重组人骨形成蛋白-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对骨髓间充质干细胞增殖分化影响的实验研究

目的明确重组人骨形成蛋白(rhBMP)-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和分化的影响。方法在rhBMP-2纳米微球作用于BMSCs后,采用嗜银蛋白(AgNORs)染色法检测细胞的增殖状况;采用反转录PCR方法,观察细胞中骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA水平表达的改变以反映对细胞分化的影响,并与单纯rhBMP-2作用细胞后的结果进行比较。结果该纳米微球缓释系统能显著促进BMSCs的增殖以及细胞中骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA水平的表达,且均高于单纯rhBMP-2的作用。结论rhBMP-2纳米微球缓释系统促进BMSCs增殖以及向成骨细胞方向分化的作用强于单纯rhBMP-2的作用。     

bFGF聚乳酸纳米微球对兔成骨细胞增殖的影响

目的：观察碱性成纤维生长因子聚乳酸纳米微球缓释系统（bFGF—PLA—Ns）对体外培养的兔成骨细胞的增殖影响。方法：体外培养兔成骨细胞并鉴定,将bFGF—PLA—Ns和成骨细胞一起培养,采用MTr法检测微球对成骨细胞增殖状况的影响,免疫组化检测增殖细胞核抗原（PCNA）在成骨细胞中表达,并与单纯bFGF的作用进行比较。结果：bFGF—PLA—Ns具有良好的生物活性,能显著促进兔成骨细胞的增殖,其效应高于单纯施加bFGF的效应。结论：制备的bFGF—PLA—Ns比单纯的bFGF有更为显著的生物学效应,在骨创伤的治疗中有良好的前景。     

rhBMP-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对骨髓间充质干细胞的生物学效应

目的 制备rhBMP—2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统，检测其对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学效应。方法 采用改良的乳化溶液聚合法制备rhBMP—2纳米微球；采用MTT法检测微球对BMSCs的增殖状况的影响；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测细胞ALP活性以反映微球对其分化状况的影响，并与单纯rhBMP—2的作用进行比较。结果 该微球缓释系统有生物活性，能显著促进BMSCs的增殖及分化，并呈剂量依赖性。其效应高于单纯施加rhBMP—2的效应。结论 在组织工程技术中应用生长因子缓释系统的作用明显优于单纯生长因子的作用。     

rhBMP-2-mPEG-PLA纳米缓释微球缓释凝胶的制备及体外释放实验研究

目的制备一种改性后的rhBMP-2聚乳酸缓释纳米微球(rhBMP-2-mPEG-PLA-Ns),并研究其理化性能和体外释放研究,以用于将来的骨创伤修复。方法运用复乳法制备mPEG-PLA缓释微球,利用透射电子显微镜观察微球表面形态,激光粒度分布测试仪测试纳米微球粒径。采用ELISA法测定微球包封率及载药量,并选择动态透析释药法测定其体外释放率。结果微球表面光滑、圆整,纳米球体粒径均匀。纳米微球的粒径在45⁵0 nm,粒径分布范围较窄。包封率和载药量分别为(78.2±1.81)%和((2.24±0.24)×10-5)%,体外释放试验中,没有发现突释现象,24 h释放率为23.47%,微球在21 d后释放度达78.56%。结论 rhBMP-2-mPEG-PLA缓释纳米微球具备良好的理化特性和缓释效果,为后续药物在口腔方面的应用打下良好的基础。     

rhBMP-2及其纳米微球缓释系统对成骨细胞钙结节影响的实验研究

目的 :观察rhBMP 2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球缓释系统对成骨细胞钙结节的影响。方法 :培养诱导成骨细胞形成钙结节 ,并对其行特异性染色 ;在rhBMP 2纳米微球对钙结节作用后 ,采用扫描电镜观察其表面形态的改变 ,采用能谱仪分析比较其组成成分的改变。结果 :rhBMP 2纳米微球能明显促进钙结节形成 ,且rhBMP 2纳米微球作用后钙结节中钙磷含量显著高于单纯rhBMP 2组。结论 :rhBMP 2纳米微球缓释系统促进成骨的作用优于单纯rhBMP 2。     

