小鼠胚胎神经干细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法:分离孕13～15d的小鼠胚胎脑组织,在加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的B27无血清培养基中克隆培养,并用10%的胎牛血清诱导其贴壁分化,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白(Nestin),β-微管蛋白(β-tublin),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对神经干细胞(NSCs)及其分化的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞可形成典型的神经球,并传代。细胞表达神经巢蛋白,并可诱导分化为神经细胞和神经胶质细胞。结论:小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下大量增殖,并且具有多向分化潜能。     

胚胎小鼠神经干细胞的培养和诱导分化

目的 探索体外培养和诱导分化胚胎小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法 .方法分离12.5 d ICR小鼠胚胎的大脑皮质,通过Accutase酶消化法和机械消化法,将组织消化成单个细胞,置于完全培养基中培养,3d后神经干细胞增殖成神经球;将传代的神经球消化,通过诱导培养基诱导其分化;采用细胞免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测巢蛋白(Nestin)、中间微管相关蛋白2(Map2)和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)的表达,鉴定NSCs、分化形成的神经元和星形胶质细胞.结果 NSCs能被Nestin特异性标记,诱导分化后的细胞可被Map2和Gfap抗体特异识别;qRT-PCR结果显示,诱导后Nestin的表达水平降低,而Map2和Gfap的表达水平升高.结论 通过Accutase酶消化法联合机械消化法分离小鼠胚胎脑皮质,进行体外培养,可获得具有自我更新能力和多向分化潜能的NSCs.     

不同生长因子对神经干细胞定向分化的影响

目的 研究神经干细胞（NSCs）分化为神经元和胶质细胞的影响因素,探讨各种生长因子对小鼠NSCs定向分化的影响。方法 以无血清培养法从E13-14d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs后,分别加入50 mg/L EGF、bFGF、IGF-1、NGF和PDGF处理,分析不同生长因子对NSCs定向分化的影响。结果 分离得到的细胞表现出NSCs的特性,能无限增殖,神经元微管相关蛋白和胶原纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组相比,各生长因子均可显著诱导NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,其中NGF的诱导NSCs分化为神经元的作用最强;IGF-1、NGF、PDGF均能明显诱导NSCs分化为星形胶质细胞。结论 几种生长因子均能促进NSCs分化,其中NGF诱导NSCs向神经元方向作用最强;而IGF-1、NGF和PDGF促进NSCs向星形胶质细胞分化的作用均较强。     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）的分离、培养、分化及鉴定的条件与方法。方法分离孕14～16dSD大鼠胚胎脑皮质及皮质下区域NSCs,无血清培养基（DMEM／F12,含bFGF、EGF、B27等）条件下培养,通过有限稀释法克隆、传代,含血清培养基诱导分化,免疫组织化学法鉴定NSCs及诱导分化后的细胞。结果体外培养的NSCs能稳定增殖成神经干细胞球并传代（nestin染色阳性）,经诱导可分化为神经元细胞（NSE染色阳性）、星形胶质细胞（GFAP染色阳性）和少突胶质细胞（CNP染色阳性）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可在体外大量培养出稳定增殖并具有多向分化潜能的大鼠胚胎NSCs,为进一步研究NSCs的生物特性及应用奠定了基础。     

BDNF对大鼠胚胎神经干细胞诱导分化的影响

【目的】脑源性神经营养因子（BDNF）对体外培养大鼠神经干细胞（NSCs）诱导分化的影响。【方法】体外克隆化培养获得的NSCs中分别加入不同浓度的BDNF,采用倒置光显微镜观察细胞克隆形成,透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化,免疫组化的方法检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。【结果】在倒置光显微镜下可见细胞接种后5 d形成小细胞球,7 d成为大小不等的细胞克隆。在电镜下可见具有典型的神经干细胞和神经胶质样细胞特征。经BDNF处理7 d后星形胶质样细胞增多,且突起的长度随浓度的增加逐渐延长,尤以40 ng/ml组突起最为显著（P〈0.05）。免疫细胞化学检测GFAP的阳性颗粒位于细胞浆中,经40 ng/mlBDNF诱导后阳性率可达86.1%,与对照组（13.1%）比较有显著性差异。【结论】BDNF可诱导神经干细胞分化为星形胶质细胞。     

缺氧对体外培养的鼠胚神经干细胞分化的影响

目的分离大鼠胚胎皮质神经干细胞（NSCs）进行体外培养,探讨缺氧对体外培养的鼠胚大脑皮质神经干细胞分化的影响。方法对孕14d（E14d）大鼠取鼠胚脑皮质用无血清培养技术分离培养神经干细胞,血清：培养基贴壁诱导分化。通过免疫细胞化学染色检测细胞分化情况;NSCs采用三气培养箱予以不同缺氧干预,缺氧培养后再用10％胎牛血清培养基进行贴壁分化,用MAP2免疫荧光染色检测缺氧对NSCs向神经元方向分化的影响。结果①大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;②缺氧干预实验中,5％O2组尤以72h组可诱导NSCs向神经元方向分化。结论从大鼠胚胎皮质可成功分离NSCs,缺氧可影响NSCs的分化,适度缺氧可诱导离体培养的大鼠脑皮质NSCs向神经元方向分化。     

