大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法的建立及鉴定

目的:大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外培养、纯化和鉴定.方法:新生1-3d大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定星型胶质细胞.结果:培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态且生长旺盛,第3代星形胶质细胞纯度达95％.结论:本研究建立的星形胶质细胞体外培养方法操作简单、可靠.     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法改良

目的建立大鼠大脑皮层星形胶质细胞(As)的培养方法,以进一步对大脑皮层As进行体外实验研究。方法在M cCarthy方法基础上改用出生后5 d的SD大鼠的大脑皮层,制备单细胞悬液后,接种于培养瓶,培养箱中1 h后换瓶,3 d后换液,细胞融合成单层后传代,传3代后采用间接免疫荧光法监测As特异性标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。阳性细胞确认为As。结果体外培养的大脑皮层As经历了贴壁、去除成纤维细胞、纯化和传3代,GFAP阳性细胞达95%以上。结论大脑皮层As体外培养成功,并有较高的纯度,为进一步进行As的研究创造了条件。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞的传代培养

目的：获得纯度较高的星形胶质细胞材料用于进一步实验。方法：采用大鼠神经胶质细胞的原代培养和传代培养方法。取生后24h以内Wistar大鼠脑皮层，用机械法和胰蛋白酶消化法分散细胞，制成细胞悬液，接种于无底物黏附培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。培养液为DMEM/F12混合培养液。待细胞铺满瓶底后传代，并对传代细胞进行形态观察、吖啶橙荧光染色和星形胶质细胞的免疫细胞化学鉴定。结果：通过传代得到了形态典型含量较高的星形胶质细胞。结论：在无底物黏附培养的条件下，星形胶质细胞在体外能够得到良好的生长，并被纯化。     

大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化培养

目的获取纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞，用于进一步实验。方法取新生大鼠大脑，用酶消化结合机械吹打方法分离皮质细胞制成细胞悬液，差速贴壁法去除成纤维细胞，培养融合时，恒温摇床振荡法去除少突胶质细胞、小胶质细胞等，纯化后，观察星形胶质细胞生长变化规律，并通过GFAP免疫细胞化学方法鉴定星形胶质细胞。结果大鼠脑皮质细胞接种后24h全部贴壁，部分细胞已伸出突起；3～5d时细胞增殖最明显，细胞数目增加，体积增大，突起相互交织成网状；原代培养7～10d时细胞基本融合并开始分层生长。振荡纯化处理后，GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可达98％。结论用差速贴壁和恒温振荡方法可获得高纯度皮质源性星形胶席细胸．     

小鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法的比较

目的：比较离体纯化和培养星形胶质细胞的不同方法,旨在获得高纯度的星形胶质细胞,为进一步研究奠定基础。方法：用原代培养、传代纯化和一次或两次振荡纯化的方法培养星形胶质细胞。结果：原代培养的星形胶质细胞纯度不高;经传代纯化培养后纯度达到99％以上,bystin表达量较少,且能经短时间模拟缺血诱导活性明显增高;经振荡纯化后bystin表达量明显增多,GFAP免疫荧光变亮,能耐受长时间模拟缺血,提示经振荡后星形胶质细胞已经处于“活化”阶段。结论：经过传代纯化的星形胶质细胞纯度最高,可以经模拟缺血诱导成反应性星形胶质细胞,因此能更好地反映其在脑中的功能,是研究星形胶质细胞在脑中的功能和反应性星形胶质细胞较好的培养方法。     

小鼠脑内星形胶质细胞体外培养方法的优化

目的： 优化小鼠脑内星形胶质细胞的体外培养方法,为星形胶质细胞的功能研究奠定实验基础。 方法： 取新生0～1 d的C57BL/6乳鼠大脑皮质,胰酶消化结合机械吹打方法,分离皮质细胞,制成细胞悬液并差速贴壁处理,待细胞接种24 h轻柔换液,以后每隔2～3 d换液,且每次换液前手动振荡洗涤2次,传代3次后,行胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫细胞化学染色及免疫荧光染色鉴定。 结果： 经过原代及传代培养,获得形态典型、纯度在95%以上的星形胶质细胞。结论： 优化后的体外培养星形胶质细胞方法,稳定有效,操作简便易行,并可获得高纯度的星形胶质细胞。     

大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法的改进

目的改进大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,获得纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞。方法取出生后1d内SD大鼠大脑皮质,用机械吹打法使细胞分散制成初细胞悬液,10μm尼龙膜过滤除去成纤维细胞后接种。待7d细胞铺满瓶底后,"十"字形震荡培养液5min后传代接种。传代2次后行GFAP免疫组化染色鉴定。结果通过微孔尼龙膜过滤和传代前"十"字形震荡培养液等操作可以得到形态典型、纯度较高的星形胶质细胞。通过纯度计算可得离体培养的星形胶质细胞的纯度平均值为95.49%(n=6)。结论改进的星形胶质细胞体外培养方法,降低了实验操作难度,方法稳定有效,得到的星形胶质细胞纯度较高。     

