pmCherry-N1-WWOX真核表达载体的构建及其在胆管癌细胞QBC939中的表达

目的 构建人脆性位点抑癌基因WWOX真核表达载体,并观察其在人胆管癌细胞株QBC939中的表达.方法 通过全基因合成的WWOX cDNA为模版,用PCR技术扩增,将扩增片段连接到PUC57质粒,构建克隆载体,鉴定出阳性克隆后用 DNA测序法鉴定重组质粒.将克隆载体与pmCherry-N1同时用Xho I/BamH I双...     

线粒体融合素基因-2对肝癌细胞Caspase蛋白表达的影响及意义

目的研究外源性线粒体融合素基因-2（mitofusin-2 gene,mfn2）对肝癌细胞Caspase蛋白表达的影响及意义。方法用脂质体2000将质粒pEGFPmfn2、空质粒pEGFP-N2分别转染肝癌细胞株HepG2,分别检测转染后48h HepG2细胞mfn2 mRNA的表达、蛋白表达及凋亡特异性蛋白酶Caspase3、Caspase 9及proCaspase 9蛋白表达的变化。结果经脂质体2000转染后,HepG2细胞基因组中存在有目的基因特异性片段,转染后细胞中有Mfn2蛋白表达;转染pEGFPmfn2组细胞中Caspase 3、Caspase 9表达明显增加（P〈0.05）,而proCaspase 9的表达明显减少（P〈0.05）。结论外源性mfn2基因转染可激活Caspase 3、Caspase 9,进而激活细胞凋亡信号通路,这可能是mfn2基因诱导肝癌细胞凋亡的可能机制。     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

pcDNA3.1载体对内参基因表达影响分析

目的:研究转染质粒pcDNA3.1对内参基因表达影响差别,为今后在采用pcDNA3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考.方法:选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcDNA3.1空载体质粒,转染后48 h提取细胞总RNA荧光定量PCR法比较内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphste dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)、18sRNA表达水平差异,提取细胞总蛋白,检测GAPDH、β-actin表达水平差异.结果:5种细胞在转染质粒pcDNA3.1后,内参基因转录和蛋白表达均出现不同程度的下降,其中以β-actin下降最为明显,GAPDH及18sRNA在转录水平下降幅度小,且下降程度接近.结论:pcDNA3.1质粒转染造成基因表达非特异性抑制,其中对管家基因β-actin影响较大,因此在应用pcDNA3.1来源载体进行基因功能分析时,不推荐使用β-actin作为内参基因.     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepal-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力.方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepal-6细胞.G418筛选阳性克隆(Hepal-6-MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT法检测Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepal-6细胞和Hepal-6-MAGE-1细胞接种于CA7BL/6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepal-6-MAGE-1细胞的致瘤能力.结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepal-6细胞,PT-PCR与Western bohting检测分别在Hepal-6-MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异.结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepal-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力.     

pcDNA3-MAGE-1真核表达载体的构建及其在Hepal-6细胞中的稳定表达

目的:构建真核表达载体,并在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中稳定表达,观察转染细胞的增殖能力和致瘤能力。方法:用PCR方法扩增SMMC-7721人肝癌细胞株MAGE-1全长序列,连接到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达pcDNA3-MAGE-1,脂质体法转染小鼠Hepa1-6细胞。G418筛选阳性克隆(Hepa1-6- MAGE-1),用RT-PCR和Western blotting检测阳性克隆中mRNA和蛋白质的表达;MTT 法检测Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞生长和增殖的变化;分别以Hepa1-6细胞和Hepa1-6- MAGE-1细胞接种于C57BL /6j小鼠右侧背部皮下,观察Hepa1-6- MAGE-1细胞的致瘤能力。结果:构建MAGE-1的真核表达载体转染Hepa1-6细胞,PT-PCR与Western boltting检测分别在Hepa1-6- MAGE-1细胞中检测到人MAGE-1基因的mNRA和蛋白质的表达,两组细胞增殖无统计学差异;两组各10只小鼠均皮下成瘤,且肿瘤大小没有明显差异。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3-MAGE-1,获得了稳定表达人MAGE-1基因的小鼠肝癌Hepa1-6细胞株,并具有很好的增殖和致瘤能力。     

白介素1受体相关激酶4重组过表达质粒pcDNA3.1-IRAK4的构建及转染

目的构建重组过表达质粒pc DNA3.1-IRAK4并检验其在H9c2细胞中的表达。方法在全球科学家质粒共享非盈利组织Addgene申请到p DONR223-IRAK4质粒菌种,摇菌提取质粒后测序。设计引物将目的片段扩增并跑胶回收。将目的片段PCR扩增产物和空质粒pc DNA3.1采用Bam HⅠ和EcoRⅠ酶切,构建重组表达质粒。将重组质粒使用两种转染试剂转染入H9c2细胞中,并借助Western blot法检测IRAK4蛋白在H9c2细胞中的表达。结果重组过表达质粒经菌落PCR、序列测定证实,扩增基因片段IRAK4与基因数据库中序列一致,并且含有终止密码子。转染入H9c2细胞中能够过表达,表明IRAK4重组过表达质粒构建成功。结论成功构建IRAK4基因过表达重组质粒,获得外源性IRAK4转染的H9c2细胞。     

