ｐ５３ 基因具有促进照射后肿瘤细胞的Ｇ１ 期阻滞和凋亡作用,而ｐ５３ 变异和缺失则减低了肿瘤细胞对放射线的反应。     

宫颈癌细胞株和正常间质细胞株受X线照射后的辐射效应

目的用宫颈癌、正常血管内皮和正常成纤维细胞株体外模拟宫颈癌实质和间质组织,研究其受到不同剂量放射线照射后的辐射效应。方法采用宫颈腺癌细胞株HeLa,宫颈鳞癌细胞株SiHa、C33A、Caski,人脐静脉内皮细胞株ECV304,及小鼠成纤维细胞株NIH/3T3细胞,分别用6MV的X线（300cGy/min）照射6和10Gy,24和48h后收集细胞,行PI染色,流式细胞术检测凋亡率和细胞周期变化。结果细胞株受到照射后,C33A凋亡率最高,而SiHa凋亡率最低,其余细胞株（包括ECV304与NIH/3T3细胞）均介于两者之间;各宫颈癌细胞株及NIH/3T3照射10Gy后48h的凋亡率较6Gy稍高（P〉0.05）,而ECV304照射10Gy后48h的凋亡率（13.04%±1.08%）比照射6Gy（6.51%±0.61%）明显升高（P=0.001）;各细胞株受到不同剂量照射后,均表现出明显的G2/M期阻滞,且阻滞细胞百分比随照射剂量增加而增加;受到照射后一般在24-48hG2/M期阻滞细胞百分比最高。结论高剂量照射可以提高血管内皮细胞的凋亡率,并导致剂量依赖性的G2/M期阻滞,为预测宫颈癌的高剂量放疗提供理论依据。     

Time- and dose-dependent changes of intracellular cytokine and cytokine receptor profile of Ewing tumour subpopulations under the influence of ionizing radiation

PURPOSE: Cytokines and their corresponding cell surface receptors are involved in intercellular signalling pathways and in the radioresistance of normal and malignant cells. The aim was the characterization of the expression of intracellular cytokines, their receptors and apoptosis-associated markers under the influence of radiation. MATERIAL AND METHODS: Two Ewing tumours were characterized in vitro before and 4, 24 and 72 h after radiation with 5 and 10 Gy, and in vivo 4, 6 and 15 days after radiation with 5 and 30 Gy by five parameter flow cytometry. Direct fluorescence-conjugated antibodies directed against intracellular cytokines (interferon-gamma, tumour necrosis factor [TNF]-alpha, interleukin 1) and their receptors (CD119, CD120a, CD121a) were used. Annexin V and 7-amino-actinomycin D were used to identify radiation-induced apoptosis. RESULTS: Inter- and intra-individual heterogeneities were identified by the expression of cytokine receptors and the intracellular cytokine profile before radiation. Time- and dose-dependent up-regulation of the cytokines TNF-alpha and interleukin 1 were found in vitro. In vivo, an up-regulation of CD120a and CD121a was detectable on tumour cell subpopulations. For interferon-gamma and CD119, no changes were seen. CONCLUSIONS: The observed radiation-induced changes of cytokine and receptor profile are an indication for complex intercellular interactions in view of radioresistance-associated mechanisms between cell populations within one individual tumour. The observed heterogeneous response on radiation might have therapeutic implications for an individualized therapy based on combined radiation and cytokine modulation, defined by flow cytometric characterization of markers potentially informative for radioresistance.     

Dexamethasone-induced radioresistance occurring independent of human papilloma virus gene expression in cervical carcinoma cells

Background

Inactivation of p53 by binding to simian virus 40-T antigen (SV40-T) and human papilloma virus type 16 protein E6 (HPV 16 E6) in transfected human diploid fibroblasts causes enhanced radioresistance. The aim of this study was to investigate the role of HPV 18 E6 and E7 gene products with respect to radiosensitivity of two cervical carcinoma cell lines.

Materials and Methods

The two cervical carcinoma lines C4-1 and SW 756 were used in which treatment with dexamethasone allows to modulate expression levels of HPV 18 E6 and E7 genes: upregulation in C4-1, downregulation in SW 756. Effects of treatment with dexamethasone on plating efficiency and radiosensitivity were assessed using a clonogenic assay.

Results

Treatment with dexamethasone increased plating efficiency of the C4-1 cells, but did not affect plating efficiency of SW 756 cells. Treatment with dexamethasone induced enhanced radioresistance in both cell lines. Thus, in C4-1 cells the observed changes in radioresistance correlate to the enhancement in expression of HPV 18 genes E6/E7, whereas in SW 756, a reduced expression correlates negatively with the enhanced radioresistance.

