CD147RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞系生物学行为的影响

目的 研究针对CD147 RNA干扰对前列腺癌PC-3细胞系生物学行为的影响.方法 利用针对CD147 RNA干扰片段构建的表达载体转染PC-3细胞,获得稳定表达株.通过RT-PCR和Western blotting 鉴定后进行前列腺癌细胞侵袭力实验和动物实验.结果 RT-PCR和Western blotting结果表明干扰片段可以较好地封闭前列腺癌PC-3细胞CD147分子mRNA和蛋白表达水平;与转染空质粒组相比.CD147干扰组前列腺癌PC-3细胞侵袭力下降,荷瘤裸鼠成瘤力下降(P＜0.05),抑瘤率达32.82%.结论 KNA干扰封闭CD147基因能抑制前列腺癌细胞的侵袭力和成瘤力.有可能成为前列腺癌基因治疗的新途径.     

RNA干扰CD147稳定表达前列腺癌PC-3细胞株的建立

目的 为研究CD147分子在前列腺癌PC-3细胞中的生物学功能,通过RNA干扰(RNAi)技术建立稳定低表达CD147分子的前列腺癌PC-3细胞株.方法 利用脂质体2000将靶向CD147干扰质粒导入前列腺癌细胞中,干扰前列腺癌细胞中CD147分子的表达;有限稀释法获取单个细胞克隆,通过G418筛选出抗性克隆并利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和Western-blot免疫印迹法分别从转录水平和蛋白水平进行鉴定.结果 与转染pSilencer-Scramble对照质粒比较,转染pSilencer-CD147干扰质粒明显抑制CD147基因和蛋白表达水平(P<0.05).结论 靶向CD147的干涉载体能有效沉默PC-3细胞中CD147基因和蛋白的表达,通过G418筛选建立出稳定细胞株,为进一步研究CD147的功能打下基础.     

RNAi沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖的影响

目的 观察RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖能力的影响,探讨Smad4在前列腺癌恶性进展中的作用.方法 用半定量RT-PCR和Western blot方法检测LNCaP、PC-3、DU145以及ARCaP亚细胞系IF11、IA8等多种不同前列腺癌细胞Smad4 mRNA及蛋白表达的情况,筛选出Smad4基因阳性表达的细胞;针对Smad4基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),脂质体介导瞬时转染阳性表达Smad4的细胞,转染后48 h分别用RT-PCR和Western blot检测Smad4 mRNA及蛋白表达水平的变化,用MTT法检测沉默Smad4表达对细胞增殖的影响.结果 检测的5种前列腺癌细胞中仅LNCaP、PC-3、DU145 3种细胞表达Smad4 mRNA及蛋白;选择PC-3细胞做siRNA转染,与阴性对照序列组(siRNA-NC)相比,转染48 h后,转染SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3的3组PC-3细胞的Smad4 mRNA表达水平均显著下降,但仅有siRNA3组Smad4蛋白表达水平显著降低.转染SiRNA3沉默Smad4基因表达后PC-3细胞的体外增殖能力显著增强(P＜0.05).结论 不同前列腺癌细胞Smad4基因的表达存在差异,靶向siRNA下调Smad4的表达可增强前列腺癌细胞的增殖能力.     

RNA干扰PLK1基因诱导人前列腺癌细胞PC-3的凋亡研究

目的探讨质粒表达载体介导的RNA干扰抑制PLK1基因表达对人前列腺癌细胞PC-3增殖与凋亡的影响。方法构建靶向人PLK1基因的RNA干扰表达质粒（psh—PLK1）。将该干扰质粒转染到人前列腺癌细胞PC-3中，应用RT—PCR技术分析RNA干扰后各组细胞PLK1基因mRNA表达水平的变化。采用MTT法和细胞形态学分析检测PLK1基因表达受到抑制后PC-3细胞的增殖情况的变化，通过流式细胞分析技术以及PI染色技术进行对各组细胞进行细胞凋亡检测。结果RT—PCR结果显示，转染RNA干扰表达质粒（psh-PLK1）24h和48h后，实验组PC-3细胞较对照组的PLK1基因mRNA表达分别降低了74．6％和91．2％；转染了psh-PLK的PC-3细胞与对照组相比生长受到明显抑制（P〈0．05），而各对照组之间差异无显著性（P〉0．05）；流式细胞仪检测发现转染了psh-PLK1的PC-3细胞较对照组细胞产生了更强的细胞凋亡（39．2％），PI荧光染色可见实验组细胞呈现出典型的细胞凋亡形态学变化。结论RNA干扰PLK1基因能够有效地抑制PC-3细胞中PLK1基因的表达，从而抑制PC-3细胞的生长与增殖，并诱导PC-3细胞产生凋亡。     