大鼠脑皮层星形胶质细胞培养与鉴定

目的：介绍一种新的脑组织星形胶质细胞培养方法，为进一步研究奠定基础。方法：常规分离纯化星形胶质细胞，将其低密度种植，维持在含10％新生牛血清DMEM培养基中培养，并在长时期内不给予更换或补加培养液。利用GFAP—FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果：经原代及传代培养，获得大量几乎为单一种类细胞，其特点为细胞突起细长、胞体明显缩小、形态多样，最后细胞突起之间相互连接形成星形胶质细胞网络，并在相当长的时间内保持不变。GFAP—FITC免疫荧光染色为强阳性。结论：在限制细胞种植密度和限制给予培养液的培养条件下星形胶质细胞的体外形态发育与在体的情形基本一致，提示该细胞培养方法可能有助于研究中枢神经系统中星形胶质细胞的生理功能。     

体外原代星形胶质细胞分离培养方法的优化

目的：通过对国内外原代培养星形胶质细胞的不同方法的比较运用,旨在优化现有的星形胶质细胞（AS）分离培养方法,建立稳定,高产的培养模式,为进一步研究奠定基础.方法：结合自有实验室条件采用优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法获取AS,进行形态学观察,绘制生长曲线,对培养的细胞进行GFAP免疫荧光鉴定.结果：体外培养的原代AS 7～10 d基本融合,胞体不规则,突起丰富如网状,生长曲线符合正常细胞生长特性;免疫荧光染色显示细胞纯度可达95％以上.结论：优化的胰蛋白酶消化组织块分离培养法对AS的培养更适宜自有实验室条件,可获得稳定纯度较高的AS,为中枢神经系统疾病相关研究提供了新的基础.     

两种体外培养星形胶质细胞的比较

目的 对2种常用培养方法得到的星形胶质细胞进行生物学功能上的比较分析。方法 用啮齿类新生儿大脑星形胶质细胞分离培养方法培养原代星形胶质细胞,用胎牛血清分化神经干细胞制备分化星形胶质细胞。显微镜下观察2种星形胶质细胞的细胞形态并用免疫荧光染色检测星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达量,10种细胞因子处理2种细胞后检测GFAP等的变化,用表达谱芯片检测GFAP、谷氨酸合成酶(GS)、转运蛋白(xCT)、神经调节蛋白-1(NRG)、谷氨酸受体蛋白(NMDA)、脂蛋白脂肪酶(LPL)等基因的表达并进行比较。结果 2种星形胶质细胞形态和GFAP表达量不同,表达谱芯片检测结果显示原代星形胶质细胞GFAP、GS、xCT、NRG、NMDA、LPL基因的表达均显著高于分化星形胶质细胞。10种细胞因子的处理均不能使原代星形胶质细胞GFAP表达升高,但转化生长因子-β(TGF-β)可以使分化的星形胶质细胞GFAP表达升高。结论 与分化的星形胶质细胞相比,原代培养的星形胶质细胞更类似于反应态星形胶质细胞,而TGF-β可促进分化细胞向反应态细胞过渡。     

水囊压迫大鼠脑组织致星形胶质细胞中胶质纤维酸性蛋白的变化

目的研究水囊压迫大鼠颅脑造成损伤后星形胶质细胞的反应。方法将改装后的5F漂浮导管球囊部位全部插入颅内硬膜外后,注射0．5ml无菌生理盐水人球囊使其扩张并维持压力2h。于伤后不同时间将大鼠处死,取脑组织进行HE染色和胶质纤维酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein,GFAP）免疫组化染色。结果伤后存活1h组,可见GFAP阳性细胞散在于损伤区周围,但突起较短,反应性星形胶质细胞主要局限于创缘周围。伤后存活24h组,GFAP表达的范围扩大,在创缘及其伤区周围的阳性细胞增多,胞体增大,突起增长,且染色加深。24h在海马组织中已有GFAP阳性细胞表达。伤后存活3d、6d和12d组,阳性细胞的表达继续维持在高水平,且细胞形态各异,胞体变化较大,在创缘出现突起少而粗短的GFAP阳性细胞,而在损伤区周围、海马以及脑干的区域阳性细胞突起粗大不规则,突起进一步增长,胞浆突起染色较深。12d时,GFAP阳性细胞增多达到高峰,阳性细胞着色深,呈深棕黄色。结论水囊压迫造成脑组织损伤后星形胶质细胞的标志性蛋白GFAP表达出现规律性变化,表明水囊压迫的损伤模型可以模拟颅脑血肿的损伤。     

SD大鼠脑皮质星形胶质细胞的纯化

目的 改进实验步骤获取符合体外研究使用的富含星形胶质细胞的培养物.方法无菌条件下取新生1天内的SD乳鼠的脑皮质,先机械吹打,然后以差速贴壁、摇床振荡以及传代的方法去处其他细胞,SABC法和免疫荧光双标方法GFAP鉴定纯度.结果成功获取星形胶质细胞比例>95%的培养物.结论上述方法可靠地获取了符合体外研究要求的培养物,免疫荧光双标方法较直观.     