大鼠神经干细胞体外培养的研究

目的：比较两种不同的分离培养方法对大鼠神经干细胞（NSCs）增殖的影响。方法：分离新生24小时内的SD大鼠脑组织细胞,采用无血清培养技术进行体外扩增培养,分别以机械吹打法和胰酶消化法两种方法进行扩增培养、传代。免疫细胞化学法对NSCs 及其分化后的细胞进行Nestin,NSE,GFAP,CNP的鉴定。结果:分离培养的细胞具有自我更新和增殖能力及Nestin 表达阳性,诱导后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。无论第一代或第二代比较,胰酶消化组NSCs 的增殖明显高于机械吹打组。结论:实验中分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs ,可诱导分化为终末神经细胞。在两种分离培养方法中,以胰酶消化法培养可获得更多的NSCs 。     

胚胎大鼠海马神经干细胞分离培养和分化

目的：研究胎鼠脑海马组织去掉的神经干细胞的分离、培养、增殖及分化特点。方法：采用无血清培养、单细胞克隆技术及免疫细胞化学方法，观察海马源性神经干细胞的体外扩增和贴壁分化情况。结果：从大鼠胚胎脑海马分离的细胞具有增殖能力，可以传代培养，子代细胞免疫组化显示神经巢蛋白(nestin)阳性。经含血清培养基培养，贴壁可分化为微管相关蛋白-2(MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞。结论：用本方法分离培养的细胞具有自我复制和多向分化的能力，是中枢神经系统的干细胞。     

新生大鼠神经干细胞的体外培养方法

目的 探讨新生sD大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)适宜的体外分离培养方法.方法 从出生1～3d的SD大鼠脑组织中分离NSCs,采用不同的接种密度、传代方法,在体外培养NSCs,观察细胞的生长情况.巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞化学法对NSCs进行鉴定.结果 培养的神经球Nestin表达阳性,血清诱导后可分化为NSE阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞,具有自我增殖和多向分化能力,是NSCs.当NSCs接种密度为1×106/mL时,细胞增殖速度快,神经球生成的数量多.传代的方法应视情况而定,传代时间为7d左右.结论 建立了简单、稳定的新生大鼠NSCs的体外培养方法,为进一步研究NSCs的生物学特征及组织移植奠定了基础.     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。     

组织块法体外培养人胚胎神经干细胞

目的：探讨体外分离、培养人胚胎脑组织神经干细胞的实用方法。方法：从人胚胎脑额叶皮层分离组织块，采用DMEM／F12＋N2无血清培养基，进行体外培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化后的其他细胞表型。结果：从人胚胎脑额叶皮层分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞中大部分为Nestin表达阳性的细胞。诱导分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论：用上述方法分离培养的细胞具有神经干细胞的特性，并表达Nestin蛋白，认为是神经干细胞。此方法是一种具有实用价值的体外培养人胚胎脑神经干细胞的技术。     

小鼠中脑神经干细胞体外培养方法的研究

目的改进小鼠中脑神经干细胞(NSCs)分离培养方法。方法分别采用机械法和酶消化法分离出生1～3d的小鼠中脑组织,在含体积分数为2%B27及20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养。采用巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、及神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色方法鉴定NSCs和分化细胞。结果在含bFGF及B27的DMEM/F12培养基中,可形成悬浮生长Nestin呈阳性的神经球。诱导分化的细胞可见GFAP或NSE免疫反应阳性细胞。机械法较酶消化法可获得较多的NSCs。结论在DMEM/F12培养基中添加2%B27及20ng/mL的bFGF可成功获得中脑NSCs,机械法为一种简便而有效的NSCs分离方法。     

胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞的培养及鉴定

目的:探讨胚胎大鼠腹侧中脑区域神经干细胞(neural stem cell,NSCs)的分离、培养、传代及鉴定的方法。方法:分离E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织,用机械吹打方法形成细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(ep i-derm al growth factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(fibrob last growth factor-basic,bFGF)、B27(B27 sup lem ent)的DMEM/F12(1∶1)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量来源相同的NSCs克隆球,并且进行B rdu和Nestin检测;然后取培养细胞诱导分化后行GFAP,NeuN,TH检测。结果:E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织细胞培养两周后可以形成较多的悬浮生长的神经球,经单细胞克隆和传代扩增后得到大量的同源细胞克隆球。经过B rdu和Nestin的免疫细胞化学检测90%以上的细胞呈阳性;诱导分化后细胞呈GFAP,NeuN阳性,少量细胞呈TH阳性。结论:从E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新的能力,是胚胎大鼠中枢神经系统的NSCs,并可以分化为TH阳性神经元。     

己烯雌酚对胎鼠海马神经干细胞增殖与分化的影响

目的:探讨己烯雌酚对胎鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的促增殖、分化作用及其机制。方法:取孕16天SD胎鼠海马NSCs培养,分别设空白对照组,己烯雌酚1×10-7 mol/L组、1×10-8 mol/L组、1×10-9 mol/L组,以及脑源性神经营养因子(BDNF)5×10-2 mg/L组;免疫荧光化学方法检测Nestin、神经元特异烯醇化酶及神经胶质酸性蛋白的表达,RT-PCR检测BDNF mRNA的含量。结果:不同剂量己烯雌酚处理各组神经球面积、积分光密度值、平均突起长度与平均突起数均增加,其中10-8 mol/L组海马NSC增殖与分化最明显,BDNF mRNA表达量亦最高(P<0.01)。结论:己烯雌酚对海马NSCs的增殖分化具有促进作用,且可能与上调BDNF的表达有关。