RNA干扰对胆囊癌细胞上皮细胞黏附因子表达的影响

目的:观察RNA干扰(RNAi)对胆囊癌GBC-SD细胞株中上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EP-CAM)表达的抑制作用。方法:针对EP-CAM基因的不同位点构建4个miRNA重组质粒。经DNA测序后,用LipofectamineTM2000介导转染人胆囊癌GBC-SD细胞株,48 h后用RT-PCR和Western blot检测EP-CAM的mRNA和蛋白的表达变化情况。结果:经测序分析证实,靶向EP-CAM的4个miRNA重组质粒均构建成功。RT-PCR及Western Blot技术显示,4个重组质粒均不同程度地抑制靶基因EP-CAM的表达。结论:针对人EP-CAM基因的miRNA表达载体能有效地下调GBC-SD细胞中EP-CAMmRNA及蛋白的表达。     

MafA基因重组腺病毒的构建及其对小鼠肝癌细胞的影响

目的利用AdEasy-1系统构建胰岛素转录因子之一的MafA基因重组腺病毒（Ad-MafA）,并观察其对小鼠肝癌细胞的影响。方法将质粒cDNA3/MafA扩增、酶切获得MafADNA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒（CMV）启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-MafA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-MafA,经293细胞包装后得到含MafA全长DNA片段的重组腺病毒AdMafA;将Ad-MafA体外感染小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）,以RT-PCR和Westernblot检测MafA在hepa1-6细胞的表达。结果连接、重组后通过酶切法筛选出pAd-MafA,经293细胞包装,5d后观察到绿色荧光蛋白（GFP）明显表达,通过反复感染HEK细胞扩增得到高滴度的重组腺病毒,Ad-MafA体外感染肝癌细胞1d后,MafA基因表达和蛋白表达明显增加。结论利用新型腺病毒载体AdEasy-1系统可在短期内制备同时表达GFP和MafA的重组腺病毒（Ad-MafA）,Ad-MafA体外感染小鼠肝癌细胞可显著提高MafA的表达,这将为基因治疗糖尿病提供新的手段。     

NOV基因对肾透明细胞癌细胞MMP表达的影响

目的 探讨肾母细胞瘤过表达基因(NOV)对肾透明细胞癌细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的影响.方法 构建NOV蛋白表达真核细胞重组表达质粒pEGFP-C1-NOV,转染人肾癌细胞株786-O.通过实时定量RT-PCR的方法定量转染pEGFP-C1-NOV细胞(实验组)、转染空载体细胞(空载组)和未转染的786-O细胞(空白组)的基质金属蛋白酶(MMP)亚型(包括MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13)的表达水平.方差分析法比较实验组与空载组及空白组各MMP亚型表达水平的差异.结果 实验组与空白组和空载组比较,MMP-1、MMP-3和MMP-13表达水平升高(P＜0.05),而MMP-2和MMP-7的表达水平下降(P＜0.05).实验组MMP-9的表达水平与空白组和空载组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 NOV可调节肾透明细胞癌细胞MMP的表达,NOV对MMP的调节可能是NOV发挥功能的机制之一.     

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞成瘤性的影响

目的:研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45成瘤性的影响。方法:采用半定量RT-PCR及Western免疫印迹法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性。结果:平板克隆形成实验显示转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞其细胞克隆形成数量高于转染空载体的细胞,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞其细胞克隆形成数量低于转染空载体的细胞。在裸鼠体内进行的转染细胞的成瘤性实验可见,转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞在裸鼠体内成瘤性高于转染空载体的细胞,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞在裸鼠体内成瘤性低于转染空载体的细胞。结论:胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞的成瘤性,GCRG213反义转染可抑制肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞的成瘤性。     

pcDNA3-TIMP-2的构建与表达

目的构建TIMP-2基因的真核表达载体pcDNA3-TIMP-2，并探讨其体外表达效果。方法应用已克隆得到的人TIMP-2基因和分子克隆技术构建pcDNA3-TIMP-2，酶切鉴定，并用体外培养人THP-1细胞，电穿孔转入pcDNA3-TIMP-2，RT-PCR和Western blotting分别检测外源基因转染效果，Zymography检测培养上清MMPs活性。结果构建pcDNA3-TIMP-2经酶切和测序鉴定正确，电穿孔法导入体外培养人THP-1细胞后，TIMP-2mRNA约增加2．8倍，TIMP-2蛋白表达增加约2．7倍，MMP-2和MMP．9的活性分别约为对照组的32％和28％。结论成功构建了pcDNA3-TIMP-2，且证实有良好的体外转染和表达效果，为进行转移TIMPs基因抑制MMPs及探讨其与动脉粥样硬化等多种病理过程的关系奠定基础。     