低氧微环境下siRNA靶向沉默HIF 2α基因对前列腺癌PC 3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察体外低氧条件下缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)在人前列腺癌细胞PC-3中的表达情况,并研究siRNA沉默HIF-2α基因对前列腺癌PC-3细胞生长及凋亡的影响.方法 在体外培养的PC-3细胞中加入化学诱导剂CoCl2建立低氧模型,采用逆转录PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测CoCl2诱导HIF-2αmRNA和蛋白表达的时-效和量-效关系.合成HIF-2αsiRNA片段并转染前列腺癌PC-3细胞,采用RT-PCR及Western印迹法检测HIF-2αsiRNA对HIF-2α基因表达的影响,采用MTT法检测转染HIF-2αsiRNA后对PC-3细胞生长的抑制情况,采用流式细胞仪检测RNA干扰对PC-3细胞凋亡的影响.结果 (1)低氧可诱导PC-3细胞的HIF-2αmRNA表达,与常氧组比较,低氧12,24及48 h组的HIF-2αmRNA和蛋白表达量逐渐升高(P<0.05).100μmol/L的CoCl2作用48 h可作为最佳前列腺癌细胞PC-3低氧模型.(2)低氧+HIF-2αsiRNA干扰组的HIF-2αmRNA和蛋白表达水平明显低于低氧+阴性对照组和低氧组(P<0.05),而低氧+阴性对照组与低氧组的HIF-2αmRNA和蛋白表达水平无显著性差异(P>0.05).低氧+HIF-2αsiRNA干扰组细胞增殖受抑制、细胞凋亡增加(P<0.05),而常氧组、低氧组、低氧+阴性对照组细胞增殖活力和凋亡差别均无统计学意义(P>0.05).     

RNA干扰对体外培养HUVECs增殖和CD105表达的影响

目的 应用RNA干扰技术(RNAi)研究针对CD105的小片段RNA(siRNA)抑制CD105在体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中表达的情况,观察CD105沉默后对细胞生长的影响.方法 根据人的CD105 mRNA序列选择3个不同的靶位点,分别合成3条CD105 siRNA,并同时合成阴性对照和阳性对照siRNA.采用脂质体介导的基因法转染至体外培养的HUVECs中,采用RT-PCR检测各组细胞CD105表达水平,Western blot检测干扰前后CD105蛋白表达水平,并用MTT法检测人HUVECs的细胞活力.结果 RT-PCR和Western blot检测表明,3号CD105 siRNA能最有效沉默CD105的表达,转染后的HUVECs中CD105 mRNA水平和蛋白表达水平明显下降.MTT结果表明CD105的下调导致了HUVECs活力的下降.结论 特异性的siRNA可以下调HUVECs中CD105 mRNA及蛋白表达水平,减低细胞活力.也提示CD105可能对体外培养HUVECs的生长有促进作用,CD105可以作为治疗新生血管的靶点.     

RNA干扰Aurora-A基因对前列腺癌细胞株PC-3影响的研究

目的采用RNA干扰技术特异性阻断前列腺癌细胞PC-3中Aurora-A的表达,观察其对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法采用免疫组化方法检测Aurora-A在前列腺癌细胞中的表达。体外化学合成特异针对Aurora-A基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),以脂质体转染前列腺癌细胞系PC-3,荧光显微镜及流式细胞仪确定最佳转染效率。MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。RT-PCR和Western-blot检测Aurora-A mRNA和蛋白的表达。结果 Aurora-A蛋白主要表达于PC-3细胞胞浆中;脂质体的最佳转染效率高于90%;siR-NA1组24h、48h、72h细胞增殖抑制率分别为(0.377±0.035)%、(0.597±0.065)%、(0.749±0.061)%,与各组比较均有显著性差异;siRNA1组细胞凋亡率为(50.593±1.208)%,与各组比较均有显著性差异;RT-PCR检测siRNA1组Aurora-A mRNA相对值为(1.354±0.087),与各组比较均有显著性差异;Western-blot检测显示siRNA 1组蛋白表达量明显低于对照组。结论应用RNAi技术靶向沉默Aurora-A基因可以下调Aurora-A mRNA及蛋白的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