包载 rhBMP-2和 SDF-1的双层纳米微球的构建及体外释药研究

目的：构建搭载基质细胞衍生因子1（SDF-1）和人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）的双层纳米微球缓释系统,研究其体外释药特性。方法：用“乳化-溶剂挥发法”制备聚乳酸／壳聚糖（PLA ／CS）双层纳米微球,通过正交试验获得最佳制备参数;动态光散射法测定纳米微球的粒径,电镜观察纳米微球的形态;在乳化过程中将 rhBMP-2和 SDF-1依次加入纳米微球中,计算其包封率和载药量,透析袋扩散法检测其体外缓释效果。结果：制备的双层纳米微球外形圆整,表面光滑,平均粒径为（542．33±14．38）nm,微球之间无粘连。rhBMP-2包封率为（82．41±1．05）％,载药量为（24．67±0．43）ng／mg;SDF-1包封率为（75．58±0．84）％,载药量为（22．63±0．41）ng／mg。药物释放持续至少30 d,呈“双相释放”。第30天时累计释放的 rhBMP-2和 SDF-1分别为72．85％和91．01％。结论：成功制备了包裹 SDF-1和 rhBMP-2的双层载药微球,形态良好,包封率较高,体外缓释效果较好。     

rhBMP2缓释微球对牙龈成纤维细胞的生物学作用

目的：观察甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(dex-GMA)载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP2)缓释微球(MPs)对体外培养的人牙龈成纤维细胞(GFCs)的生物学作用。方法：采用体外细胞培养技术,将rhBMP2缓释微球和GFCs一起培养,采用M1Tr法检测其对GFCs的增殖状况的影响;碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测细胞ALP活性以反映rhBME2缓释微球对其分化状况的影响,并与单纯rhBMP2的作用进行比较。结果：rhBMP2缓释微球具有良好的生物学活性,能显著促进的GFCs增殖及分化,并维持10d以上,其效应高于单纯施加rhBMP2的效应。结论：所制备的rhBMP2微球比单纯rhBMP2对GFCs有更为明显的生物学效应,可以达到对生长因子的有效缓释。     

rhBMP-2微球温敏型凝胶剂的药剂学特征及对人PDLCs增殖的影响

目的：观察rhBMP-2微球温敏型凝胶的药剂学特征及对人牙周膜细胞（PDLCs）增殖的影响。方法：采用W／O／W型乳化溶剂挥发法以聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）为材料制备空白微球,通过吸附法制备rhBMP-2载药微球。以单甲基聚乙二醇-羟基乙酸共聚物（MPEG—PLGA）为材料制备凝胶,采用夹心酶联免疫吸附法测定释药速度。采用四唑盐比色法（MTT）及酶动力学法测定细胞增殖和碱性磷酸酶活性。结果：rhBMP-2微球呈规则球形,表面多孔,粒径为（19．6±2.3）μm,微球凝胶剂相转变温度为36℃左右,微球凝胶剂体外释药曲线符合Higachi方程,28d的累积释放度为80％。rhBMP-2微球凝胶剂能明显促进牙周膜细胞的增殖和提高ALP活性,随时间推移在第10d时rhBMP微球凝胶促PDLCs生长的作用明显强于rhBMP溶液。结论：rhBMP-2微球温敏型凝胶剂具有明显的缓释特征,与溶液剂相比促进PDLCs增殖作用更持久。     

定量缓释rhBMP-2纳米微粒促进兔下颌骨牵张成骨的实验研究

目的:制备可定量缓释的rhBMP-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒缓释剂,进行体外释药特性研究,并在兔下颌骨牵张成骨中局部应用以促进成骨。方法:采用乳化溶液聚合法制备rhBMP-2纳米微粒注射剂。将18只新西兰大白兔随机分为2组,每组9只,建立兔下颌骨双侧牵张成骨动物模型。实验组自牵张期开始,于牵张间隙注射rhBMP-2纳米微粒连续10d,对照组注射等量不含rhBMP-2的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米乳液。牵张后固定期第1、3、6周,分别检测血清骨钙素含量和ALP活性,进行影像学、组织形态学观察,并对下颌骨新生骨进行生物力学和骨矿物密度检测。两组间均值比较采用t检验,以SPSS11.0软件包进行统计学分析。结果:电镜下rhBMP-2纳米微粒形态规整,rhBMP-2的包封率为78%。体外缓释试验表明,纳米微粒中rhBMP-2至少可以维持10d以上。在兔下颌骨牵张成骨中,应用rhBMP-2纳米微粒组的新骨形成速度、质量均高于对照组;固定后6周,实验组骨矿物密度平均为(0.719±0.004)g/cm2,对照组为(0.564±0.020)g/cm2,P<0.01;实验组下颌骨三点弯曲试验结果平均为(92.143±10.795)N/mm,对照组为(55.266±0.774)N/mm,P<0.05。结论:rhBMP-2聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒具有确定的缓释作用,能够有效维持rhBMP-2浓度及活性,延长rhBMP-2的作用时间,可作为注射性骨诱导制剂。局部应用rhBMP-2,可以促进下颌骨牵张成骨的成骨速度及质量。     