重组表达质粒pcDNA3/HIF-1α的构建及其在人肝癌细胞株HepG2的稳定表达

目的:构建缺氧诱导因子(HIF-1α)基因的表达质粒,经脂质体转染人肝癌细胞株HepG2,建立稳定表达HIF-1α基因的细胞模型,为肝癌研究提供有效工具。方法:采用RT-PCR方法扩增肝癌细胞株HepG2内HIF-1α基因功能区片段,克隆至真核表达载体pcDNA3上,转染HepG2细胞后,经G418筛选,建立稳定表达HIF-1α基因的细胞株,免疫荧光染色和Western-blot分析HIF-1α蛋白的表达。结果:通过酶切鉴定,凝胶电泳分析,两条带大小分别位于5.3kb和2.55kb,与预期结果符合,序列测定证实HIF-1α与GeneBank公布的序列一致。经脂质体包裹转染HepG2后,免疫荧光染色和Western-blot分析证实HIF-1α蛋白的表达明显上调。结论:经脂质体途径成功构建稳定表达HIF-1α的细胞模型,为肝癌研究提供了一个有效的工具。     

转染白喉毒素基因对人肺腺癌细胞的影响

目的　探讨白喉毒素A基因对人肺腺癌细胞 (A5 4 9)的影响。方法　对转染白喉毒素A基因的人肺腺癌细胞 (A5 4 9/DTA) ,转空载体的人肺腺癌细胞 (A5 4 9/DTA-)野生型A5 4 9细胞 ,采用MTT法测定四环素作用 72h后的细胞存活率。动物实验 :12只裸鼠随机分为转基因组、空载体组和对照组 ,每组 4只 ,将 1.2× 10 7A5 4 9/DTA细胞 ,A5 4 9/DTA-细胞及野生型A5 4 9细胞分别接种于相应的裸鼠皮下 ,给裸鼠饮含四环素(1μg/ml)的水 ,成瘤后 ,每周 2次测量瘤体大小 ,计算瘤体重量。 结果　A5 4 9/DTA细胞存活率较A5 4 9/DTA-细胞 ,A5 4 9细胞存活率明显下降 (P <0 .0 1) ,而A5 4 9/DTA-细胞与A5 4 9细胞存活率无差别 (P >0 .0 5 )。空载体组与对照组的裸鼠全部长出肿瘤 ,且肿瘤生长迅速 ,而转基因组有 1只裸鼠未长出肿瘤 ,肿瘤生长缓慢 ,前者瘤体的重量是后者的 3倍。结论　体外转染白喉毒素A基因可杀伤人肺腺癌细胞并降低人肺腺癌细胞的致瘤性。     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

真核表达载体pcDNA3.0-Cx43的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43(Cx43)cDNA的真核表达载体,转染骨髓基质干细胞,观察间隙连接蛋白Cx43在骨髓基质干细胞中的过量表达．方法：目的基因Cx43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3．0,转染大鼠骨髓基质干细胞,用G418筛选得到Cx43基因高表达的细胞;对照组为pcDNA3．0直接转染骨髓基质干细胞．结果：酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3．0-Cx43,经G418筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞,免疫细胞化学显示有Cx43蛋白的表达．结论：Cx43可以在骨髓基质干细胞中表达．     

pcDNA3.0/mbcl-2α真核表达载体的构建及其在L929细胞中的表达与实验研究

目的 构建重组真核表达载体pcDNA3．0／mbcl-2α，并在L929细胞中稳定表达，研究mbcl-2α基因表达对L929细胞生物学行为的影响。方法 用PCR法从含mbcl-2α基因的载体pORF-mbcl-2α获得目的基因片段，正向克隆入真核表达质粒pcDNA3．0中。pcDNA3．0／mbcl-2α以脂质体法转染L929细胞，经G418加压筛选，获得阳性单克隆细胞，用RT-PCR检测克隆细胞中mbcl-2α基因的转录，细胞免疫组化染色法检测蛋白表达。台盼兰拒染法进行活细胞计数，判定细胞增殖速率；MTT比色法测定化疗药物阿霉素对细胞生长的抑制率，并分析药物敏感性。结果 构建了重组真核表达载体pcDNA3．0／mbcl-2α，并在L929细胞中稳定表达，获得了可稳定表达mbcl-2α基因的L929细胞株。L929细胞转mbcl-2α基因后，其增殖速率高于对照组，而药物敏感性低于对照组。结论 pcDNA3．0／mbcl-2α在L929细胞中可稳定表达，对L929细胞的增殖和药物敏感性均具有一定的影响，为进一步研究mbcl-2α基因的生物学功能奠定了基础。     

pcDNA3/TCRγV1真核表达载体的构建及表达

目的：构建含TCRγV1基因的真核表达质粒并检测其存小鼠骨骼肌中的表达。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取RNA,用RT-PCR法扩增含BamH Ⅰ与Hind Ⅲ酶切位点的TCRγV1基因序列,将TCRγV1基因PCR产物插入pcDNA3后转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆酶切鉴定后测序分析。大量提取质粒,股四头肌注射法免疫小鼠,RT—PCR法检测小鼠肌肉巾TCRγV1 mRNA的表达。结果与结论：pcDNA3／TCRγV1重组质粒构建成功,并能在小鼠骨骼肌中表达。     

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体（EGFP）的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中，获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实，pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。