人大脑及脑干挫伤后星形胶质细胞及其胶质纤维酸性蛋白的变化

目的探讨人大脑及脑干挫伤后星形胶质细胞(Ast)及其特殊标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)变化与损伤时间的关系,以及大脑与脑干挫伤后病变的差异。方法对87例闭合性颅脑损伤死亡者脑挫伤组织进行病理学及GFAP免疫组织化学检查。结果脑挫伤后Ast灶性肥大及增生最早见于伤后12h,7～14d达高峰,30d胶质瘢痕基本形成。在Ast4项图像分析指标中,平均细胞数在伤后首先下降然后逐渐增加,细胞平均吸光度值、积分吸光度值及细胞平均面积在脑挫伤后14d内随时间延长而逐渐增加,大脑与脑干之间Ast的上述4项指标在脑挫伤后均呈正相关关系,相关性由高至低为:平均细胞数>平均吸光度值>积分吸光度值>细胞平均面积。结论星形胶质细胞GFAP免疫组织化学检查结合图像分析技术可用于脑挫伤后经过时间的推断,大脑与脑干挫伤后星形胶质细胞GFAP变化趋势基本一致。     

慢性点燃癫痫形成中大鼠皮质胶质纤维酸性蛋白表达的变化

为探讨星形胶质细胞在戊四唑 ( pentylenetetrazol,PTZ)化学点燃癫痫形成过程中的作用 ,采用免疫组织化学方法和图像分析技术 ,对PTZ点燃各发作级别大鼠大脑皮质部位的胶质纤维酸性蛋白 (glialfibrillaryacidicprotein ,GFAP)的变化进行动态观察。发现 :GFAP值于点燃后Ⅲ级组开始增加 ,Ⅴ级组达到高峰。表明 :在戊四唑点燃癫痫模型中 ,随着点燃级别的进展 ,GFAP的免疫表达逐渐增加。提示 :星形胶质细胞GFAP含量的增加 ,可能是PTZ点燃模型癫痫发病的原因之一。     

大剂量甲基强的松龙对大鼠急性脊髓损伤后胶质纤维酸性蛋白的影响

目的：探讨大剂量甲基强的松龙（ＭＰＳ）治疗大鼠急性脊髓损伤（ＡＳＣＩ）后,胶质纤维酸性蛋白（ＧＦＡＰ）的变化。方法：４４只成年雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠,随机分成对照、损伤和治疗３组。采用Ａｌｅｎ打击法损伤脊髓。损伤组与治疗组于损伤后１５ｍｉｎ内尾静脉内推注ＭＰＳ３０ｍｇ／ｋｇ,以后２３ｈ内静滴ＭＰＳ５．４ｍｇ／ｋｇ·ｈ－１。各组动物分别于损伤后１、４、８ｄ处死,行ＧＦＡＰ单克隆抗体免疫细胞化学染色。结果：对照组大鼠应用ＭＰＳ后４ｄ,ＧＦＡＰ减少到８０％,８ｄ后减少到６３％。ＡＳＣＩ后,各组ＧＦＡＰ增加,治疗组与损伤组ＧＦＡＰ之比损伤后第１ｄ为８７．２％,第４ｄ为８８．６％,第８ｄ为９５．７％。结论：大剂量ＭＰＳ抑制未损伤大鼠ＧＦＡＰ的合成。对ＡＳＣＩ后,ＧＦＡＰ含量的增加也有一定的抑制作用。     

转化生长因子β1对体外大鼠星形胶质细胞形态及胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的:研究转化生长因子β1 ( TGF-β1) 对培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞形态及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响. 方法:体外培养的大鼠皮层星形胶质细胞随机分为对照组(无血清培养基培养)和实验组(分别含1, 2, 4 μg/L TGF-β1的无血清培养基培养). 培养24 h后,用相差显微镜观察星形胶质细胞的形态学变化,用RT-PCR和免疫印迹法检测GFAP mRNA和蛋白的表达. 结果:随着TGF-β1浓度的增加,细胞变形趋势越来越明显,GFAP mRNA和蛋白表达也随之增加. 结论:TGF-β1 能上调星形胶质细胞 GFAP的表达并且诱导细胞发生形态改变.