钛表面羟磷灰石/壳聚糖-转化生长因子-β1缓释微球复合涂层的制备及其对成骨细胞黏附与增殖的影响

目的 探讨在钛表面制备羟磷灰石（HA）/壳聚糖（CS）-转化生长因子-β1（TGF-β1）缓释微球复合涂层及其对成骨细胞黏附与增殖的影响。方法 通过物理-化学-生物改性联合方式制备HA/CS-TGF-β1 缓释微球复合涂层。运用扫描电镜（SEM）、X射线衍射仪（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）等分析涂层的形貌和物相;使用CCK-8及免疫荧光检测其对成骨细胞的细胞毒性及细胞黏附和增殖的影响。结果 成功制备HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层,该涂层制备具有超亲水性,体外释药稳定且时间长,成骨细胞在此复合涂层的钛片上生长无抑制,且对细胞的黏附与增殖具有促进作用。结论 HA/CS-TGF-β1缓释微球复合涂层在体外对于成骨细胞的黏附与早期增殖有明显的促进作用,具有良好的运用前景。     

rhBMP2纳米缓释系统的制备及其对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的：制备甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（dex-GMA）载重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP2）凝胶纳米微球（NPs）缓释系统,检测其理化及生物学特性.方法：采用改良乳化溶液聚合法,制备rhBMP2纳米微球（rhBMP2-dex-NPs）;观察其形态、粒径与稳定性,检测其载药、释药特征;采用体外细胞培养技术,将rhBMP2-dex-NPs和兔骨髓间充质干细胞一起培养,MTT法检测其对细胞增殖状况的影响,碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒检测细胞ALP活性,以反应rhBMp2-dex-NPs对其分化状况的影响,并与单纯rhBMP2的作用进行比较;实验按照培养液中所含成分不同分为4组：培养液中加入单纯rhBMP2（A组）、加入rhBMP2-dex-NPs（B组）、加入空白NPs（C组）和对照组（D组）,其中A、B 2组均分别按照rhBMP2的不同量设置100μg/L、200μg/L、400μg/L 3个浓度组,采用SPSS 10.0对结果进行统计学分析.结果：rhBMP2-dex-NPs大小均匀,粒径分析表明,80%的纳米球粒径在20nm左右,包封率高达83%,80%的rhBMP2在前12d释放;其具有良好的生物学活性,能显著促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和分化,效应高于单纯施加rhBMP2的效应（P＜0.01）.rhBMP2-dex-NPs与BMSCs共培养3d内,反应BMSCs增殖和分化的OD值与A组无显著差异（P＞0.05）,但显著高于C、D组（P＜0.01）;3d后,rhBMP2-dex-NPs对细胞增殖和分化的促进作用较单纯rhBMP2明显加快;5～7d后,A、B组差异具有显著性（P＜0.01）;12d左右,B组细胞仍然有较强的增殖与分化能力,与其他3组有非常显著差异（P＜0.001）,而此时A、C、D组间差异已无统计学意义（P＞0.05）.结论：所制备的rhBMP2-dex-NPs形态良好、包封率高,理化与生物学性能稳定,可以达到对生长因子的良好缓释,比单纯rhBMP2对BMSCs有更为明显的生物学效应,可以持续促进其增殖与分化达10d以上,在组织工程领域有着广阔的应用前景.     

rhBMP-2及rhbFGF对骨髓间充质干细胞增殖的长期效应的实验研究

目的：检测rhBMP-2和rhbFGE、单独、联合及序贯作用对兔骨髓间充质干细胞增殖的长期效应。方法：在细胞培养技术下，采用MTT法检测单独、联合及序贯施加rhBMP-2和rhbFGF后，兔骨髓间充质干细胞在第1，3，5，7及10天增殖的状况，并进行统计学分析。结果：rhBMP-2和rhbFGF均能长期显著地促进兔骨髓间充质干细胞的增殖，并呈剂量依赖性。两种生长因子联合作用的效应高于单独或序贯作用的效应。结论：不同生长因子的不同应用方式对骨髓间充质干细胞增殖的长期效应不同。     