miR-1721靶向CD44抑制前列腺癌PC-3细胞增殖、侵袭和肿瘤干细胞形成的研究

目的 探讨miR-1721靶向抑制CD44的表达及对前列腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响。方法 构建CD44 mRNA 3′-非翻译区(3′-UTR)的荧光素酶报告载体系统,通过荧光素酶系统确定miR-1721对CD44 mRNA 3′-UTR的靶向关系;脂质体转染法将miR-1721模拟物转入前列腺癌PC-3细胞中,Western印迹法检测转染后CD44蛋白表达水平的改变;MTT法检测miR-1721mimics对PC-3细胞增殖能力的影响,Transwell小室法检测其对肿瘤细胞袭侵袭能力的影响;通过干细胞成球实验检测miR-1721mimics对前列腺癌干细胞样微球体形成的影响。结果 miR-1721能特异性地与CD44 mRNA 3′-UTR结合,抑制其荧光素酶的活性,干细胞标记基因CD44是miR-1721的靶基因。过表达miR-1721的PC-3细胞中CD44蛋白表达水平明显降低,可显著抑制PC-3细胞的侵袭能力,同时过表达CD44可负调控miR-1721对PC-3细胞增殖和侵袭能力的影响;干细胞成球实验证实,miR-1721能显著抑制前列腺癌细胞PC-3干细胞的微球体形成能力。结论 miR-1721通过靶向调控CD44的表达而抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭能力及干细胞的形成能力。     

沉默RALA基因表达对前列腺癌细胞的增殖、迁移及凋亡的影响

目的：利用小干扰RNA(siRNA)靶向RALA基因,使其表达受抑制后探讨对前列腺癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其可能的机制。方法：采用RT-PCR检测前列腺癌DU145、PC-3和LNCap细胞中RALA mRNA的表达水平。通过LipofectamineTM 2000将RALA-siRNA转染体位培养的DU145细胞株,采用MTT法检测RALA-siRNA对DU145细胞株增殖的影响;Transwell实验检测RALA-siRNA对DU145细胞株迁移能力的影响;流式细胞术检测RALA-siRNA对DU145细胞株凋亡影响。应用RTPCR及Western blot方法检测沉默RALA基因后DU145细胞株中RALA的表达水平。结果：RT-PCR检测结果提示DU145细胞株中RALA mRNA的表达水平高于PC-3、LNCap细胞株,其相对表达水平分别为（0.83±0.02）、（0.37±0.07）和（0.41±0.01）,差异均有统计学意义（P<0.05）。MTT检测结果显示,转染RALA-siRNA后DU145细胞株的增殖明显受抑制,与空白对照组及阴性对照组比较差异有统计学...     

siRNA特异性沉默ADP核糖基化因子6对前列腺癌PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的研究ADP核糖基化因子6（Arf6）对雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞株增殖、迁移和侵袭能力的影响并初步探讨 其可能的分子作用机制。方法设计合成3条针对不同靶向区域的Arf6特异性siRNA序列,转染细胞后通过real-time PCR和 蛋白质印迹法检测其对Arf6的干扰效果,筛选出干扰效果最佳的siRNA序列;通过噻唑盐（MTT）实验、划痕实验、及transwell 细胞迁移和侵袭实验观察siRNA干扰Arf6表达对PC-3细胞增殖、迁移和侵袭的影响;蛋白质印迹法检测AKT、p-AKT、ERK1/ 2、p-ERK1/2和Rac1蛋白表达水平的变化。结果与空白对照组相比,转染阴性对照序列对PC-3细胞内源性Arf6的mRNA和 蛋白表达水平无明显影响,3 条siRNA 序列均能抑制Arf6 的表达,其中siRNA-3 对PC-3 细胞Arf6 表达干扰效果最好,Arf6 mRNA和蛋白抑制率分别为（91.88±3.13）%和（86.37±0.57）%。siRNA-3干扰Arf6表达抑制PC-3细胞的增殖,且PC-3细胞体外 迁移距离和侵袭细胞数较空白和阴性对照组明显减少（P<0.05）。蛋白质印迹法检测发现转染siRNA-3的PC-3细胞p-ERK1/2 和Rac1表达水平明显降低,而AKT、p-AKT和ERK1/2表达水平较对照组差异无统计学意义。结论siRNA干扰Arf6表达可显 著抑制PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,其分子作用机制可能与p-ERK1/2和Rac1表达下调相关。     