Conclusions

In C4-1 and SW 756 cells, treatment with dexamethasone induces radioresistance, and changes in expression levels of HPV 18 genes E6 and E7 do not correlate with the changes in radiosensitivity. Dexamethasone-induced radioresistance has previously been observed in HeLa cells, another human cervical carcinoma cell line. This leads us to speculate that dexamethasone-induced radioresistance may be important in certain clinical situations, and that therefore, the phenomenon deserves further study.     

Dexamethasone-Induced Enhancement of Resistance to Ionizing Radiation and Chemotherapeutic Agents in Human Tumor Cells

BACKGROUND: Dexamethasone-induced changes in radioresistance have previously been observed by several authors. Here, we examined effects of dexamethasone on resistance to ionizing radiation in 10 additional human cell lines and strains, and on resistance to carboplatin and paclitaxel in 13 fresh tumor samples. MATERIAL AND METHODS: Eight human carcinoma cell lines, a glioblastoma cell line and a strain of normal human diploid fibroblasts were arbitrarily chosen for these in-vitro studies. Effects on radiosensitivity were assessed using a conventional colony formation assay. Effects on resistance to the drugs were investigated prospectively (ATP cell viability assay) using 13 fresh tumor samples from consecutive patients operated for ovarian cancer within the context of a Swiss nation-wide randomized prospective clinical trial (SAKK 45/94). RESULTS: Dexamethasone promoted proliferation of 1 of the cell lines without affecting radiosensitivity, while it completely inhibited proliferation of another cell line (effects on radiosensitivity could thus not be examined). Furthermore, dexamethasone induced enhanced radioresistance in 1 of the 8 carcinoma cell lines examined. In the glioblastoma cell line, there was no effect on growth or radioresistance, nor in the fibroblasts. Treatment with dexamethasone enhanced resistance of the malignant cells to carboplatin in 4 of the 13 fresh tumor samples examined, while no enhancement in resistance to paclitaxel was observed. CONCLUSIONS: In agreement with previous reports, we found that dexamethasone may induce radioresistance in human carcinoma cells. Including the published data from the literature, dexamethasone induced enhancement in radioresistance in 4 of 12 carcinoma cell lines (33%), but not in 3 glioblastoma cell lines, nor in 3 fibroblast strains. Dexamethasone also induced enhanced resistance to carboplatin with a similar probability in fresh samples of ovarian cancer evaluated prospectively (in 4 of 13 samples; 31%). We worry that induction of resistance by corticosteroids given to patients undergoing either radiotherapy or chemotherapy with agents causing DNA damage might be associated with a reduced clinical responsiveness in a significant fraction of patients with a carcinoma.     

鼻咽癌放射抗拒相关的信号通路

目的 研究具有不同放射抗拒性的人鼻咽癌细胞株CNE-2R与CNE-2的基因表达谱差异,筛选与鼻咽癌放射抗拒相关的基因信号通路.方法 验证已构建的鼻咽癌放射抗拒细胞株CNE-2R的放射抗拒性,选用Human-6v3.0全基因组表达谱微珠芯片,筛选这2种细胞的差异表达基因.对差异基因进行生物信息学分析,寻找与鼻咽癌放射抗拒...     

5-脱氧氮杂胞苷逆转食管鳞癌细胞系p16基因转录表达研究

目的：探讨5种食管鳞癌细胞株中p16基因转录失活以及去甲基化药物对其作用的机制.方法：采用细胞培养、PCR、DHPLC、MSP、Northern印迹、MTT等方法,检测EC1,EC18,EC109,TE1,TE10食管鳞癌细胞株中p16基因的缺失、突变、甲基化状态和p16的转录表达,观察去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷对p16基因转录表达和细胞增殖能力的影响.结果：除了EC1,其余4种食管鳞癌细胞株均检测出p16基因的不同变化：纯合缺失（EC18）,纯合型甲基化（EC18,EC109）,杂合型甲基化（TE1,TE10）,且纯合缺失的发生率较低（20%）,甲基化的发生率较高（80%）,经过5-Aza-CdR处理,可见2株发生了杂合型甲基化的TE1和TE10细胞p16基因的转录表达得到了逆转.结论：不同食管鳞癌细胞株p16基因转录失活的原因是不同的,启动子区甲基化为主要原因,其中杂合型甲基化可以被去甲基化药物5-脱氧氮杂胞苷逆转,使p16的转录表达上调.