rhBMP-7对大鼠成骨细胞增殖及分化能力的影响

目的研究重组人骨形态发生蛋白-7（recombinant human bone morphogenetic proteins,rhBMP-7）对大鼠成骨细胞增殖和分化能力的影响。方法从SD大鼠取材进行原代培养,经碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和矿化结节检测鉴定为成骨细胞后传代至第3代,接种至96孔培养板。分为A、B、C、D、E、F共6组,每组3个复孔,rhBMP-7浓度分别为0．000、0．500、1．000、5．000、10．000、50．000mg/L。应用四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法及PNPP偶氮法,分析不同浓度rhBMP-7作用72h后对大鼠成骨细胞增殖和ALP活性的影响,应用单因素方差分析和LSD法统计数据。结果作用72h后,6种浓度rhBMP-7对大鼠成骨细胞ALP活性促进作用的差异有统计学意义（F=11．840,P=0．000）,B组成骨细胞ALP活性高于A组,但差异无统计学意义（P=0．078）,C、D、E、F组大鼠成骨细胞ALP活性均高于A组（P值均为0．000）,rhBMP-7浓度为50．000mg／L时对ALP活性的影响最明显（P=0．000）。作用72h后6种浓度rhBMP-7对大鼠成骨细胞增殖影响的差异有统计学意义（F=2．726,P=0．026）;rhBMP-7能促进大鼠成骨细胞的增殖和分化,同A组（rhBMP-7浓度为0．000mg／L）相比,当rhBMP-7浓度为50．000mg／L时并作用至第3天时,大鼠成骨细胞增殖最显著（P=0．000）。结论一定剂量的rhBMP-7明显促进了大鼠成骨细胞的增殖和分化。     

重组人骨形成蛋白-2结合胶原膜在兔颅骨引导骨再生模型中的成骨效应研究

目的    探讨重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）与胶原膜靶向结合后在兔颅骨引导骨再生（GBR）模型中的成骨效应。方法    将20只普通级雌性健康新西兰大白兔随机分成2周组和6周组,每组10只。所有大白兔均制备颅骨GBR模型,在颅顶骨植入4个钛筒,分别盖rhBMP-2/CBD胶原膜（rhBMP-2/CBD胶原膜组）、rhBMP-2胶原膜（rhBMP-2胶原膜组）、胶原膜（胶原膜组）和不盖膜（空白组）。分别在2周和6周时处死各对应组的大白兔,取样制作硬组织切片和石蜡切片,染色后进行组织学观察。结果    2周时可见胶原膜阻挡了纤维组织的长入,4组钛筒上层均无新骨生成,其中rhBMP-2/CBD胶原膜组钛筒顶端毛细血管增生量明显较其余3组多。6周时可见rhBMP-2/CBD胶原膜组钛筒上层大量新骨生成,与来源于颅骨骨面的新骨界限明显,而其余3组钛筒顶端未见新骨生成。结论    rhBMP-2与胶原膜靶向结合可形成具有骨诱导性的胶原膜,缓释rhBMP-2使胶原膜下方大量新骨生成,表层成骨可阻止纤维组织的长入和防止植骨床的塌陷,使成骨速度加倍。     

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目的 探讨重组人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)与胶原膜靶向结合后在兔颅骨引导骨再生(GBR)模型中的成骨效应。方法 将20只普通级雌性健康新西兰大白兔随机分成2周组和6周组,每组10只。所有大白兔均制备颅骨GBR模型,在颅顶骨植入4个钛筒,分别盖rhBMP-2/CBD胶原膜(rhBMP-2/CBD胶原膜组)、rhBMP-2胶原膜(rhBMP-2胶原膜组)、胶原膜(胶原膜组)和不盖膜(空白组)。分别在2周和6周时处死各对应组的大白兔,取样制作硬组织切片和石蜡切片,染色后进行组织学观察。结果 2周时可见胶原膜阻挡了纤维组织的长入,4组钛筒上层均无新骨生成,其中rhBMP-2/CBD胶原膜组钛筒顶端毛细血管增生量明显较其余3组多。6周时可见rhBMP-2/CBD胶原膜组钛筒上层大量新骨生成,与来源于颅骨骨面的新骨界限明显,而其余3组钛筒顶端未见新骨生成。结论 rhBMP-2与胶原膜靶向结合可形成具有骨诱导性的胶原膜,缓释rh BMP-2使胶原膜下方大量新骨生成,表层成骨可阻止纤维组织的长入和防止植骨床的塌陷,使成骨速度加倍。     

rhBMP-2及rhbFGF对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶表达的影响

目的:检测rhBMP-2和rhbFGF单独、联合及序贯作用对兔骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶作用的长期效应。方法:在细胞培养技术下,采用碱性磷酸酶检测试剂盒检测单独、联合及序贯施加rhBMP-2和rhbFGF后,兔骨髓间充质干细胞在第2、5、7及10天时碱性磷酸酶的活性水平,以反映对细胞分化作用的影响,并进行统计学分析。结果:rhBMP-2能长期显著地促进细胞的碱性磷酸酶活性,而rhbFGF则起到抑制作用,且均呈剂量依赖性。rhBMP-2单独作用与2种生长因子联合作用的效应相近,且均高于rhbFGF单独作用或2种因子序贯作用的效应。结论:不同生长因子的不同应用方式.对骨髓间充质干细胞分化作用的长期效应不同。