RNA干扰抑制MGMT表达对人脑胶质瘤化疗的影响

目的应用小干扰RNA（siRNA）质粒载体抑制人脑胶质瘤T98细胞系中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基本的表达,了解其对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响。方法通过LipofectimineTM2000将针对MG-MT的siRNA质粒载体转入T98细胞中。采用实时定量PCR法测定MGMT mRNA的表达,Western blot测定MGMT蛋白的表达。MTT法测定转染前后T98细胞系对卡氮芥（BCNU）的敏感性变化。结果成功构建针对MGMT基因的siRNA质粒载体;质粒载体转染T98细胞后,对其MGMT mRNA的抑制率达87%,MGMT蛋白表达量明显减少,转染后的T98细胞对BCNU的敏感性增加,提高了约6倍。结论针对MGMT基因的siRNA质粒载体可以靶向抑制MGMT基因在T98细胞系中的表达,增加T98细胞对BCNU的敏感性。     

siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用

目的 研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子（VEGF）基因表达的影响。方法 利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VE F mRNA的siRNA．通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC7901细胞,设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照．用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪检测细胞周期的改变,RT—PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化．ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果 所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长,并使细胞周期阻滞于G0／G1期;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低,作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论 体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达。     

抑制CD147表达对Jurkat T淋巴细胞集落形成的影响

目的研究小干扰RNA抑制CD147基因对Jurkat T淋巴细胞集落形成的影响。方法将CD147特异的siRNA,经LipofectamineTM2000转染Jurkat细胞48 h后,用半定量RT-PCR检测CD147 mRNA水平的变化,Western blot和流式细胞术（FCM）分别检测总蛋白和细胞表面蛋白水平的变化。通过荧光倒置显微镜比较特异性抑制CD147表达后Jurkat细胞集落形成的变化。结果与对照组相比siRNA干扰组细胞CD147 mRNA和蛋白水平的表达均降低,抑制率分别为（38.57±1.55）%和（47.4±1.47）%,细胞表面CD147的平均荧光强度（MFI）下降（50.5±4.7）%（P〈0.05）。随着CD147被抑制,siRNA干扰组细胞集落形成明显少于对照组（P〈0.05）。结论通过siRNA能抑制Jurkat细胞CD147的表达,随着CD147表达下降细胞集落的形成减少,提示CD147可能在炎症细胞粘附聚集中起到一定作用。     

Gli1小分子干扰RNA对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究锌指转录因子Gli1小分子干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌PC-2细胞的增殖和凋亡的影响。方法:筛选出最佳的靶向Gli1siRNA转染人胰腺癌PC-2细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测抑制效果,四甲基偶氮唑蓝(MTT)和TUNEL+PI双染流式细胞检测Gli1被抑制后细胞增殖和细胞凋亡的情况。结果:Gli1siRNA能在mRNA和蛋白水平下调人胰腺癌细胞株PC-2中Gli1基因的表达,以转染72h时最显著。Gli1表达被抑制后,转染后72h时PC-2细胞生长受到明显抑制,凋亡细胞显著增多。结论:Gli1与胰腺癌细胞的生长和凋亡密切相关,抑制胰腺癌细胞中Gli1表达可抑制胰腺癌细胞生长,促进胰腺癌细胞凋亡。     

siRNA抑制人前列腺癌PC-3细胞株VEGF的表达及细胞增殖

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对PC-3人前列腺癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的抑制作用及抑制癌细胞增殖和诱导凋亡的作用。方法:体外合成特异性靶向人VEGF基因的siRNA，并转染到PC-3细胞中;RT-PCR和Western blotting检测siVEGF对VEGF基因和蛋白表达的抑制作用;MTT法检测siVEGF对癌细胞增殖抑制作用，流式细胞术检测siVEGF诱导细胞凋亡的作用。结果:转染siVEGF1和siVEGF2组VEGF mRNA 表达水平与空白对照组比较分别下调了60.32%和70.73%；VEGF蛋白表达水平与空白对照组比较明显受到抑制，最高抑制率达72％；转染阴性对照质粒组VEGF基因和蛋白表达水平都无明显改变。转染siVEGF1和siVEGF2的细胞增殖受到抑制，增殖抑制率分别为49.5%和55.3 %，细胞的凋亡率分别为33.9%和42.0%。结论:构建的siRNA VEGF能特异有效下调VEGF基因的表达,瞬时转染siRNA VEGF能有效抑制人前列腺癌细胞PC-3增殖并诱导其凋亡。     

Livin基因特异性siRNA对肝癌细胞增殖、转移的影响

目的 应用PNA干扰技术抑制人肝癌细胞株SMMC-7721中凋亡抑制因子livin表达,研究livin基因对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 构建针对hvin β基因的siRNA真核表达栽体pU-livinβ-siRNA,将其表达栽体经脂质体LipofectamineTM2000转染至肝癌细胞株SMMC-7721细胞,采用RT-PCR、Western blot方法检测转染后的SMMC-7721细胞中livin β基因的mRNA和蛋白质表达,了解转染效率.通过流式细胞仪分析细胞周期的分布,并应用Transwell侵袭小室模型观察转染后SMMC-7721细胞恶性生物学行为的变化.结果 在pU-livinβ-siRNA转染后的SMMC-7721细胞中,livinβ基因的mRNA和蛋白质表达显著下降(P＜0.05),细胞周期被阻滞在G1期,细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降.结论 通过RNAi技术阻断livin的表达,可抑制SMMC-7721细胞的生长、增殖、迁徙,提示Livin基因在肝癌的发生、发展过程中起重要作用.     

KNOCKDOWN OF SURVIVIN EXPRESSION BY SMALL INTERFERING RNA SUPPRESSES PROLIFERATION OF TWO HUMAN CANCER CELL LINES

SURVIVIN, a novel member of the inhibitor of ap-optosis protein ( IAP) family, is a bifunctionalprotein that regulates cell division and suppressescell apoptosis·Survivin is expressed in embryonic tissuesas well as in the majority of human cancers, but i…     

RNAi技术沉默K562细胞中c-myc基因的初步研究

目的 运用RNAi技术,设计针对c-myc的小干扰RNA(siRNA),研究其干扰效果。方法 针对c-mycmRNA的第1357靶位点设计siRNAs,经Lipofectamine^TM2000脂质体法转染K562细胞,进行RT-PCR、细胞计数和MTT法及流式细胞仪检测,观察其干扰效果。结果 转染组与阴性对照组和空白对照组相比,c-mycmRNA表达明显减弱,细胞计数和MTTD(λ)值均有显著降低,并有明显的凋亡率。结论 运用RNAi技术,可以有效地干扰c-myc的表达,并进一步诱导细胞凋亡。     

The inhibitory effects of siRNA expression vector on CXCR4 expression in prostate carcinoma cell lines

INTRODUCTION Ithasbeendemonstratedthatchemokinesandtheirreceptorsarecloselyrelatedtomalignantbehavior oftumorcells.Especially,thechemotaxiscausedby CXCR4anditsligandstromalcellderivedfactor1(SDF1)inthetumorcells,suchasleukemiacells,lungcarcinomacellsandovarycarcinomacells,isthe mostinteresting[13].Ithasalsobeenindicatedthat CXCR4isexpressedinmanykindsofnasopharyngeal carcinomacellsandprostatecarcinomacells[46].CXCR4andSDF1canalsobeexpressedsimultaneouslyinsome kindsoftumorcells.The…     

体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨体外RNA干扰抑制REG4基因表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响。方法应用实时定量PCR方法检测七株胃癌细胞株中REG4基因的mRNA表达。针对REG4基因设计三条小干扰RNA片段(siRNA1、siRNA2、siRNA3),瞬时转染高表达胃癌细胞株。用RT-PCR方法检测转染后REG4基因的mRNA表达水平、MTT法检测细胞增殖能力、AnnexinV-PI法检测细胞凋亡水平。结果以永生化正常胃粘膜细胞株GES-1作为参照。MKN-45和AGS胃癌细胞株中REG4表达水平升高200倍以上,遂选用AGS细胞进行RNA干扰。RT-PCR结果证实siRNA2、siRNA3均有干扰效果,尤以siRNA3效果明显。选用siRNA3干扰AGS细胞株,MTT实验结果证实干扰AGS后,细胞增殖受到明显抑制(P<0.05)。AnnexinV-PI实验结果显示细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论干扰REG4基因具有抑制胃癌细胞增殖、促进凋亡的作用,REG4基因可能成为胃癌基因靶向治疗的新靶点。